細(xì)胞分離與培養(yǎng)技術(shù)課件

1臨床藥理研究所細(xì)胞分離與培養(yǎng)技術(shù)1臨床藥理研究所細(xì)胞分離與培養(yǎng)技術(shù)2現(xiàn)代生物技術(shù)基因工程技術(shù)細(xì)胞工程技術(shù)酶工程技術(shù)發(fā)酵工程技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)2現(xiàn)代生物技術(shù)基因工程技術(shù)細(xì)胞工程技術(shù)酶工程技術(shù)發(fā)酵工細(xì)胞分離技術(shù)從血液、體液中分離細(xì)胞從原代組織中分離細(xì)胞從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞--傳代培養(yǎng)3原代培養(yǎng)細(xì)胞分離技術(shù)從血液、體液中分離細(xì)胞3原代培養(yǎng)細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞采血方法：人靜脈穿刺、耳垂或手指針刺采血；小動(dòng)物（大鼠、小鼠）剪尾法、眼眶采血、心臟穿刺法、斷頸取血或股動(dòng)脈放血。兔耳靜脈或動(dòng)脈穿刺取血。4細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞4細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血液抗凝方法：肝素法：按每ml血液約用0.1-0.2mg肝素（即5%肝素溶液2-4μl）；草酸鹽法：取草酸鉀0.2g，草酸銨0.3g，加雙蒸水10ml溶解后，取0.2ml放入5ml的試管中，使其干燥。若采用5ml以下的血液可直接注入此試管中，輕輕搖晃；枸櫞酸鈉法：先配制2%枸櫞酸鈉，取0.15-0.2ml加于1ml血液中即可抗凝；EDTA法（186.1）：每ml血液中加0.5mmol/LEDTA2μl。5細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血液抗凝方法：5細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞體液標(biāo)本采集：在局部70%酒精消毒滅菌后，用滅菌注射器穿刺入體腔（如胸腔，腹腔，關(guān)節(jié)腔等）抽取液體樣品。6膝關(guān)節(jié)腔穿刺

胸腔穿刺

細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞體液標(biāo)本采集：6膝關(guān)節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血樣中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的分離：

利用細(xì)胞的相對(duì)密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法結(jié)合不同速度的離心沉降法將不同的細(xì)胞分離。

抗凝血，室溫或37℃下直立靜置30-60min，紅細(xì)胞沉降至下層，中間乳白色薄膜層為白細(xì)胞及血小板，上層為淡黃色血漿。也可將抗凝血與3%明膠（經(jīng)滅菌消毒）等量或3︰l量混合于離心管中，直立靜置30-60min，紅細(xì)胞沉于管底，上層乳白色混濁液含白細(xì)胞。

7細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血樣中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞8血中單個(gè)核細(xì)胞的分離：

單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其相對(duì)密度在1.050-1.077之間，采用速度沉降法原理使其分離。

淋巴細(xì)胞分離液細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞8血中單個(gè)核細(xì)胞的分離細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血中單核細(xì)胞的分離：利用細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中貼壁時(shí)間的早晚不同進(jìn)行細(xì)胞分離9單個(gè)核細(xì)胞懸液多將懸液放入12cm直徑的培養(yǎng)皿中，于37℃培養(yǎng)箱中靜置30-60min。此時(shí)單核細(xì)胞貼壁，而淋巴細(xì)胞尚未貼壁，傾出未貼壁細(xì)胞，并用Hanks液輕輕沖洗培養(yǎng)皿以盡量洗下未貼壁細(xì)胞（淋巴細(xì)胞）。

用Hanks液強(qiáng)力沖洗吹打與震蕩，將貼壁的單核細(xì)胞沖落或用刮刀輕刮，收集貼壁的單核細(xì)胞。計(jì)數(shù)后分別制備所需濃度的細(xì)胞懸液。細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血中單核細(xì)胞的分離：9細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞黏附法分離血中單核細(xì)胞、T，B淋巴細(xì)胞

10因B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞能黏附于尼龍纖維柱上（聚酰胺纖維柱），所以可將其與T淋巴細(xì)胞分離。細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞黏附法分離血中單核細(xì)胞具體步驟：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3）×107/ml的細(xì)胞懸液。先用Hanks液，再用含20%小牛血清的RPMI-1640液沖洗平衡尼龍纖維柱，沖洗液盡量流凈。將尼龍柱預(yù)溫37℃，再用配制的單個(gè)核細(xì)胞懸液2ml裝入尼龍纖維柱，不使流出，37℃溫箱內(nèi)靜置l小時(shí)。取下注射針頭，用預(yù)溫37℃含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗尼龍纖維柱，洗出者即為未黏附的T淋巴細(xì)胞。從注射器內(nèi)取出尼龍纖維，在4℃的RPMI-1640液內(nèi)漂洗，并輕輕擠壓，將黏附的B細(xì)胞洗脫收集（B淋巴細(xì)胞中混有的單核細(xì)胞可用貼壁法將其分離）。收集的T、B淋巴細(xì)胞可分別用Hanks液懸浮，洗滌，離心（250g，7min），并重復(fù)洗滌3次。計(jì)算活細(xì)胞，計(jì)數(shù)懸液中的細(xì)胞數(shù)后制備所需濃度的T和B淋巴細(xì)胞懸液。11具體步驟：11細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞免疫磁珠法(MACS)分離T、B淋巴細(xì)胞：

