FISH技術(shù)及其臨床應(yīng)用課件

1熒光原位雜交技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

FISHmethodsanditsmedicalapplication1熒光原位雜交技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

FISHmethod一、熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH)60年代PardueGall建立（一）方法與原理：制備DNA探針（用生物素或熒光素標(biāo)記）（下圖）→變性﹢制備CS或間期細(xì)胞標(biāo)本→變性處理→探針與待測DNA雜交→洗脫→用熒光素標(biāo)記的生物素親和蛋白使雜交區(qū)發(fā)熒光（信號(hào)放大）(下圖）→熒光顯微鏡檢測2一、熒光原位雜交2（二）探針制備方法1.缺口平移法(Nicktranslatrion)用生物素（biotin)標(biāo)記dUTPDNA酶Ⅰ切口DNApolymeraseⅠ5`→3`外切酶活性DNApolymeraseⅠ5`→3`聚合酶活性3BdUTP（二）探針制備方法3BdUTP45`3`3`5`↓DNAseⅠ5`3`3`5`OHp↓﹢DNA聚合酶Ⅰ﹢標(biāo)記核苷酸GGC↓OHOHOHOHpBBGCUAUA5`3`3`5`5`3`3`5`45`3`3`5`↓DNAseⅠ5`3`3`5`OHp↓﹢D分子雜交與信號(hào)放大5BBB熒光素親和蛋白抗體探針待測基因CCGAGGCTGGCUCCGA(略）2.隨機(jī)引物法（randomprimer):6聚核苷酸klenow酶分子雜交與信號(hào)放大5BBB熒光素親和蛋白抗體探針待測基因CC66FISHProcedureDenaturethechromosomesDenaturetheprobeHybridizationFluorescencestainingExamineslidesorstoreinthedark7FISHProcedureDenaturethechr（三）探針種類1）探針池探針（cs涂抹探針）：可結(jié)合在整條CS上每一部位。24色（常CS22條＋XY）889Wholechromosomeprobes9Wholechromosomeprobes10Wholechromosomeprobes

10Wholechromosomeprobes11112）著絲粒探針：結(jié)合于著絲粒處，檢測間期核內(nèi)DNA數(shù)（CS數(shù)）1212131314Repetitivesequenceprobes14Repetitivesequenceprobes3）端粒探針：結(jié)合于端粒處153）端粒探針：結(jié)合于端粒處15164)特異位置探針

:cs某一具體位置探針例：Yq12repetitiveprobe164)特異位置探針:cs某一具體位置探針171718位點(diǎn)特異性探針18位點(diǎn)特異性探針5）染色體臂涂抹探針：結(jié)合于cs的q或p上。1919（四）探針標(biāo)記方法間接標(biāo)記（前述）時(shí)間長信號(hào)明顯直接標(biāo)記時(shí)間短信號(hào)弱20（四）探針標(biāo)記方法20二、FISH種類：以FISH過程中探針結(jié)合部位或探針顏色的不同，將FISH分為多種。2121221.CentromereSingleColorFISH221.CentromereSingleColorFI232.SingleColorFISH(Telomeres)232.SingleColorFISH(Telomer243.DualcolorFISH243.DualcolorFISH254多色熒光原位雜交254多色熒光原位雜交265.SpectralKaryotyping(SKY)（光譜核型分析）265.SpectralKaryotyping(SKY)276.24colorsFISH276.24colorsFISH287.M-FISH

