高效液相色譜分析課件

高效液相色譜的使用及其維護高效液相色譜的使用及其維護一液相色譜的發(fā)展史

早在古羅馬時期，人們就已經知道將一滴含有混合色素的溶液滴在一塊布或一張紙上，并通過觀察溶液的展開產生的一個個同心圓來分析染料和色素。100多年前，德國化學家就對古羅馬的這種方法做了改進，后來就發(fā)展成為今天的紙上色譜技術。經過幾十年的發(fā)展，到1941年就有人采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動相分離乙?；被幔@成為分配色譜的首次應用。

1960年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實踐》一書，標志著高效液相色譜法

(HPLC)正式建立。在此后的時間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學、生物化學、醫(yī)學、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。一液相色譜的發(fā)展史早在古羅馬時期二HPLC的原理及特點

色譜法是利用物質在兩相中吸附或分配系數(shù)的微小差異達到分離的目的。當兩相做相對移動時，被測物質在兩相間進行反復多次的分配，這樣使原來微小的分配差異產生了很大的效果，達到分離、分析及測定一些物理化學常數(shù)的目的。

必要條件：不同組分性質上的微小差別；

充分條件：不同組分在兩相之間進行的上千次或上百萬次質量交換。HPLC是在經典色譜法的基礎上，在技術上，流動相改為高壓輸送;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。

二HPLC的原理及特點色二HPLC的原理及特點

特點

高壓

高速

高效

高靈敏度

適應范圍寬而與氣象色譜相比，其最大得特點是可以分離不可揮發(fā)而具有一定溶解性的物質或受熱后不穩(wěn)定的物質二HPLC的原理及特點特點三液相色譜的分類按固定相形態(tài)分類按作用原理分離按物理特征分類固定相名稱原理名稱特征名稱液體液液色譜分配液液分配色譜平面狀固定相平面色譜固體液固色譜吸附液固吸附色譜紙固定相紙色譜分子大小凝膠或尺寸排阻色譜薄層固定相薄層色譜離子交換能力離子交換色譜顆粒固定相填充填充色譜親和力親和色譜色譜柱中空空心柱色譜電滲及電泳淌度電泳流動相采用高壓液體高壓液相色譜三液相色譜的分類按固定相形態(tài)分類按作用原理分離按物理特征四固定相

液固色譜的固定相一般為硅膠、氧化鋁等吸附劑。

溶質在柱中吸附劑上不斷進行吸附-解吸循環(huán)，由于不同的被測物在吸附劑上吸附作用的差異而獲得分離。溶質所帶官能團的性質是決定其吸附作用的主要因素，若溶質分子官能團的極性增強或數(shù)目增多，在使用極性吸附劑時，分子和極性吸附劑的總的相互作用加強，其相對吸附作用也增強，保留時間加長。四固定相而目前在高效液相色譜的應用中，有80%以上是化學鍵合固定相的色譜。

化學鍵合相是利用化學反應將有機分子鍵合到擔體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構成的。一般用硅膠作擔體，采用鍵合反應有酯化鍵合（Si-O-C）、硅烷化鍵合（Si-O-Si-C）和硅氮鍵合（Si-N）。

正相鍵合色譜最常用的是鍵合氰基、氨基、二醇基等極性基團的鍵合相，采用極性固定相、非極性或弱極性流動相，適合于中等極性樣品的分離。

反相鍵合色譜的固定相是非極性，通常擁有疏水的十八硅烷（ODS）或辛烷官能團。如鍵合C2，C4，C6，C8，C16，

C18，C22烷基和苯基等非極性基團的固定相。

而目前在高效液相色譜的應用中，有8五流動相流動相對樣品有一定的溶解能力，保證組分不會沉淀在柱中或長

時間保留在柱中；溶劑要有一定的化學穩(wěn)定性,不與固定相和樣品組分起反應；溶劑的粘度要低，以便得到好的分離效果；降低柱壓，延長泵的使用壽命；溶劑應與檢測器兼容性好，不影響檢測器正常工作；樣品易于回收、易于得到純品、毒性低等特征；保證該色譜系統(tǒng)的分離過程可重復進行；溶劑的沸點低，有利于制備色譜的樣品回收，但不宜過低，否則易產生氣泡。從實用角度考慮，溶劑應當價格低廉，容易購得，使用安全。