磁性微珠是20世紀(jì)80年代初以高分子材料和金屬離子（如Fe3O4）為原料聚合而成的一種以金屬離子為核心、外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁場(chǎng)的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠為載體，包被上針對(duì)某種細(xì)胞表面抗原的特異性抗體即可制成免疫磁性微珠。

12細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞免疫磁珠法(MACS)細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞

免疫磁性微珠用于細(xì)胞的分離和純化的基本原理及步驟是：首先將抗特異細(xì)胞表面抗原的抗體致敏到磁珠上，待它與混合體系中的細(xì)胞反應(yīng)后，利用磁力的作用，使與致敏結(jié)合的細(xì)胞與其它物質(zhì)分離，達(dá)到純化、分離的目的。通常有二種分離方式：陽(yáng)性分離和陰性分離。陽(yáng)性分離是直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞，陰性分離是利用磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞，使靶細(xì)胞得以分離。13細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞免疫磁性微珠用細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞

免疫磁珠分離細(xì)胞已被廣泛應(yīng)用于人類(lèi)各種細(xì)胞的分離，如T(CD3)、B(CD19)淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞(CD34)、造血祖細(xì)胞(CD34)、單核/巨噬細(xì)胞(CD14)、胰島細(xì)胞(胰島GK和GLUT2（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子）)、多種腫瘤細(xì)胞等。14細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞免疫磁珠分離細(xì)細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞15細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞15細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞16細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞16細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞17細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞17細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞MACS技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定、高質(zhì)量的分選：純度（90-99%）對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷操作簡(jiǎn)便、快速：消毒方便，手動(dòng)分選30分鐘內(nèi)完成，autoMACS分選2.5-10分鐘之內(nèi)完成。從實(shí)驗(yàn)室到臨床：MACS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)105-1011個(gè)細(xì)胞分選。有autoMACS和CliniMACS。分選后細(xì)胞適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)：分選后適用于細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分選得到的標(biāo)記和未標(biāo)記細(xì)胞組分均可回收利用。從細(xì)胞到分子分選：不僅可以分選各種細(xì)胞，還可以分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞、亞細(xì)胞物質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA、RNA及mRNA。18MACS技術(shù)缺點(diǎn)：分離效率較流式細(xì)胞儀分選略低且耗材相對(duì)較貴，適合無(wú)大型流式細(xì)胞儀設(shè)備且對(duì)分選細(xì)胞純度要求不高的分選。只適用于簡(jiǎn)單標(biāo)記的細(xì)胞分離細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞MACS技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：18細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分離法分離T、B淋巴細(xì)胞：密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基配成1×107/ml；加適量FITC-抗CD3或FITC-抗CD19，4℃孵育30min,用RPMI-1640培養(yǎng)基洗2次；用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。在散射光參數(shù)圖上選取淋巴細(xì)胞群，在熒光參數(shù)圖上選取綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行分選。19細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分離法分離T細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞注意事項(xiàng)：分選細(xì)胞常用于細(xì)胞亞群進(jìn)一步的功能研究，因此，整個(gè)過(guò)程均需要嚴(yán)格無(wú)菌操作，流式細(xì)胞儀進(jìn)行無(wú)菌沖洗。此法分離得到的T細(xì)胞純度可達(dá)到99%,收獲率可達(dá)到90%。由于噴嘴孔很?。s70～100μm），分選前用30～40μm孔徑的濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，以免堵塞噴嘴。20細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞注意事項(xiàng)：20細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞優(yōu)缺點(diǎn)：流式細(xì)胞儀分選純度較高、回收率高，分選一些具有比較復(fù)雜細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞時(shí)相當(dāng)有用的，例如要分選出白血病人骨髓中某些CD34+CD13-CD45dim的幼稚細(xì)胞，只需要在流式上簡(jiǎn)單地邏輯設(shè)門(mén)就可以了，而且流式可以雙通道分選，也就是同一時(shí)間分選出兩種細(xì)胞，流式分選成本比磁珠低。流式分選最致命的缺點(diǎn)就是污染，且設(shè)備昂貴，技術(shù)復(fù)雜，需專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作，操作費(fèi)時(shí)，適合對(duì)細(xì)胞純度和回收率要求較高的分選。21細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞優(yōu)缺點(diǎn)：21細(xì)胞分離技術(shù)二、從原代組織中分離細(xì)胞組織和器官采集：人標(biāo)本：可采取無(wú)菌手術(shù)法切取少量所需的組織或器官（活檢和手術(shù)）。大量的動(dòng)物組織：先麻醉或處死，浸入70%酒精中，使毛皮全部浸濕，從腹中線剪開(kāi)皮膚，注意不要剪開(kāi)胸腔或腹腔。將皮膚向上、下撕開(kāi)分離并向上、下翻開(kāi)，暴露胸腹部的筋膜，用生理鹽水洗凈黏于筋膜上的斷毛，以碘酒和70%酒精消毒后，更換一套消毒滅菌的器械，剪開(kāi)胸腔或腹腔，無(wú)菌采取所需器官。動(dòng)物的骨髓：可以無(wú)菌手術(shù)采取一段股骨，用滅菌注射器，將小牛血清或培養(yǎng)液從斷端一端加壓注射以從另一斷端出骨髓。22細(xì)胞分離技術(shù)二、從原代組織中分離細(xì)胞22細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞制備細(xì)胞懸液方法：將組織塊分離（散）成細(xì)胞懸液的方法有多種，最常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法。從原代組織中獲得單細(xì)胞懸液的一般方法是酶解聚。細(xì)胞暴露在酶中的時(shí)間要盡可能的短，以保持最大的活性。包括胰蛋白酶、膠原酶和中性蛋白酶等。23細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞23細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞1.胰蛋白酶(Trypsin)