withtelomeresandcentromeres287.M-FISHwithtelomeresand29M-FISHwithchromosomebandingspecificprobes29M-FISHwithchromosomebandi308.間期FISH308.間期FISH三、FISH優(yōu)點(diǎn)（Advantage）:lesslabor-intensivemethodforconfirmingthepresenceofaDNAsegmentwithinanentiregenomethanotherconventionalmethods31三、FISH優(yōu)點(diǎn)（Advantage）:lesslaFISH-aprocesswhichvividlypaintschromosomesorportionsofchromosomeswithfluorescentmoleculesidentifythepresenceandlocationofaregionofDNAwithinmorphologicallypreservedchromosomepreparations,thencanidentifieschromosomalabnormalitiesoftenusedduringMphasebutisnowusedoninterphaseaswell32FISH-aprocesswhichvividly四、FISH在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用舉例1、用已知探針檢測未知CS畸變33332、用顯微切割方法檢測未知CS畸變顯微切割→PCR→CS特異探針池(黃色熒光)→與正常人CS雜交(例:2號(hào)染色體某段發(fā)黃色熒光)結(jié)果？34343、產(chǎn)前診斷例:檢測間期細(xì)胞內(nèi)DNA分子數(shù)例：21三體例：18三體35354、植入前診斷36PreimplantationGeneticDiagnosis(PGD)36PreimplantationGeneticDiag37圖示1例13/14羅式易位攜帶者的胚胎植入前FISH診斷資料：一對(duì)6年不育，女，32歲，cs正常，男34歲，核型：45，XY,t(13;14)(q10;q10),并伴少、弱精。采用單精子卵泡漿（intracytoplasmicsperminjection,ICSI)輔助授精，胚胎發(fā)育到3天6-8細(xì)胞期取出一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行雙色FISH檢測。參圖：用13q和14q探針，見核中2個(gè)13號(hào)（綠色）和2個(gè)14號(hào)（紅色）信號(hào)細(xì)胞，表明？37圖示1例13/14羅式易位攜帶者的胚胎植入前FISH診斷38移植后18周做羊水細(xì)胞CS檢查38移植后18周做羊水細(xì)胞CS檢查39PGD39PGD5、腫瘤診斷

腫瘤診斷探針檢測間期細(xì)胞內(nèi)DNA分子數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)有癌基因擴(kuò)增404041腫瘤診斷41腫瘤診斷42慢性粒細(xì)胞白血病42慢性粒細(xì)胞白血病43慢性粒細(xì)胞白血病43慢性粒細(xì)胞白血病44慢性粒細(xì)胞白血病44慢性粒細(xì)胞白血病456.微小染色體畸變檢測456.微小染色體畸變檢測46Microdeletion46Microdeletion7.遺傳病診斷（圖）例1：家系1FISH結(jié)果用Xcs著絲粒探針（綠色）和DMDexon46探針(紅色）雜交。圖示DMD男患者FISH結(jié)果：只有Xcs著絲粒綠色信號(hào)，無DMDexon46紅色信號(hào)，說明？477.遺傳病診斷（圖）477.遺傳病診斷（圖）48

圖示：DMD男患者姐姐2條Xcs均有DMDExon46信號(hào)(紅色）。表明？7.遺傳病診斷（圖）48圖示：DMD男患者姐姐2條Xc7.遺傳病診斷（圖）49圖示：DMD男患者妹妹只有1條Xcs上有DMDExon46信號(hào)。表明？7.遺傳病診斷（圖）49圖示：DMD男患者妹妹只有1條X7.遺傳病診斷（圖）50例2：家系2FISH結(jié)果在DMD患者母親1/3淋巴細(xì)胞中僅有1條Xcs上有DMDExon46雜交信號(hào)，另一條上無。7.遺傳病診斷（圖）50例2：7.遺傳病診斷（圖）51圖示：在DMD患者母親2/3淋巴細(xì)胞中在2條Xcs上有DMDExon46雜交信號(hào)。A和B結(jié)果表明？7.遺傳病診斷（圖）51圖示：在DMD患者母親2/3淋巴7.遺傳病診斷（圖）52例3：圖示1復(fù)雜易位患者FISH結(jié)果（該患者致妻流產(chǎn)3次）核型：46，XY，t（5；20；16）(q35;p13;q21)三色FISH（5q綠色;16q橙色；20p藍(lán)色）結(jié)果參圖：a:5號(hào);b:衍生5號(hào);c:16號(hào);d:衍生16號(hào);e：20號(hào);f：衍生20號(hào).7.遺傳病診斷（圖）52例3：53例4FISH技術(shù)從母血中檢測胎兒有核紅細(xì)胞圖示：孕早期母血中胎兒有核紅細(xì)胞，可見YCS特異雜交信號(hào)。53例4FISH技術(shù)從母血中檢測胎兒有核紅細(xì)胞54例513q部分三體致斜頸、不對(duì)稱臉、右臉小，用13q探針檢測（黃色信號(hào)）。圖示：2條13號(hào)CS，另一13號(hào)接到1號(hào)短臂上。54例513q部分三體致斜頸、不對(duì)稱臉、右臉小，用13q探55圖示：該患者G帶核型55圖示：該患者G帶核型56例6白血病患者骨髓細(xì)胞雙色FISH

