基因工程與基因組學

關于基因工程與基因組學第一頁，共五十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)基因工程一、基因工程概述二、基因工程工具酶三、基因工程的流程及相關技術四、基因工程的發(fā)展應用第二頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、基因工程概述遺傳工程（geneticengineering），也稱生物工程，利用工程技術的方法改造和修飾生物體，使其產(chǎn)生新的性狀或產(chǎn)品，從而改良生物體的一種遺傳學手段。核心是利用重組DNA技術，在分子水平上操作修飾改變生物體遺傳結構?；蚬こ蹋╣eneengineering）：利用人工的方法把生物的遺傳物質(zhì)在體外進行切割、拼接和重組，獲得重組DNA分子，然后導入宿主細胞或個體，使受體的遺傳特性得到修飾或改變的過程。第三頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、基因工程的工具酶內(nèi)切核酸酶(endonuclease)DNA連接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease），也稱限制性酶(restrictionenzyme),能識別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，并在特定的位置將雙連DNA分子切斷。第四頁，共五十二頁，2022年，8月28日Eco

RⅠ

屬名種名菌株名序號（一）限制性核酸內(nèi)切酶第五頁，共五十二頁，2022年，8月28日常見內(nèi)切酶第六頁，共五十二頁，2022年，8月28日（二）DNA連接酶連接5’－磷酸和3’－OH，形成磷酸二酯鍵，封閉DNA雙鏈上的缺刻。如：

E·coliDNA連接酶

T4DNA連接酶第七頁，共五十二頁，2022年，8月28日

載體(vector)將外源DNA片段運送進宿主細胞(hostcell)進行擴增或表達的運載工具稱為載體。載體也是DNA分子。常用的載體有細菌質(zhì)粒、噬菌體、病毒等。經(jīng)改造的黏粒(cosmid)、噬粒(phagemid)都要經(jīng)過人工改造。細菌人工染色體（BAC）、酵母菌人工染色體（YAC）和人類人工染色體（HAC）第八頁，共五十二頁，2022年，8月28日λ噬菌體載體YAC（1Mb）第九頁，共五十二頁，2022年，8月28日載體的基本條件①有獨立的復制原點(ori)，能獨立地自我復制，而且能帶動外源DNA一起復制。②具有多種限制性酶的切點，用于連接外源DNA片段。③載體上的限制酶酶切位點對于任何一種限制酶來說只能有一個。④具有一個選擇標記基因。第十頁，共五十二頁，2022年，8月28日

獲得外源DNA片段（分）

限制性內(nèi)切酶切割外源DNA片段與載體（切）

外源DNA片段與載體連接（接）

重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細胞（轉(zhuǎn)）

重組子的篩選與鑒定（篩）

目的基因的確認與分析三、基因工程的流程及相關技術第十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日第十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日（一）外源DNA片段的分離方法構建基因組文庫分離法差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR利用聚合酶鏈式反應技術擴增目的基因第十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.構建基因組文庫分離法

用克隆載體將某種生物的基因組全部遺傳信息儲存于一個受體菌的群體，即構成了這種生物的基因組文庫。若只儲存某生物基因組的部分遺傳信息，即構成部分基因組文庫。供體生物的基因組DNA切割成許多片段將所有片段分別連接到載體上，構成一個重組DNA群體這個群體包含全基因組的遺傳信息。保存、篩選第十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日差別顯示分析基本流程2.差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT-PCR）第十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日3、利用聚合酶鏈式反應技術擴增目的基因（1）套式PCR（2）反向PCR（3）不對稱PCR（4）錨定PCR（5）長程PCR（6）反轉(zhuǎn)錄PCR第十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日4、人工合成基因根據(jù)已知的基因序列，或根據(jù)氨基酸序列推測DNA序列將化學合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結合起來，可以很快地人工合成基因。第十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日通過用相同的限制性核酸內(nèi)切酶切割，連接形成一個重組DNA分子（二）、外源DNA片段與載體的切割和連接第十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日（三）、重組DNA轉(zhuǎn)入宿主細胞1.重組DNA轉(zhuǎn)入原核細胞

熱激轉(zhuǎn)化法電穿孔轉(zhuǎn)化法2.重組DNA轉(zhuǎn)入真核細胞

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法第十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日重組DNA感受態(tài)細胞

冰浴混合、靜置42oC熱激加入培養(yǎng)基擴培轉(zhuǎn)化液涂含抗菌素的平板吸附DNA攝入DNA（1）熱激轉(zhuǎn)化法第二十頁，共五十二頁，2022年，8月28日感受態(tài)細胞

電轉(zhuǎn)儀調(diào)為2.5kV25F

脈沖控制器200-400

質(zhì)粒DNA

混合加入培養(yǎng)液37℃中速震蕩涂板（2）電穿孔轉(zhuǎn)化法第二十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.重組DNA轉(zhuǎn)入植物細胞農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法第二十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日（四）重組子的篩選與鑒定

核酸雜交PCR檢測測序生物學活性檢測1.插入抗性失活2.藍白斑篩選第二十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.插入失活篩選法第二十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日藍白斑篩選重組質(zhì)粒第二十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日四、基因工程的發(fā)展應用1、基因工程是生物科學基礎研究的重要手段2、利用轉(zhuǎn)基因技術改良植物已取得很大進展并在生產(chǎn)上應用3、利用基因工程獲得大量重組的蛋白、疫苗藥物4、利用基因工程進行不同物種之間的基因傳遞提供了可能。轉(zhuǎn)基因動植物--“生物工廠”5、疾病診斷與基因治療6、環(huán)境保護第二十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日第二十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日4.利用基因工程改良動物第二十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日