24在去除不需要的組織后，使用無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織塊，重復(fù)清洗2到3次。用無(wú)菌的解剖刀和剪子把組織切成1-2mm3小塊。將盛有組織碎片的容器置于冰上。加入0.25％溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml胰蛋白酶）。細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞1.胰蛋白酶(Tryp細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞

25在4℃孵育6到18小時(shí)，使胰蛋白酶盡可能滲透進(jìn)去移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘在組織碎片加入熱的完全培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無(wú)血清培養(yǎng)基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100-200目）過(guò)濾，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞

25在4℃孵育6細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞2.膠原酶(Collagenase)

26用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成1-2mm3小塊，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）

在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mMCaCl2增加解離效率

細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞2.膠原酶(Coll細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞27通過(guò)離心在HBSS中清洗懸液幾次

再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)

通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如需進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞27通過(guò)離心在HBSS中細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞3.中性蛋白酶(Dispase)28用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成1-2mm3小塊，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次加入Dispase（0.6～2.4單位/ml溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液）

在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞3.中性蛋白酶(Disp細(xì)胞分離技術(shù)29通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如需進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase

通過(guò)離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞分離技術(shù)29通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，分離細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞舉例（滑膜細(xì)胞的膠原酶－胰蛋白酶消化分離法

）:30無(wú)菌取滑膜組織，去除脂肪、纖維等

用D-Hank’s液（無(wú)Ca2+、Mg2+，含青霉素200kU·L-1、鏈霉素200mg·L-1）反復(fù)沖洗后剪成1~2mm3小塊，離心洗滌2次置于加入2ml含10%胎牛血清、0.4%Ⅱ型膠原酶的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化2h，每隔10min吹打1次。

細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞30無(wú)菌取滑膜組織，去除細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞31再加入含0.25%胰蛋白酶的D-Hank’s液4ml，培養(yǎng)消化30min

將培養(yǎng)液移至離心管中，1200rpm離心10min，棄上清

200目尼龍網(wǎng)紗過(guò)濾，1200rpm離心10min，棄上清

將獲得的細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄去未黏附細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞，紅細(xì)胞），此時(shí)的貼壁細(xì)胞即為原代滑膜細(xì)胞

細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞31再加入含0.25%胰細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞4.組織塊培養(yǎng)法舉例（成纖維樣滑膜細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法）：32無(wú)菌取滑膜組織，去除脂肪、纖維等，用不含鈣鎂的D-Hank’s液（含青霉素200kU·L-1、鏈霉素200mg·L-1）反復(fù)沖洗后剪成1~2mm3小塊用吸管吸取均勻排列于培養(yǎng)瓶（預(yù)先用含20％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液濕潤(rùn)）的底壁，瓶底朝上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h，使其貼壁細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞32無(wú)菌取滑膜組織，去除細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞33待細(xì)胞快長(zhǎng)滿時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，取第3~5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)觀察到有大量成纖維細(xì)胞長(zhǎng)出后輕輕去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液剛剛覆蓋組織塊，每隔2~3天換一次培養(yǎng)液細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞33待細(xì)胞快長(zhǎng)滿時(shí)用0.成纖維樣滑膜細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法34培養(yǎng)24h培養(yǎng)96h培養(yǎng)120h成纖維樣滑膜細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法34培養(yǎng)24h培養(yǎng)96h培養(yǎng)12細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞舉例（初步淋巴細(xì)胞分離法）：35放血處死動(dòng)物，無(wú)菌取胸腺和脾組織，去除脂肪和結(jié)締組織，放入盛有含5%小牛血清的D-Hank’s液（不含鈣鎂，含青霉素200kU·L-1、鏈霉素200mg·L-1）平皿的網(wǎng)紗中（200目）用注射器針芯輕輕碾碎胸腺和脾組織，使單個(gè)細(xì)胞經(jīng)網(wǎng)進(jìn)入溶液中溶液移入離心管中，1200rpm離心10min，棄上清，D-Hank’s液洗滌細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)液計(jì)數(shù)和調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞舉例（初步淋巴細(xì)胞分離法細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞舉例（乳鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)法）：基本原理：

