臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)第三章細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷課件

第三章

細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷

褚云卓12/20/20221第三章

細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷

褚云卓12/13/202本章內(nèi)容第一節(jié)標(biāo)本的采集和處理原則第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法12/20/20222本章內(nèi)容第一節(jié)標(biāo)本的采集和處理原則12/13/20222臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)第三章細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷課件臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)第三章細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷課件５.病人標(biāo)本中可能含有大量致病菌，必須注意安全防護(hù)６.標(biāo)本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必須包裝好，防止送檢過程中倒翻或碰破流出７.對于烈性傳染病標(biāo)本運(yùn)送時更要特別嚴(yán)格，必須按規(guī)定包裝，由專人運(yùn)送８.厭氧性標(biāo)本應(yīng)放在專門的運(yùn)送瓶或試管內(nèi)運(yùn)送，有時可直接用抽取標(biāo)本的注射器運(yùn)送12/20/20225５.病人標(biāo)本中可能含有大量致病菌，必須注意安全防護(hù)12/13第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查1.包括不染色標(biāo)本檢查法和染色標(biāo)本檢查法2.鏡檢可以了解有無細(xì)菌及大致的菌量3.根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色性有助于對病原菌的初步識別和分類4.通過形態(tài)學(xué)檢查可得到初步診斷，對臨床早期診斷和治療疾病有一定的參考意義12/20/20226第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查1.包括不染色標(biāo)本檢查法和染色標(biāo)本第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查一、不染色標(biāo)本1.細(xì)菌不經(jīng)染色直接鏡檢，主要用于檢查生活狀態(tài)下細(xì)菌的動力及運(yùn)動狀況2.常用的方法有壓滴法和懸滴法有動力：可看到細(xì)菌自一處移至另一處，有明顯的方向性位移無動力：細(xì)菌呈現(xiàn)布朗運(yùn)動，只在原地顫動而無位置的改變12/20/20227第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查一、不染色標(biāo)本12/13/2022第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查3.有些病原菌通過不染色標(biāo)本的動力檢查可作出初步鑒定如疑似霍亂患者，鏡下觀察到來回穿梭似流星狀運(yùn)動的細(xì)菌，制動試驗(yàn)陽性，可初步推斷為“疑似O1群霍亂弧菌”。12/20/20228第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查3.有些病原菌通過不染色標(biāo)本的動力第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查二、染色標(biāo)本（一）常用染料1．堿性染料：堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、美藍(lán)等2．酸性染料：有伊紅、剛果紅等3．復(fù)合染料（中性染料）及熒光染料：復(fù)合染料有瑞氏染料（伊紅美藍(lán)）、姬姆薩染料（伊紅天青）等；熒光染料有熒光標(biāo)記的抗體

12/20/20229第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查二、染色標(biāo)本12/13/20229第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查（二）常用的染色方法1．革蘭染色（gramstain）革蘭陽性球菌革蘭陰性桿菌12/20/202210第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查（二）常用的染色方法12/13/2第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查2．抗酸染色（acid-faststain）可將細(xì)菌分為兩大類：即-抗酸性細(xì)菌-非抗酸性細(xì)菌12/20/202211第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查2．抗酸染色12/13/20221第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查3．熒光染色（1）熒光染色法敏感性強(qiáng)，效率高而且容易觀察結(jié)果，在臨床細(xì)菌鑒定中有很大的實(shí)用價值。（2）主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等的檢測。12/20/202212第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查3．熒光染色12/13/2022第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查4.鞭毛染色可觀察到菌體上有無鞭毛、鞭毛的位置及數(shù)量，在細(xì)菌鑒定中，特別是非發(fā)酵菌的鑒定中很重要。5.異染顆粒染色用于白喉棒狀桿菌染色。12/20/202213第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查4.鞭毛染色12/13/20221第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查6.芽胞染色：綠色部分為芽胞12/20/202214第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查6.芽胞染色：12/13/2022第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查7.墨汁染色:一般用于新型隱球菌檢查12/20/202215第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查7.墨汁染色:12/13/2022第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇培養(yǎng)基的組成成分、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基的選擇二、分離及培養(yǎng)細(xì)菌的分離、細(xì)菌培養(yǎng)方法三、生化反應(yīng)和鑒定碳水化合物的代謝試驗(yàn)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)碳源和氮源利用試驗(yàn)12/20/202216第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇12/1第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇培養(yǎng)基（culturemedium）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。