推薦幾本參考書：

1、《基因工程原理與方法》，孫樹漢編，人民軍醫(yī)出版社

2、《基因工程原理》，吳乃虎編，科學出版社（側(cè)重原理）

3、《現(xiàn)代基因工程技術導論》，陳章良編，科學出版社（側(cè)重應用）

4、《分子克隆》(第三版)，J.Sambrooketal.科學出版社（具體的實驗方法，分子生物學研究的圣經(jīng)）第二十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日第二節(jié)基因組學一、基因組學概述二、基因組圖譜的構建三、基因組圖譜的應用四、后基因組學第三十頁，共五十二頁，2022年，8月28日基因組(genome)泛指一個有生命體、病毒或細胞器的全部遺傳物質(zhì)；在真核生物，基因組是指一套染色體（單倍體）DNA。

一、基因組學概念及范疇基因組學(genomics)就是發(fā)展和應用DNA制圖、測序新技術以及計算機程序，分析生命體（包括人類）全部基因組結構及功能。第三十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日基因組學研究的最終目標獲得生物體全部基因組序列鑒定所有基因的功能明確基因之間的相互作用關系闡明基因組的進化規(guī)律

第三十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日基因組學研究內(nèi)容結構基因組學(structuralgenomics)

功能基因組學(functionalgenomics)

比較基因組學(comparativegenomics)第三十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日結構基因組學（structuralgenomics）

基因定位基因組作圖測定核苷酸序列第三十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日遺傳圖（連鎖圖）物理圖轉(zhuǎn)錄圖序列圖二、基因組圖譜的構建基因組計劃的第一個環(huán)節(jié)：構建基因組圖譜第三十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日1.遺傳圖

連鎖圖(linkagemap)，是指基因標志在染色體上的遺傳距離，即確定各基因在基因組中的相對位置和排列順序。遺傳距離通常由基因在四分體時期染色體交換過程中分離的頻率厘摩（cM）來表示。第三十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日遺傳標記（Geneticmarker）指可識別的等位基因。它具有兩個基本特征，即可遺傳性和可識別性，因此生物的任何有差異表型的基因突變型均可作為遺傳標記。類型：形態(tài)標記（morphologicalmarker）細胞學標記(cytologicalmarker)

生化標記(biochemicalmarker)

分子標記(molecularmarker)第三十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日第三十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日2.、物理圖

以已知核苷酸序列的DNA片斷（序列標簽位點,STS）為“路標”，以堿基對作為基本測量單位（圖距）的基因組圖。

DNA上兩點的實際距離，即確定基因在染色體上的實際排列順序，從而對基因定位。第三十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日3、轉(zhuǎn)錄圖

以EST（expressedsequencetag，表達序列標簽）為標記，根據(jù)轉(zhuǎn)錄順序的位置和距離繪制的圖譜。第四十頁，共五十二頁，2022年，8月28日4.、序列圖

序列圖是指整個人類基因組的核苷酸序列圖，也是最詳盡的物理圖，既包括可轉(zhuǎn)錄序列，也包括非轉(zhuǎn)錄序列，是轉(zhuǎn)錄序列、調(diào)節(jié)序列和功能未知序列的總和。

這是人類基因組計劃最繁重、耗時最多的工作。第四十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日CREDIT:JOESUTLIFFScience,Vol291:1221.FishinginaMoreEffectiveWay!第四十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日人類基因組計劃1990，美國國立衛(wèi)生研究所和能源部投資＄30億，啟動了人類基因組計劃，預計15年時間完成人類基因組全部序列的測定1996，完成標記密度為0.6cM的人類基因組遺傳圖譜，100kb的物理圖譜2000，完成草圖2001年2月，公布人類基因組圖譜的修訂版2002，完成測序工作第四十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日國際人類基因組測序協(xié)作組（公共計劃組）由6個國家、20個研究中心的2000多位科學工作者組成。國家承擔的測序任務美國54%英國33%日本7%法國2.8%德國2.2%中國1%第四十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日1999年9月中國獲準加入人類基因組計劃，負責測定人類基因組全部序列的1%，負責第3號染色體3千萬核苷酸的序列測定工作。中國是繼美、英、日、德、法之后第6個國際人類基因組計劃參與者，也是參與這一計劃的唯一發(fā)展中國家。第四十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日人類基因組計劃1%測序中國實驗室第四十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日2000年6月26日

科學家公布人類基因組工作草圖，標志著人類在解讀自身“生命之書”的路上邁出了重要一步。第四十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日HGP對人類基因面貌的新發(fā)現(xiàn)基因數(shù)量少得驚人人類基因組中存在“熱點”和大片“荒漠”三分之一為“垃圾”DNA種族歧視毫無根據(jù)男性基因突變比例更高第四十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日2000年是基因組之年，完成了人類基因組的工作框架圖，完成了一系列模式生物和微生物的基因組序列分析。

2000年12月美、英等國科學家宣布繪出擬南芥基因組的完整圖譜，這是人類首次全部破譯出一種植物的基因序列。第四十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日三、后基因組學（postgenomics)

完成一個生物體全部基因組測序后即進入功能基因組學階段，也稱后基因組階段——詳盡分析序列，