五流動相

正相色譜中，流動相與固定相間的相互作用越強，溶質吸附就越弱，反之亦然。也就是說流動相強度增大，洗脫能力增強。一般采用乙烷、庚烷、異辛烷、苯和二甲苯等有機溶劑作為流動相，有時還加入一定量的四氫呋喃等極性溶劑，即采用多元流動相的分離模式。

反相色譜中，常用洗脫劑有水、乙腈、甲醇和四氫呋喃等。洗脫強度的強弱順序為：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷。溶劑的極性隨溶劑強度的增加而降低。

正相色譜中，流動相與固定相間的相互作用越強，溶六液相色譜柱

色譜柱的構造

高效液相色譜柱通常用能耐80MPa(816atm)，內徑均勻的優(yōu)質不銹鋼制成，包括柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板、接頭、螺絲等。

色譜柱的類型：分析型和制備型常規(guī)分析柱(常量柱)，內徑2-5mm(常用4.6mm，國內有4mm和5mm)，長度200-250mm，填料通常為3-10μm。窄徑柱，又稱細管徑柱、半微柱，內徑1-2mm,柱長10-20cm;毛細管柱(又稱微柱)，內徑0.2-0.5mm；半制備柱，內徑>5mm；實驗室制備柱，內徑20-40rnm，柱長10-30cm;生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。

六液相色譜柱色譜柱的構造

色譜柱的維護避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩；進樣前檢查色譜系統(tǒng)的各個接頭看是否有漏液現(xiàn)象；不要把柱接頭上得太緊，以免損壞接頭螺紋；一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效；柱子不應放在有氣流和陽光照射的地方，氣流和陽光都會使柱子產生溫度梯度而造成基線漂移；不要使其碰撞，以免柱床因震動產生空隙或通道。色譜柱的維護反相色譜柱應將柱內充滿乙腈或甲醇來保存，通常用20倍柱體積（50-60ml）沖洗。柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間；柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5-30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。反相色譜柱應將柱內充滿乙腈或甲醇來保存，通常用20倍柱體六HPLC的使用與維護流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質和其他物質(使用0.45um或更細的膜過濾)。

流動相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應該恢復到室溫后使用。使用緩沖鹽溶液為流動相時，做完樣品后應立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時，以免鹽類堵塞柱子與管路；然

后用甲醇沖洗40分鐘以上，以充分沖洗柱子。絕對禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間；對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水緩慢沖洗20ml以上。不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導致泵不進液長時間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用甲醇等有機溶劑，因為純水易長霉。

六HPLC的使用與維護流動相必須用HPLC級的試劑，使每次做完樣品后應該用溶解樣品的溶劑清洗進樣器，再以水清洗。C18柱絕對不能進蛋白樣品，血樣、生物樣品。堵塞導致壓力太大，按柱子→預柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗。要注意柱子的PH值范圍（2-8），不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。更換流動相時要先將流速降到零，不要在有流速的狀態(tài)下將濾頭置于空氣中；另外更換時應先將濾頭部分沖洗或放入燒杯中邊振動邊清洗，然后插入新的

流動相中。更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下。高效液相色譜分析課件每次開機時，流速與柱壓要逐漸增加。尤其是用兩種流動相時，可以考慮在低于預設流速的狀態(tài)下平衡一段時間，因為兩相混合會有一個高壓，直接升到較高流速，泵會因壓力過高而停止運行。每次開機時可以先沖洗一下管路或柱前部分，除去上次使用殘留在管路中的流動相，這樣可以防止殘留液對柱子的污染，還可縮短平衡基線的時間。如果管路中有氣泡要先用注射器抽除，以免氣泡進入泵或柱子中。進樣閥在進樣過程中，必須是非常清潔的，否則得不到較好的結果。