12/20/202217第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇12/1第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定(一)培養(yǎng)基的組成成分1．營養(yǎng)物質(zhì)蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖類、醇類、血液、無機(jī)鹽類、雞蛋和動物血清生長因子2．凝固物質(zhì)瓊脂、明膠、卵白3．抑制劑和指示劑12/20/202218第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定(一)培養(yǎng)基的組成成分12/1第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（二）培養(yǎng)基種類1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basedmedium）2．營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrientmedium）3．鑒別培養(yǎng)基（diferentialmedium）4．選擇培養(yǎng)基（selectivemedium）5．特殊培養(yǎng)基（specialmedium）12/20/202219第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（二）培養(yǎng)基種類12/13/2第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)生長所需的基本營養(yǎng)成分，最常用的是肉浸液，俗稱肉湯（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。12/20/202220第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基12/13/20第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrientmedium）最常用的是血瓊脂平板、巧克力血平板等12/20/202221第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrien第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定

3．鑒別培養(yǎng)基（diferentialmedium）糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）、伊紅-鎂藍(lán)瓊脂和動力-吲哚-尿素（MIU）培養(yǎng)基等。12/20/202222第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．鑒別培養(yǎng)基（difere第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．選擇培（selectivemedium）SS瓊脂使致病的沙門菌、志賀菌容易分離到12/20/202223第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．選擇培12/13/2022第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定5．特殊培養(yǎng)基（specialmedium）皰肉培養(yǎng)基、巰基乙醇酸納培養(yǎng)基12/20/202224第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定5．特殊培養(yǎng)基12/13/20第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）培養(yǎng)基的選擇根據(jù)標(biāo)本來源和可能存在的病原菌，確定選用各種分離培養(yǎng)基。伊紅美藍(lán)/麥康凱用于篩選革蘭陰性桿菌。12/20/202225第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）培養(yǎng)基的選擇12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）培養(yǎng)基的選擇從血液、骨髓中分離病原菌用血液增菌培養(yǎng)基12/20/202226第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）培養(yǎng)基的選擇12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定1．平板劃線分離法2．斜面接種法3．液體接種法二、分離及培養(yǎng)（一）細(xì)菌的分離4．穿刺接種法5．傾注平板法6．涂布接種法12/20/202227第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定1．平板劃線分離法二、分離及培第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（二）細(xì)菌培養(yǎng)方法1．需氧培養(yǎng)法2．二氧化碳培養(yǎng)法3．厭氧培養(yǎng)法

12/20/202228第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（二）細(xì)菌培養(yǎng)方法12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定三、生化反應(yīng)和鑒定（一）碳水化合物的代謝試驗(yàn)1.糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)是鑒定細(xì)菌最主要和最基本的試驗(yàn)，特別對腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要12/20/202229第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定三、生化反應(yīng)和鑒定12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．氧化―發(fā)酵試驗(yàn)（O/F試驗(yàn)）主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者通常為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別。12/20/202230第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．氧化―發(fā)酵試驗(yàn)（O/F試驗(yàn)第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．β―半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG試驗(yàn)）迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONPG試驗(yàn)為陽性，而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本試驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。12/20/202231第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．β―半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONP第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．七葉苷水解試驗(yàn)主要用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。5．甲基紅試驗(yàn)主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌。6．V―P試驗(yàn)本試驗(yàn)常與甲基紅試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榍罢哧栃缘募?xì)菌，后者通常為陰性。12/20/202232第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．七葉苷水解試驗(yàn)12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)1．明膠液化試驗(yàn)主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒別。12/20/202233第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)（二）蛋第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．硫化氫試驗(yàn)培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種鑒別12/20/202234第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．硫化氫試驗(yàn)12/13/20第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．尿素分解試驗(yàn)主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定。5．苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅菲登斯菌屬和摩根菌屬細(xì)菌均為陽性，腸桿菌科中其他細(xì)菌均為陰性。6．氨基酸脫羧酶試驗(yàn)主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。12/20/202235第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．尿素分解試驗(yàn)12/13/2第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）碳源和氮源利用試驗(yàn)1．枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。2．丙二酸鹽利用試驗(yàn)?zāi)c桿菌科中屬間及種的鑒別。12/20/202236第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）碳源和氮源利用試驗(yàn)12/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（四）各種酶類試驗(yàn)1．氧化酶試驗(yàn)主要用于腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別。2．過氧化氫酶試驗(yàn)（觸酶試驗(yàn)）用于革蘭陽性球菌的初步分群。12/20/202237第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（四）各種酶類試驗(yàn)12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．硝酸鹽還原試驗(yàn)本試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中廣泛應(yīng)用。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌等假單胞菌可產(chǎn)生氮?dú)?；有些厭氧菌如韋榮球菌等試驗(yàn)也為陽性。12/20/202238第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．硝酸鹽還原試驗(yàn)12/1第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．脂酶試驗(yàn)主要用于厭氧菌的鑒別。5．卵磷脂酶試驗(yàn)主要用于厭氧菌的鑒定。6．