心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法有離體心臟灌注法、酶消化法和組織塊法，將心肌組織分離成單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成心肌細(xì)胞懸液，在體外適宜條件下使之生長(zhǎng)繁殖，并保留其結(jié)構(gòu)與功能特性。36細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞舉例（乳鼠原代心肌細(xì)胞培細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞評(píng)價(jià)：離體心臟灌注法對(duì)乳大鼠來(lái)說(shuō)實(shí)施難度大;酶消化法操作流程長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)消化酶濃度及作用時(shí)間要求嚴(yán)格，但是能得到大量單細(xì)胞；組織塊法操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)成本低，可得到具較高純度的心肌細(xì)胞。因此，心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)常用的方法多用酶消化法和組織塊法兩種。37細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞評(píng)價(jià)：37細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞心肌細(xì)胞的酶消化培養(yǎng)法：1.心肌組織的選擇：生后1~4天的Wistar乳鼠心臟等。2.心肌組織塊的制備：乳鼠用75%乙醇/1%新潔爾滅消毒皮膚，無(wú)菌開(kāi)胸，暴露心臟，于心臟收縮期剪下心臟，置于盛D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中，剪開(kāi)心臟，清洗三次，以去除血污。38細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞心肌細(xì)胞的酶消化培養(yǎng)法：細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞3.心肌細(xì)胞懸液的制備：取心尖部組織（心室）剪為1mm3碎塊，在大離心管中放入組織碎塊，加入0.06%~0.25%的胰蛋白酶溶液8~15ml，在磁力攪拌器上，37℃水浴消化10min，自然沉淀后棄上清。剩余組織塊中再加入新胰蛋白酶，消化10min，靜置后將上清液移入盛有15%新生牛血清培養(yǎng)液的離心管中終止消化，并以1000rpm離心10min，棄上清，用培養(yǎng)液充分吹打成單細(xì)胞懸液。剩余沉淀用同樣條件及方法反復(fù)消化，直至將組織基本完全消化為止，分次收獲心肌細(xì)胞。39細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞3.心肌細(xì)胞懸液的制備：細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞4.心肌細(xì)胞懸液的接種：將分次收獲的心肌細(xì)胞用Hank’s液離心清洗1~2次，棄上清液。將沉淀細(xì)胞定量加入培養(yǎng)基3~5mL，吹打混勻，制成細(xì)胞懸液。應(yīng)用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整至所需濃度，37℃、5%CO2

培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5.細(xì)胞純化：培養(yǎng)2h，將細(xì)胞懸液進(jìn)行換瓶培養(yǎng)，去除瓶底的貼壁細(xì)胞；2h后，去除瓶底的貼壁細(xì)胞，重復(fù)一次，方法同前，以去除成纖維細(xì)胞，純化心肌細(xì)胞。40細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞4.心肌細(xì)胞懸液的接種：細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞心肌細(xì)胞的貼塊培養(yǎng)法：

1.取材：按前述方法取出心臟，置于盛Hank’s液的培養(yǎng)皿中，清洗三次。

2.貼塊：將心臟剪為1mm3大小的小塊，移入培養(yǎng)瓶底面，用無(wú)菌牙科探針將其均勻鋪開(kāi)。

3.干固：蓋上瓶蓋，37℃烤箱培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)干固1~1.5h。

4.接種培養(yǎng)：添加少量培養(yǎng)基，以恰好蓋住組織塊為佳，次日加足培養(yǎng)液。41細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞心肌細(xì)胞的貼塊培養(yǎng)法：44242細(xì)胞分離技術(shù)三、從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞（傳代培養(yǎng)）貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層后，繼續(xù)生長(zhǎng)的空間不足，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成份也消耗較多，同時(shí)代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增。43細(xì)胞分離技術(shù)三、從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞（傳代培養(yǎng)）43細(xì)胞分離技術(shù)--傳代培養(yǎng)