在沖洗管路時進樣閥切換到進樣位置后，在此位置保持一段時間，使流動相充分沖洗樣品定量管，這樣可以保證有較高的精確度，而且不用另外再沖洗樣品定量管每次開機時，流速與柱壓要逐漸增加。尤其是用兩種流動相時，可以七HPLC的使用常見問題

柱壓過高，可能是流速定位過高、泵出口過濾器堵塞、柱頭雜質堵塞或柱前過濾塞堵塞，應逐一檢查確定堵塞的地方，再沖洗，有時需拆下過濾器超聲清洗。

柱壓波動，泵或柱中有氣泡、高壓系統(tǒng)有泄漏或單向閥被污染，部分堵塞。檢查是否泄漏、單向閥是否有問題，若有則應及時清洗或更換單向閥。若有氣泡，就purge10到15分鐘。

泵不吸液，可能是泵中有氣泡、流動相濾頭被污染或單向閥堵塞

，使用注射器吸液，通常在輸液前要進行流動相的清洗。若不行就通過排除氣泡和清洗濾篩來解決問題。

進樣后不出峰，可能檢測器選擇不當、試液濃度太低、檢測器到記錄儀之間輸入信號斷開或樣品未能進入進樣閥。

七HPLC的使用常見問題柱壓過高，可能是流速定位過高、

出現(xiàn)負峰，用示差檢測器時，樣品的折光指數(shù)小于流動相溶劑的折光指數(shù)；或流動相不純凈；用UV檢測器時，溶解樣品的溶劑與流動相溶劑不能互溶或PH值不同，當光在兩種互不相溶的溶劑界面產生折射，從而使光電池受到不同強度的光，光強度減弱，以至于低于參比而出現(xiàn)負峰。

樣品前處理，最好使用流動相溶解樣品，用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質；進樣前清洗進樣針和進樣閥。

剩余流動相的處理，有機相要是高純的，用完了剩下的密封起來就行了，時間不限；水相或者緩沖鹽的，最多放48小時，再用不完就應廢棄；有機相和水相混合的有機相超過50％的用剩下的可以4度保持，但最多一周。此外，流動相一定要貼標簽注明出現(xiàn)負峰，用示差檢測器時，樣品的折光指數(shù)小于流動相溶劑的感謝您的關注感謝您的關注高效液相色譜的使用及其維護高效液相色譜的使用及其維護一液相色譜的發(fā)展史

早在古羅馬時期，人們就已經知道將一滴含有混合色素的溶液滴在一塊布或一張紙上，并通過觀察溶液的展開產生的一個個同心圓來分析染料和色素。100多年前，德國化學家就對古羅馬的這種方法做了改進，后來就發(fā)展成為今天的紙上色譜技術。經過幾十年的發(fā)展，到1941年就有人采用水分飽和的硅膠為固定相，以含有乙醇的氯仿為流動相分離乙?；被幔@成為分配色譜的首次應用。

1960年代末科克蘭、哈伯、荷瓦斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實踐》一書，標志著高效液相色譜法

(HPLC)正式建立。在此后的時間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學、生物化學、醫(yī)學、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應用。一液相色譜的發(fā)展史早在古羅馬時期二HPLC的原理及特點

色譜法是利用物質在兩相中吸附或分配系數(shù)的微小差異達到分離的目的。當兩相做相對移動時，被測物質在兩相間進行反復多次的分配，這樣使原來微小的分配差異產生了很大的效果，達到分離、分析及測定一些物理化學常數(shù)的目的。

必要條件：不同組分性質上的微小差別；

充分條件：不同組分在兩相之間進行的上千次或上百萬次質量交換。HPLC是在經典色譜法的基礎上，在技術上，流動相改為高壓輸送;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。

二HPLC的原理及特點色二HPLC的原理及特點

特點

高壓

高速

高效

高靈敏度

適應范圍寬而與氣象色譜相比，其最大得特點是可以分離不可揮發(fā)而具有一定溶解性的物質或受熱后不穩(wěn)定的物質二HPLC的原理及特點特點三液相色譜的分類按固定相形態(tài)分類按作用原理分離按物理特征分類固定相名稱原理名稱特征名稱液體液液色譜分配液液分配色譜平面狀固定相平面色譜固體液固色譜吸附液固吸附色譜紙固定相紙色譜分子大小凝膠或尺寸排阻色譜薄層固定相薄層色譜離子交換能力離子交換色譜顆粒固定相填充填充色譜親和力親和色譜色譜柱中空空心柱色譜電滲及電泳淌度電泳流動相采用高壓液體高壓液相色譜三液相色譜的分類按固定相形態(tài)分類按作用原理分離按物理特征四固定相