DNA酶試驗(yàn)在革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生

DNA酶，在腸桿菌科中沙雷氏菌和變形桿菌產(chǎn)生此酶。12/20/202239第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．脂酶試驗(yàn)12/13/202第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定8．

CAMP試驗(yàn)在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗(yàn)陽性，故可作為特異性鑒定。7．凝固酶試驗(yàn)作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標(biāo)，也是葡萄球菌鑒別時常用的一個試驗(yàn)。12/20/202240第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定8．CAMP試驗(yàn)7．凝固第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（五）抑菌試驗(yàn)1．O/129抑菌試驗(yàn)用于弧菌科的屬間鑒別，弧菌屬、鄰單胞菌屬對O/129敏感，而氣單胞菌屬耐藥。2．桿菌肽試驗(yàn)用于A群鏈球菌與非A群鏈球群的鑒別。3．奧普托欣（Optochin）試驗(yàn)主要用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。12/20/202241第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（五）抑菌試驗(yàn)12/13/20第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測抗原檢測、抗體檢測二、分子生物學(xué)檢測核酸雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、生物芯片技術(shù)三、細(xì)菌毒素的檢測內(nèi)毒素、外毒素四、動物實(shí)驗(yàn)

12/20/202242第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測12/13/20第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測（一）抗原檢測免疫熒光技術(shù)是利用免疫學(xué)特異性反應(yīng)與熒光示蹤技術(shù)相結(jié)合的顯微鏡檢查手段。既保持了血清學(xué)的高特異性，又極大地提高了檢測的敏感性，在細(xì)菌鑒定方面占有重要地位。常用的方法有直接法、間接法和免疫熒光菌球法。12/20/202243第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測12/13/20第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測（二）抗體檢測抗體的量常隨感染過程而增多，表現(xiàn)為效價的升高。因此用已知的細(xì)菌或其特異性抗原檢測病人血清中有無相應(yīng)抗體及其效價的動態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。主要適用于抗原性較強(qiáng)的致病菌和病程較長的感染性疾病。12/20/202244第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測12/13/20第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法二、分子生物學(xué)檢測（一）核酸雜交DNA可進(jìn)行變性、復(fù)性、雜交。我們利用這一特性，制備特定序列DNA片段，進(jìn)行標(biāo)記后用作探針，在一定條件下，按照堿基互補(bǔ)配對原則與標(biāo)本中已變性的細(xì)菌DNA進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號確定是否發(fā)生雜交反應(yīng)，從而鑒定標(biāo)本中有無相應(yīng)的病原菌基因。12/20/202245第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法二、分子生物學(xué)檢測12/13/第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法二、分子生物學(xué)檢測（一）核酸雜交1.探針的種類（1）全染色體DNA探針（2）染色體克隆片段DNA探針（3）質(zhì)粒DNA探針（4）rRNA基因探針（5）寡核苷酸探針12/20/202246第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法二、分子生物學(xué)檢測12/13/第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法2．核酸雜交在臨床細(xì)菌檢測中的應(yīng)用（1）細(xì)菌分類鑒定（2）細(xì)菌快速鑒定（3）細(xì)菌耐藥性的檢測（4）細(xì)菌毒素的檢測（5）細(xì)菌流行病學(xué)調(diào)查12/20/202247第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法2．核酸雜交在臨床細(xì)菌檢測第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法（二）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）1.特異性DNA體外擴(kuò)增技術(shù)2.特異、靈敏、快速、操作簡便3.廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的鑒定12/20/202248第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法（二）聚合酶鏈反應(yīng)12/13/第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法PCR在臨床細(xì)菌檢測中的應(yīng)用1.細(xì)菌的快速檢測2.細(xì)菌毒素的檢測3.細(xì)菌耐藥性的檢測4.細(xì)菌流行病學(xué)調(diào)查12/20/202249第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法PCR在臨床細(xì)菌檢測中的應(yīng)用1第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法（三）生物芯片技術(shù)1.通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)。2.對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。3.常用的生物芯片分為二大類：即基因芯片和蛋白芯片。12/20/202250第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法（三）生物芯片技術(shù)12/13/第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法三、細(xì)菌毒素的檢測（一）內(nèi)毒素內(nèi)毒素的測定，主要用于確診病人是否發(fā)生革蘭陰性細(xì)菌感染。另外，還可用于檢測注射用液和生物制品有無內(nèi)毒素污染。方法：鱟試驗(yàn)。12/20/202251第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法三、細(xì)菌毒素的檢測12/13/第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法（二）外毒素外毒素的測定可用于待檢菌的鑒定，同時可區(qū)分產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒株。方法：1.體內(nèi)毒力試驗(yàn)