對(duì)于貼壁不太緊的細(xì)胞如人胚胎腎（HEK）293細(xì)胞等，可以直接吹散后分瓶;

對(duì)于貼壁較緊的細(xì)胞如中華倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞、滑膜細(xì)胞（Synoviocytes）等，則需要以胰酶消化后再吹散分瓶（以下操作均按無(wú)菌操作的要求進(jìn)行）：44細(xì)胞分離技術(shù)--傳代培養(yǎng)對(duì)于貼壁不太緊的細(xì)胞如人胚胎腎（H細(xì)胞分離技術(shù)--傳代培養(yǎng)45將長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶中原來(lái)的培養(yǎng)液棄去加入0.25％胰酶溶液，視細(xì)胞瓶的大小加入體積為0.5ml或更多，以使充分浸潤(rùn)一般消化時(shí)間約為1-3分鐘，肉眼觀察瓶壁半透明的細(xì)胞層，當(dāng)見(jiàn)到出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去胰酶溶液，并加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，也可以在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓視實(shí)驗(yàn)要求分入多瓶繼續(xù)培養(yǎng)，一般為一傳二到一傳四的比例細(xì)胞分離技術(shù)--傳代培養(yǎng)45將長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶中原來(lái)細(xì)胞分離技術(shù)--傳代培養(yǎng)胰酶消化的程度是一個(gè)關(guān)鍵：消化過(guò)度則對(duì)細(xì)胞的活性損傷較大，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失；消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。46細(xì)胞分離技術(shù)--傳代培養(yǎng)胰酶消化的程度是一個(gè)關(guān)鍵：46細(xì)胞分離技術(shù)--傳代培養(yǎng)影響消化速度的因素：主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或4℃保存時(shí)間長(zhǎng)短、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時(shí)間及溫度等）、消化時(shí)的溫度（氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等。消化程度以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下為好。下面將細(xì)胞生長(zhǎng)及不同消化程度的光學(xué)顯微鏡照片列出以供參考（以CHO細(xì)胞為例）。47細(xì)胞分離技術(shù)--傳代培養(yǎng)影響消化速度的因素：4748復(fù)蘇后細(xì)胞培養(yǎng)24h培養(yǎng)48h剛加胰酶開(kāi)始皺縮明顯皺縮基本變圓完全變圓48復(fù)蘇后細(xì)胞培養(yǎng)24h培養(yǎng)48h剛加胰酶開(kāi)始皺縮明顯皺縮基49臨床藥理研究所細(xì)胞分離與培養(yǎng)技術(shù)1臨床藥理研究所細(xì)胞分離與培養(yǎng)技術(shù)50現(xiàn)代生物技術(shù)基因工程技術(shù)細(xì)胞工程技術(shù)酶工程技術(shù)發(fā)酵工程技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)2現(xiàn)代生物技術(shù)基因工程技術(shù)細(xì)胞工程技術(shù)酶工程技術(shù)發(fā)酵工細(xì)胞分離技術(shù)從血液、體液中分離細(xì)胞從原代組織中分離細(xì)胞從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞--傳代培養(yǎng)51原代培養(yǎng)細(xì)胞分離技術(shù)從血液、體液中分離細(xì)胞3原代培養(yǎng)細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞采血方法：人靜脈穿刺、耳垂或手指針刺采血；小動(dòng)物（大鼠、小鼠）剪尾法、眼眶采血、心臟穿刺法、斷頸取血或股動(dòng)脈放血。兔耳靜脈或動(dòng)脈穿刺取血。52細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞4細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血液抗凝方法：肝素法：按每ml血液約用0.1-0.2mg肝素（即5%肝素溶液2-4μl）；草酸鹽法：取草酸鉀0.2g，草酸銨0.3g，加雙蒸水10ml溶解后，取0.2ml放入5ml的試管中，使其干燥。若采用5ml以下的血液可直接注入此試管中，輕輕搖晃；枸櫞酸鈉法：先配制2%枸櫞酸鈉，取0.15-0.2ml加于1ml血液中即可抗凝；EDTA法（186.1）：每ml血液中加0.5mmol/LEDTA2μl。53細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血液抗凝方法：5細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞體液標(biāo)本采集：在局部70%酒精消毒滅菌后，用滅菌注射器穿刺入體腔（如胸腔，腹腔，關(guān)節(jié)腔等）抽取液體樣品。54膝關(guān)節(jié)腔穿刺

胸腔穿刺

細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞體液標(biāo)本采集：6膝關(guān)節(jié)細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血樣中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的分離：

利用細(xì)胞的相對(duì)密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉降法結(jié)合不同速度的離心沉降法將不同的細(xì)胞分離。

抗凝血，室溫或37℃下直立靜置30-60min，紅細(xì)胞沉降至下層，中間乳白色薄膜層為白細(xì)胞及血小板，上層為淡黃色血漿。也可將抗凝血與3%明膠（經(jīng)滅菌消毒）等量或3︰l量混合于離心管中，直立靜置30-60min，紅細(xì)胞沉于管底，上層乳白色混濁液含白細(xì)胞。

