細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及其解決

不同之培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。。不能是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源所以的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，使。何謂FBSFCS,CSHSFBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛，F(xiàn)CS乃錯(cuò)誤的使用字眼，請(qǐng)不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛。HS(horseserum)則是指馬5%10CO2HCO3-/CO32-/H+pHNaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2NaHCO33.7g時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)10CO2NaHCO31.5g5CO2Hank's平衡鹽溶液(HBS)CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank's平衡鹽溶液(HBS)Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？HBSEBS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles(2.2g/L)Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2PH值。Eagles液在空氣水平的CO2中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中的組織，用Hanks液就可以了。養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。37C1注意安全，預(yù)防冷凍管之爆裂。細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO（包括懸浮性細(xì)胞10-15mlDMSO即可，如此可避免大部分細(xì)胞無法生長或貼附之問題。附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA一般使用之trypsin-EDTA0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin300xg1,000rpm)，5-10成細(xì)胞。510DMSO(dimethylsulfoxide)9095原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSODMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。DMSODMSO等級(jí)，必須為Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650)4°CDMSO之Nylon冷凍保存方法一:4C30~60分鐘→(-20C30分鐘*)80C16~18小時(shí)(或隔夜→液氮槽vaporphase長期冷凍保存方法二:1-3C至–80C以下，再放入液氮槽vaporphase長期。*-20°C不可超過1小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量，亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。1x106cells/mlvial5x106cells/mlvial、細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不、入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0mg/ml。支原體(mycoplasma)認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。CO2)4CpH4C冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果，將造成細(xì)胞生長停滯或。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無菌過濾之CO2，以調(diào)整pH值。各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask不同廠牌的dishflask，其所coating的polymer沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dishflask而有顯著之生長差異。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80°C太久。GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-IGlutaMAX-I二肽是一個(gè)L-alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I12120分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，培養(yǎng)基中酸鈉的作用是什么酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離室溫下配制的Tris-HCl37PHPH50mMTris-HC4℃，25℃，37℃時(shí)，不同PH值。50mMTris-HC4℃，25℃，37PH如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf92ml1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS2ml1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）375105養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。）在Sf9Sf21,和highFive如果超過95％的細(xì)胞保持有和在大約30小時(shí)左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果和加倍時(shí)間下降，它們的力將不在是有效的。這主要是由于在到周圍的CO2水平時(shí)，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松當(dāng)在無培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。蛋白大部分添加物和試劑最多可以凍融3次如果次數(shù)都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降建議無菌分裝至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。將從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在，也會(huì)存在于中，亦是造成沉淀物的原因之一。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的對(duì)細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥说馁|(zhì)量，環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的擴(kuò)增。