2.體外毒力試驗(yàn)12/20/202252第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法（二）外毒素12/13/202第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法四、動物實(shí)驗(yàn)1.用途：（1）分離和鑒定病原微生物（2）測定細(xì)菌的毒力（3）制備免疫血清（4）建立致病動物模型（5）動物的血液是配制細(xì)菌培養(yǎng)基必須的實(shí)驗(yàn)材料（6）用于生物制品或一些藥物的安全、毒性、療效檢驗(yàn)2.常用的接種方法：皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射和腦內(nèi)注射等。12/20/202253第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法四、動物實(shí)驗(yàn)12/13/202第三章

細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷

褚云卓12/20/202254第三章

細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷

褚云卓12/13/202本章內(nèi)容第一節(jié)標(biāo)本的采集和處理原則第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法12/20/202255本章內(nèi)容第一節(jié)標(biāo)本的采集和處理原則12/13/20222臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)第三章細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷課件臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)第三章細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷課件５.病人標(biāo)本中可能含有大量致病菌，必須注意安全防護(hù)６.標(biāo)本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必須包裝好，防止送檢過程中倒翻或碰破流出７.對于烈性傳染病標(biāo)本運(yùn)送時更要特別嚴(yán)格，必須按規(guī)定包裝，由專人運(yùn)送８.厭氧性標(biāo)本應(yīng)放在專門的運(yùn)送瓶或試管內(nèi)運(yùn)送，有時可直接用抽取標(biāo)本的注射器運(yùn)送12/20/202258５.病人標(biāo)本中可能含有大量致病菌，必須注意安全防護(hù)12/13第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查1.包括不染色標(biāo)本檢查法和染色標(biāo)本檢查法2.鏡檢可以了解有無細(xì)菌及大致的菌量3.根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色性有助于對病原菌的初步識別和分類4.通過形態(tài)學(xué)檢查可得到初步診斷，對臨床早期診斷和治療疾病有一定的參考意義12/20/202259第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查1.包括不染色標(biāo)本檢查法和染色標(biāo)本第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查一、不染色標(biāo)本1.細(xì)菌不經(jīng)染色直接鏡檢，主要用于檢查生活狀態(tài)下細(xì)菌的動力及運(yùn)動狀況2.常用的方法有壓滴法和懸滴法有動力：可看到細(xì)菌自一處移至另一處，有明顯的方向性位移無動力：細(xì)菌呈現(xiàn)布朗運(yùn)動，只在原地顫動而無位置的改變12/20/202260第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查一、不染色標(biāo)本12/13/2022第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查3.有些病原菌通過不染色標(biāo)本的動力檢查可作出初步鑒定如疑似霍亂患者，鏡下觀察到來回穿梭似流星狀運(yùn)動的細(xì)菌，制動試驗(yàn)陽性，可初步推斷為“疑似O1群霍亂弧菌”。12/20/202261第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查3.有些病原菌通過不染色標(biāo)本的動力第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查二、染色標(biāo)本（一）常用染料1．堿性染料：堿性復(fù)紅、結(jié)晶紫、美藍(lán)等2．酸性染料：有伊紅、剛果紅等3．復(fù)合染料（中性染料）及熒光染料：復(fù)合染料有瑞氏染料（伊紅美藍(lán)）、姬姆薩染料（伊紅天青）等；熒光染料有熒光標(biāo)記的抗體