55細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血樣中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞56血中單個(gè)核細(xì)胞的分離：

單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其相對(duì)密度在1.050-1.077之間，采用速度沉降法原理使其分離。

淋巴細(xì)胞分離液細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞8血中單個(gè)核細(xì)胞的分離細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血中單核細(xì)胞的分離：利用細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中貼壁時(shí)間的早晚不同進(jìn)行細(xì)胞分離57單個(gè)核細(xì)胞懸液多將懸液放入12cm直徑的培養(yǎng)皿中，于37℃培養(yǎng)箱中靜置30-60min。此時(shí)單核細(xì)胞貼壁，而淋巴細(xì)胞尚未貼壁，傾出未貼壁細(xì)胞，并用Hanks液輕輕沖洗培養(yǎng)皿以盡量洗下未貼壁細(xì)胞（淋巴細(xì)胞）。

用Hanks液強(qiáng)力沖洗吹打與震蕩，將貼壁的單核細(xì)胞沖落或用刮刀輕刮，收集貼壁的單核細(xì)胞。計(jì)數(shù)后分別制備所需濃度的細(xì)胞懸液。細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞血中單核細(xì)胞的分離：9細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞黏附法分離血中單核細(xì)胞、T，B淋巴細(xì)胞

58因B淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞能黏附于尼龍纖維柱上（聚酰胺纖維柱），所以可將其與T淋巴細(xì)胞分離。細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞黏附法分離血中單核細(xì)胞具體步驟：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3）×107/ml的細(xì)胞懸液。先用Hanks液，再用含20%小牛血清的RPMI-1640液沖洗平衡尼龍纖維柱，沖洗液盡量流凈。將尼龍柱預(yù)溫37℃，再用配制的單個(gè)核細(xì)胞懸液2ml裝入尼龍纖維柱，不使流出，37℃溫箱內(nèi)靜置l小時(shí)。取下注射針頭，用預(yù)溫37℃含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗尼龍纖維柱，洗出者即為未黏附的T淋巴細(xì)胞。從注射器內(nèi)取出尼龍纖維，在4℃的RPMI-1640液內(nèi)漂洗，并輕輕擠壓，將黏附的B細(xì)胞洗脫收集（B淋巴細(xì)胞中混有的單核細(xì)胞可用貼壁法將其分離）。收集的T、B淋巴細(xì)胞可分別用Hanks液懸浮，洗滌，離心（250g，7min），并重復(fù)洗滌3次。計(jì)算活細(xì)胞，計(jì)數(shù)懸液中的細(xì)胞數(shù)后制備所需濃度的T和B淋巴細(xì)胞懸液。59具體步驟：11細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞免疫磁珠法(MACS)分離T、B淋巴細(xì)胞：

磁性微珠是20世紀(jì)80年代初以高分子材料和金屬離子（如Fe3O4）為原料聚合而成的一種以金屬離子為核心、外層均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁場(chǎng)的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠為載體，包被上針對(duì)某種細(xì)胞表面抗原的特異性抗體即可制成免疫磁性微珠。

60細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞免疫磁珠法(MACS)細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞

免疫磁性微珠用于細(xì)胞的分離和純化的基本原理及步驟是：首先將抗特異細(xì)胞表面抗原的抗體致敏到磁珠上，待它與混合體系中的細(xì)胞反應(yīng)后，利用磁力的作用，使與致敏結(jié)合的細(xì)胞與其它物質(zhì)分離，達(dá)到純化、分離的目的。通常有二種分離方式：陽(yáng)性分離和陰性分離。陽(yáng)性分離是直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞，陰性分離是利用磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞，使靶細(xì)胞得以分離。61細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞免疫磁性微珠用細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞

免疫磁珠分離細(xì)胞已被廣泛應(yīng)用于人類(lèi)各種細(xì)胞的分離，如T(CD3)、B(CD19)淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞(CD34)、造血祖細(xì)胞(CD34)、單核/巨噬細(xì)胞(CD14)、胰島細(xì)胞(胰島GK和GLUT2（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子）)、多種腫瘤細(xì)胞等。62細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞免疫磁珠分離細(xì)細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞63細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞15細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞64細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞16細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞65細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞17細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞MACS技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定、高質(zhì)量的分選：純度（90-99%）對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷操作簡(jiǎn)便、快速：消毒方便，手動(dòng)分選30分鐘內(nèi)完成，autoMACS分選2.5-10分鐘之內(nèi)完成。從實(shí)驗(yàn)室到臨床：MACS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)105-1011個(gè)細(xì)胞分選。有autoMACS和CliniMACS。分選后細(xì)胞適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)：分選后適用于細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，分選得到的標(biāo)記和未標(biāo)記細(xì)胞組分均可回收利用。從細(xì)胞到分子分選：不僅可以分選各種細(xì)胞，還可以分選轉(zhuǎn)染細(xì)胞、亞細(xì)胞物質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA、RNA及mRNA。66MACS技術(shù)缺點(diǎn)：分離效率較流式細(xì)胞儀分選略低且耗材相對(duì)較貴，適合無(wú)大型流式細(xì)胞儀設(shè)備且對(duì)分選細(xì)胞純度要求不高的分選。只適用于簡(jiǎn)單標(biāo)記的細(xì)胞分離細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞MACS技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：18細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分離法分離T、B淋巴細(xì)胞：密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基配成1×107/ml；加適量FITC-抗CD3或FITC-抗CD19，4℃孵育30min,用RPMI-1640培養(yǎng)基洗2次；用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。在散射光參數(shù)圖上選取淋巴細(xì)胞群，在熒光參數(shù)圖上選取綠色熒光陽(yáng)性的細(xì)胞進(jìn)行分選。67細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分離法分離T細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞注意事項(xiàng)：分選細(xì)胞常用于細(xì)胞亞群進(jìn)一步的功能研究，因此，整個(gè)過(guò)程均需要嚴(yán)格無(wú)菌操作，流式細(xì)胞儀進(jìn)行無(wú)菌沖洗。此法分離得到的T細(xì)胞純度可達(dá)到99%,收獲率可達(dá)到90%。由于噴嘴孔很?。s70～100μm），分選前用30～40μm孔徑的濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，以免堵塞噴嘴。68細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞注意事項(xiàng)：20細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞優(yōu)缺點(diǎn)：流式細(xì)胞儀分選純度較高、回收率高，分選一些具有比較復(fù)雜細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞時(shí)相當(dāng)有用的，例如要分選出白血病人骨髓中某些CD34+CD13-CD45dim的幼稚細(xì)胞，只需要在流式上簡(jiǎn)單地邏輯設(shè)門(mén)就可以了，而且流式可以雙通道分選，也就是同一時(shí)間分選出兩種細(xì)胞，流式分選成本比磁珠低。流式分選最致命的缺點(diǎn)就是污染，且設(shè)備昂貴，技術(shù)復(fù)雜，需專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作，操作費(fèi)時(shí)，適合對(duì)細(xì)胞純度和回收率要求較高的分選。69細(xì)胞分離技術(shù)--從血液、體液中分離細(xì)胞優(yōu)缺點(diǎn)：21細(xì)胞分離技術(shù)二、從原代組織中分離細(xì)胞組織和器官采集：人標(biāo)本：可采取無(wú)菌手術(shù)法切取少量所需的組織或器官（活檢和手術(shù)）。大量的動(dòng)物組織：先麻醉或處死，浸入70%酒精中，使毛皮全部浸濕，從腹中線剪開(kāi)皮膚，注意不要剪開(kāi)胸腔或腹腔。將皮膚向上、下撕開(kāi)分離并向上、下翻開(kāi)，暴露胸腹部的筋膜，用生理鹽水洗凈黏于筋膜上的斷毛，以碘酒和70%酒精消毒后，更換一套消毒滅菌的器械，剪開(kāi)胸腔或腹腔，無(wú)菌采取所需器官。動(dòng)物的骨髓：可以無(wú)菌手術(shù)采取一段股骨，用滅菌注射器，將小牛血清或培養(yǎng)液從斷端一端加壓注射以從另一斷端出骨髓。70細(xì)胞分離技術(shù)二、從原代組織中分離細(xì)胞22細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞制備細(xì)胞懸液方法：將組織塊分離（散）成細(xì)胞懸液的方法有多種，最常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法。從原代組織中獲得單細(xì)胞懸液的一般方法是酶解聚。細(xì)胞暴露在酶中的時(shí)間要盡可能的短，以保持最大的活性。包括胰蛋白酶、膠原酶和中性蛋白酶等。71細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞23細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞1.胰蛋白酶(Trypsin)

72在去除不需要的組織后，使用無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織塊，重復(fù)清洗2到3次。用無(wú)菌的解剖刀和剪子把組織切成1-2mm3小塊。將盛有組織碎片的容器置于冰上。加入0.25％溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml胰蛋白酶）。細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞1.胰蛋白酶(Tryp細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞

73在4℃孵育6到18小時(shí)，使胰蛋白酶盡可能滲透進(jìn)去移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘在組織碎片加入熱的完全培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無(wú)血清培養(yǎng)基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100-200目）過(guò)濾，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞

25在4℃孵育6細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞2.膠原酶(Collagenase)

74用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成1-2mm3小塊，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）

在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mMCaCl2增加解離效率

細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞2.膠原酶(Coll細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞75通過(guò)離心在HBSS中清洗懸液幾次