56例6白血病患者骨髓細(xì)胞雙色FISH8、基因定位(略)（參下頁圖)附:FISH試劑盒例子（參資料）575758IB665B376B12IB568D11S4170D11S1348D11S921D11S1322D11S935D11S4045D11S3969D11S1779D11S1330B344A5D11S4205IB3011D11S4172D11S1362AFM337TC5D11S4143D11S1886D11S1343D11S4078D11S1793D11S4129D11S4107D11S4089D11S4402D11S4094D11S4399B1005B31111.111.2111.2213.213.313.1242514.214.314.113.413.52112131415.115.215.315.415.5111222.322.222.123.223.123.3TheVisibleGeneticMapofHumanChromosome1158IB6651111.111.2111.2213.213.59熒光原位雜交技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

FISHmethodsanditsmedicalapplication1熒光原位雜交技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

FISHmethod一、熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH)60年代PardueGall建立（一）方法與原理：制備DNA探針（用生物素或熒光素標(biāo)記）（下圖）→變性﹢制備CS或間期細(xì)胞標(biāo)本→變性處理→探針與待測DNA雜交→洗脫→用熒光素標(biāo)記的生物素親和蛋白使雜交區(qū)發(fā)熒光（信號(hào)放大）(下圖）→熒光顯微鏡檢測60一、熒光原位雜交2（二）探針制備方法1.缺口平移法(Nicktranslatrion)用生物素（biotin)標(biāo)記dUTPDNA酶Ⅰ切口DNApolymeraseⅠ5`→3`外切酶活性DNApolymeraseⅠ5`→3`聚合酶活性61BdUTP（二）探針制備方法3BdUTP625`3`3`5`↓DNAseⅠ5`3`3`5`OHp↓﹢DNA聚合酶Ⅰ﹢標(biāo)記核苷酸GGC↓OHOHOHOHpBBGCUAUA5`3`3`5`5`3`3`5`45`3`3`5`↓DNAseⅠ5`3`3`5`OHp↓﹢D分子雜交與信號(hào)放大63BBB熒光素親和蛋白抗體探針待測基因CCGAGGCTGGCUCCGA(略）2.隨機(jī)引物法（randomprimer):6聚核苷酸klenow酶分子雜交與信號(hào)放大5BBB熒光素親和蛋白抗體探針待測基因CC646FISHProcedureDenaturethechromosomesDenaturetheprobeHybridizationFluorescencestainingExamineslidesorstoreinthedark65FISHProcedureDenaturethechr（三）探針種類1）探針池探針（cs涂抹探針）：可結(jié)合在整條CS上每一部位。24色（常CS22條＋XY）66867Wholechromosomeprobes9Wholechromosomeprobes68Wholechromosomeprobes

10Wholechromosomeprobes69112）著絲粒探針：結(jié)合于著絲粒處，檢測間期核內(nèi)DNA數(shù)（CS數(shù)）7012711372Repetitivesequenceprobes14Repetitivesequenceprobes3）端粒探針：結(jié)合于端粒處733）端粒探針：結(jié)合于端粒處15744)特異位置探針

:cs某一具體位置探針例：Yq12repetitiveprobe164)特異位置探針:cs某一具體位置探針751776位點(diǎn)特異性探針18位點(diǎn)特異性探針5）染色體臂涂抹探針：結(jié)合于cs的q或p上。7719（四）探針標(biāo)記方法間接標(biāo)記（前述）時(shí)間長信號(hào)明顯直接標(biāo)記時(shí)間短信號(hào)弱78（四）探針標(biāo)記方法20二、FISH種類：以FISH過程中探針結(jié)合部位或探針顏色的不同，將FISH分為多種。7921801.CentromereSingleColorFISH221.CentromereSingleColorFI812.SingleColorFISH(Telomeres)232.SingleColorFISH(Telomer823.DualcolorFISH243.DualcolorFISH834多色熒光原位雜交254多色熒光原位雜交845.SpectralKaryotyping(SKY)（光譜核型分析）265.SpectralKaryotyping(SKY)856.24colorsFISH276.24colorsFISH867.M-FISH