12/20/202262第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查二、染色標(biāo)本12/13/20229第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查（二）常用的染色方法1．革蘭染色（gramstain）革蘭陽性球菌革蘭陰性桿菌12/20/202263第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查（二）常用的染色方法12/13/2第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查2．抗酸染色（acid-faststain）可將細(xì)菌分為兩大類：即-抗酸性細(xì)菌-非抗酸性細(xì)菌12/20/202264第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查2．抗酸染色12/13/20221第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查3．熒光染色（1）熒光染色法敏感性強(qiáng)，效率高而且容易觀察結(jié)果，在臨床細(xì)菌鑒定中有很大的實(shí)用價值。（2）主要用于結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等的檢測。12/20/202265第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查3．熒光染色12/13/2022第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查4.鞭毛染色可觀察到菌體上有無鞭毛、鞭毛的位置及數(shù)量，在細(xì)菌鑒定中，特別是非發(fā)酵菌的鑒定中很重要。5.異染顆粒染色用于白喉棒狀桿菌染色。12/20/202266第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查4.鞭毛染色12/13/20221第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查6.芽胞染色：綠色部分為芽胞12/20/202267第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查6.芽胞染色：12/13/2022第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查7.墨汁染色:一般用于新型隱球菌檢查12/20/202268第二節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查7.墨汁染色:12/13/2022第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇培養(yǎng)基的組成成分、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基的選擇二、分離及培養(yǎng)細(xì)菌的分離、細(xì)菌培養(yǎng)方法三、生化反應(yīng)和鑒定碳水化合物的代謝試驗(yàn)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)碳源和氮源利用試驗(yàn)12/20/202269第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇12/1第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇培養(yǎng)基（culturemedium）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。

12/20/202270第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇12/1第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定(一)培養(yǎng)基的組成成分1．營養(yǎng)物質(zhì)蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖類、醇類、血液、無機(jī)鹽類、雞蛋和動物血清生長因子2．凝固物質(zhì)瓊脂、明膠、卵白3．抑制劑和指示劑12/20/202271第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定(一)培養(yǎng)基的組成成分12/1第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（二）培養(yǎng)基種類1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basedmedium）2．營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrientmedium）3．鑒別培養(yǎng)基（diferentialmedium）4．選擇培養(yǎng)基（selectivemedium）5．特殊培養(yǎng)基（specialmedium）12/20/202272第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（二）培養(yǎng)基種類12/13/2第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)生長所需的基本營養(yǎng)成分，最常用的是肉浸液，俗稱肉湯（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。12/20/202273第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定1．基礎(chǔ)培養(yǎng)基12/13/20第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrientmedium）最常用的是血瓊脂平板、巧克力血平板等12/20/202274第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrien第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定

3．鑒別培養(yǎng)基（diferentialmedium）糖發(fā)酵管、克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）、伊紅-鎂藍(lán)瓊脂和動力-吲哚-尿素（MIU）培養(yǎng)基等。12/20/202275第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．鑒別培養(yǎng)基（difere第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．選擇培（selectivemedium）SS瓊脂使致病的沙門菌、志賀菌容易分離到12/20/202276第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．選擇培12/13/2022第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定5．特殊培養(yǎng)基（specialmedium）皰肉培養(yǎng)基、巰基乙醇酸納培養(yǎng)基12/20/202277第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定5．特殊培養(yǎng)基12/13/20第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）培養(yǎng)基的選擇根據(jù)標(biāo)本來源和可能存在的病原菌，確定選用各種分離培養(yǎng)基。伊紅美藍(lán)/麥康凱用于篩選革蘭陰性桿菌。12/20/202278第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）培養(yǎng)基的選擇12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）培養(yǎng)基的選擇從血液、骨髓中分離病原菌用血液增菌培養(yǎng)基12/20/202279第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）培養(yǎng)基的選擇12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定1．平板劃線分離法2．斜面接種法3．液體接種法二、分離及培養(yǎng)（一）細(xì)菌的分離4．穿刺接種法5．傾注平板法6．涂布接種法12/20/202280第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定1．平板劃線分離法二、分離及培第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（二）細(xì)菌培養(yǎng)方法1．需氧培養(yǎng)法2．二氧化碳培養(yǎng)法3．厭氧培養(yǎng)法