再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)

通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如需進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞27通過(guò)離心在HBSS中細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞3.中性蛋白酶(Dispase)76用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成1-2mm3小塊，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次加入Dispase（0.6～2.4單位/ml溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液）

在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞3.中性蛋白酶(Disp細(xì)胞分離技術(shù)77通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如需進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase

通過(guò)離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞分離技術(shù)29通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，分離細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞舉例（滑膜細(xì)胞的膠原酶－胰蛋白酶消化分離法

）:78無(wú)菌取滑膜組織，去除脂肪、纖維等

用D-Hank’s液（無(wú)Ca2+、Mg2+，含青霉素200kU·L-1、鏈霉素200mg·L-1）反復(fù)沖洗后剪成1~2mm3小塊，離心洗滌2次置于加入2ml含10%胎牛血清、0.4%Ⅱ型膠原酶的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化2h，每隔10min吹打1次。

細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞30無(wú)菌取滑膜組織，去除細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞79再加入含0.25%胰蛋白酶的D-Hank’s液4ml，培養(yǎng)消化30min

將培養(yǎng)液移至離心管中，1200rpm離心10min，棄上清

200目尼龍網(wǎng)紗過(guò)濾，1200rpm離心10min，棄上清

將獲得的細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄去未黏附細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞，紅細(xì)胞），此時(shí)的貼壁細(xì)胞即為原代滑膜細(xì)胞

細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞31再加入含0.25%胰細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞4.組織塊培養(yǎng)法舉例（成纖維樣滑膜細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法）：80無(wú)菌取滑膜組織，去除脂肪、纖維等，用不含鈣鎂的D-Hank’s液（含青霉素200kU·L-1、鏈霉素200mg·L-1）反復(fù)沖洗后剪成1~2mm3小塊用吸管吸取均勻排列于培養(yǎng)瓶（預(yù)先用含20％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液濕潤(rùn)）的底壁，瓶底朝上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h，使其貼壁細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞32無(wú)菌取滑膜組織，去除細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞81待細(xì)胞快長(zhǎng)滿時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，取第3~5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)觀察到有大量成纖維細(xì)胞長(zhǎng)出后輕輕去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液剛剛覆蓋組織塊，每隔2~3天換一次培養(yǎng)液細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞33待細(xì)胞快長(zhǎng)滿時(shí)用0.成纖維樣滑膜細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法82培養(yǎng)24h培養(yǎng)96h培養(yǎng)120h成纖維樣滑膜細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法34培養(yǎng)24h培養(yǎng)96h培養(yǎng)12細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞舉例（初步淋巴細(xì)胞分離法）：83放血處死動(dòng)物，無(wú)菌取胸腺和脾組織，去除脂肪和結(jié)締組織，放入盛有含5%小牛血清的D-Hank’s液（不含鈣鎂，含青霉素200kU·L-1、鏈霉素200mg·L-1）平皿的網(wǎng)紗中（200目）用注射器針芯輕輕碾碎胸腺和脾組織，使單個(gè)細(xì)胞經(jīng)網(wǎng)進(jìn)入溶液中溶液移入離心管中，1200rpm離心10min，棄上清，D-Hank’s液洗滌細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)液計(jì)數(shù)和調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞舉例（初步淋巴細(xì)胞分離法細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞舉例（乳鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)法）：基本原理：

心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法有離體心臟灌注法、酶消化法和組織塊法，將心肌組織分離成單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)基制成心肌細(xì)胞懸液，在體外適宜條件下使之生長(zhǎng)繁殖，并保留其結(jié)構(gòu)與功能特性。84細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞舉例（乳鼠原代心肌細(xì)胞培細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞評(píng)價(jià)：離體心臟灌注法對(duì)乳大鼠來(lái)說(shuō)實(shí)施難度大;酶消化法操作流程長(zhǎng)，細(xì)胞對(duì)消化酶濃度及作用時(shí)間要求嚴(yán)格，但是能得到大量單細(xì)胞；組織塊法操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)成本低，可得到具較高純度的心肌細(xì)胞。因此，心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)常用的方法多用酶消化法和組織塊法兩種。85細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞評(píng)價(jià)：37細(xì)胞分離技術(shù)--從原代組織中分離細(xì)胞心肌細(xì)胞的酶消化培養(yǎng)法：1.心肌組織的選擇：生后1~4天的Wistar乳鼠心臟等。2.心肌組織塊的制備：乳鼠用75%乙醇/1%新潔爾滅消毒皮膚，無(wú)菌開(kāi)胸，暴露心臟，于心臟收縮期剪下心臟，置于盛D-Hank’s液的培養(yǎng)皿中，剪開(kāi)心臟，清洗三次，以去除血污。86細(xì)胞分離技術(shù)--