withtelomeresandcentromeres287.M-FISHwithtelomeresand87M-FISHwithchromosomebandingspecificprobes29M-FISHwithchromosomebandi888.間期FISH308.間期FISH三、FISH優(yōu)點(diǎn)（Advantage）:lesslabor-intensivemethodforconfirmingthepresenceofaDNAsegmentwithinanentiregenomethanotherconventionalmethods89三、FISH優(yōu)點(diǎn)（Advantage）:lesslaFISH-aprocesswhichvividlypaintschromosomesorportionsofchromosomeswithfluorescentmoleculesidentifythepresenceandlocationofaregionofDNAwithinmorphologicallypreservedchromosomepreparations,thencanidentifieschromosomalabnormalitiesoftenusedduringMphasebutisnowusedoninterphaseaswell90FISH-aprocesswhichvividly四、FISH在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用舉例1、用已知探針檢測未知CS畸變91332、用顯微切割方法檢測未知CS畸變顯微切割→PCR→CS特異探針池(黃色熒光)→與正常人CS雜交(例:2號(hào)染色體某段發(fā)黃色熒光)結(jié)果？92343、產(chǎn)前診斷例:檢測間期細(xì)胞內(nèi)DNA分子數(shù)例：21三體例：18三體93354、植入前診斷94PreimplantationGeneticDiagnosis(PGD)36PreimplantationGeneticDiag95圖示1例13/14羅式易位攜帶者的胚胎植入前FISH診斷資料：一對(duì)6年不育，女，32歲，cs正常，男34歲，核型：45，XY,t(13;14)(q10;q10),并伴少、弱精。采用單精子卵泡漿（intracytoplasmicsperminjection,ICSI)輔助授精，胚胎發(fā)育到3天6-8細(xì)胞期取出一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行雙色FISH檢測。參圖：用13q和14q探針，見核中2個(gè)13號(hào)（綠色）和2個(gè)14號(hào)（紅色）信號(hào)細(xì)胞，表明？37圖示1例13/14羅式易位攜帶者的胚胎植入前FISH診斷96移植后18周做羊水細(xì)胞CS檢查38移植后18周做羊水細(xì)胞CS檢查97PGD39PGD5、腫瘤診斷

腫瘤診斷探針檢測間期細(xì)胞內(nèi)DNA分子數(shù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)有癌基因擴(kuò)增984099腫瘤診斷41腫瘤診斷100慢性粒細(xì)胞白血病42慢性粒細(xì)胞白血病101慢性粒細(xì)胞白血病43慢性粒細(xì)胞白血病102慢性粒細(xì)胞白血病44慢性粒細(xì)胞白血病1036.微小染色體畸變檢測456.微小染色體畸變檢測104Microdeletion46Microdeletion7.遺傳病診斷（圖）例1：家系1FISH結(jié)果用Xcs著絲粒探針（綠色）和DMDexon46探針(紅色）雜交。圖示DMD男患者FISH結(jié)果：只有Xcs著絲粒綠色信號(hào)，無DMDexon46紅色信號(hào)，說明？1057.遺傳病診斷（圖）477.遺傳病診斷（圖）106

圖示：DMD男患者姐姐2條Xcs均有DMDExon46信號(hào)(紅色）。表明？7.遺傳病診斷（圖）48圖示：DMD男患者姐姐2條Xc7.遺傳病診斷（圖）107圖示：DMD男患者妹妹只有1條Xcs上有DMDExon46信號(hào)。表明？7.遺傳病診斷（圖）49圖示：DMD男患者妹妹只有1條X7.遺傳病診斷（圖）108例2：家系2FISH結(jié)果在DMD患者母親1/3淋巴細(xì)胞中僅有1條Xcs上有DMDExon46雜交信號(hào)，另一條上無。7.遺傳病診斷（圖）50例2：7.遺傳病診斷（圖）109圖示：在DMD患者母親2/3淋巴細(xì)胞中在2條Xcs上有DMDExon46雜交信號(hào)。A和B結(jié)果表明？7.遺傳病診斷（圖）51圖示：在DMD患者母親2/3淋巴7.遺傳病診斷（圖）110例