12/20/202281第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（二）細(xì)菌培養(yǎng)方法12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定三、生化反應(yīng)和鑒定（一）碳水化合物的代謝試驗(yàn)1.糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)是鑒定細(xì)菌最主要和最基本的試驗(yàn)，特別對腸桿菌科細(xì)菌的鑒定尤為重要12/20/202282第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定三、生化反應(yīng)和鑒定12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．氧化―發(fā)酵試驗(yàn)（O/F試驗(yàn)）主要用于腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌的鑒別，前者均為發(fā)酵型，而后者通常為氧化型或產(chǎn)堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別。12/20/202283第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．氧化―發(fā)酵試驗(yàn)（O/F試驗(yàn)第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．β―半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG試驗(yàn)）迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONPG試驗(yàn)為陽性，而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本試驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定。12/20/202284第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．β―半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONP第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．七葉苷水解試驗(yàn)主要用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。5．甲基紅試驗(yàn)主要用于鑒別大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌。6．V―P試驗(yàn)本試驗(yàn)常與甲基紅試驗(yàn)一起使用，因?yàn)榍罢哧栃缘募?xì)菌，后者通常為陰性。12/20/202285第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．七葉苷水解試驗(yàn)12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)1．明膠液化試驗(yàn)主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒別。12/20/202286第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定2．吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)（二）蛋第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．硫化氫試驗(yàn)培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基應(yīng)用：主要用于腸桿菌科中屬及種鑒別12/20/202287第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．硫化氫試驗(yàn)12/13/20第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．尿素分解試驗(yàn)主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細(xì)菌的鑒定。5．苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅菲登斯菌屬和摩根菌屬細(xì)菌均為陽性，腸桿菌科中其他細(xì)菌均為陰性。6．氨基酸脫羧酶試驗(yàn)主要用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定。12/20/202288第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．尿素分解試驗(yàn)12/13/2第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）碳源和氮源利用試驗(yàn)1．枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。2．丙二酸鹽利用試驗(yàn)?zāi)c桿菌科中屬間及種的鑒別。12/20/202289第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（三）碳源和氮源利用試驗(yàn)12/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（四）各種酶類試驗(yàn)1．氧化酶試驗(yàn)主要用于腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的鑒別。2．過氧化氫酶試驗(yàn)（觸酶試驗(yàn)）用于革蘭陽性球菌的初步分群。12/20/202290第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（四）各種酶類試驗(yàn)12/13/第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．硝酸鹽還原試驗(yàn)本試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中廣泛應(yīng)用。腸桿菌科細(xì)菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌等假單胞菌可產(chǎn)生氮?dú)?；有些厭氧菌如韋榮球菌等試驗(yàn)也為陽性。12/20/202291第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定3．硝酸鹽還原試驗(yàn)12/1第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．脂酶試驗(yàn)主要用于厭氧菌的鑒別。5．卵磷脂酶試驗(yàn)主要用于厭氧菌的鑒定。6．

DNA酶試驗(yàn)在革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產(chǎn)生

DNA酶，在腸桿菌科中沙雷氏菌和變形桿菌產(chǎn)生此酶。12/20/202292第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定4．脂酶試驗(yàn)12/13/202第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定8．

CAMP試驗(yàn)在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗(yàn)陽性，故可作為特異性鑒定。7．凝固酶試驗(yàn)作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標(biāo)，也是葡萄球菌鑒別時常用的一個試驗(yàn)。12/20/202293第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定8．CAMP試驗(yàn)7．凝固第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（五）抑菌試驗(yàn)1．O/129抑菌試驗(yàn)用于弧菌科的屬間鑒別，弧菌屬、鄰單胞菌屬對O/129敏感，而氣單胞菌屬耐藥。2．桿菌肽試驗(yàn)用于A群鏈球菌與非A群鏈球群的鑒別。3．奧普托欣（Optochin）試驗(yàn)主要用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。12/20/202294第三節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定（五）抑菌試驗(yàn)12/13/20第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測抗原檢測、抗體檢測二、分子生物學(xué)檢測核酸雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、生物芯片技術(shù)三、細(xì)菌毒素的檢測內(nèi)毒素、外毒素四、動物實(shí)驗(yàn)

12/20/202295第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測12/13/20第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測（一）抗原檢測免疫熒光技術(shù)是利用免疫學(xué)特異性反應(yīng)與熒光示蹤技術(shù)相結(jié)合的顯微鏡檢查手段。既保持了血清學(xué)的高特異性，又極大地提高了檢測的敏感性，在細(xì)菌鑒定方面占有重要地位。常用的方法有直接法、間接法和免疫熒光菌球法。12/20/202296第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測12/13/20第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測（二）抗體檢測抗體的量常隨感染過程而增多，表現(xiàn)為效價的升高。因此用已知的細(xì)菌或其特異性抗原檢測病人血清中有無相應(yīng)抗體及其效價的動態(tài)變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。主要適用于抗原性較強(qiáng)的致病菌和病程較長的感染性疾病。12/20/202297第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測12/13/20第四節(jié)

細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法二、分子生物學(xué)檢測（一）核