液固色譜的固定相一般為硅膠、氧化鋁等吸附劑。

溶質在柱中吸附劑上不斷進行吸附-解吸循環(huán)，由于不同的被測物在吸附劑上吸附作用的差異而獲得分離。溶質所帶官能團的性質是決定其吸附作用的主要因素，若溶質分子官能團的極性增強或數(shù)目增多，在使用極性吸附劑時，分子和極性吸附劑的總的相互作用加強，其相對吸附作用也增強，保留時間加長。四固定相而目前在高效液相色譜的應用中，有80%以上是化學鍵合固定相的色譜。

化學鍵合相是利用化學反應將有機分子鍵合到擔體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構成的。一般用硅膠作擔體，采用鍵合反應有酯化鍵合（Si-O-C）、硅烷化鍵合（Si-O-Si-C）和硅氮鍵合（Si-N）。

正相鍵合色譜最常用的是鍵合氰基、氨基、二醇基等極性基團的鍵合相，采用極性固定相、非極性或弱極性流動相，適合于中等極性樣品的分離。

反相鍵合色譜的固定相是非極性，通常擁有疏水的十八硅烷（ODS）或辛烷官能團。如鍵合C2，C4，C6，C8，C16，

C18，C22烷基和苯基等非極性基團的固定相。

而目前在高效液相色譜的應用中，有8五流動相流動相對樣品有一定的溶解能力，保證組分不會沉淀在柱中或長

時間保留在柱中；溶劑要有一定的化學穩(wěn)定性,不與固定相和樣品組分起反應；溶劑的粘度要低，以便得到好的分離效果；降低柱壓，延長泵的使用壽命；溶劑應與檢測器兼容性好，不影響檢測器正常工作；樣品易于回收、易于得到純品、毒性低等特征；保證該色譜系統(tǒng)的分離過程可重復進行；溶劑的沸點低，有利于制備色譜的樣品回收，但不宜過低，否則易產生氣泡。從實用角度考慮，溶劑應當價格低廉，容易購得，使用安全。

五流動相

正相色譜中，流動相與固定相間的相互作用越強，溶質吸附就越弱，反之亦然。也就是說流動相強度增大，洗脫能力增強。一般采用乙烷、庚烷、異辛烷、苯和二甲苯等有機溶劑作為流動相，有時還加入一定量的四氫呋喃等極性溶劑，即采用多元流動相的分離模式。

反相色譜中，常用洗脫劑有水、乙腈、甲醇和四氫呋喃等。洗脫強度的強弱順序為：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷。溶劑的極性隨溶劑強度的增加而降低。

正相色譜中，流動相與固定相間的相互作用越強，溶六液相色譜柱

色譜柱的構造

高效液相色譜柱通常用能耐80MPa(816atm)，內徑均勻的優(yōu)質不銹鋼制成，包括柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板、接頭、螺絲等。

色譜柱的類型：分析型和制備型常規(guī)分析柱(常量柱)，內徑2-5mm(常用4.6mm，國內有4mm和5mm)，長度200-250mm，填料通常為3-10μm。窄徑柱，又稱細管徑柱、半微柱，內徑1-2mm,柱長10-20cm;毛細管柱(又稱微柱)，內徑0.2-0.5mm；半制備柱，內徑>5mm；實驗室制備柱，內徑20-40rnm，柱長10-30cm;生產制備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應。

六液相色譜柱色譜柱的構造

色譜柱的維護避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節(jié)流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩；進樣前檢查色譜系統(tǒng)的各個接頭看是否有漏液現(xiàn)象；不要把柱接頭上得太緊，以免損壞接頭螺紋；一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效；柱子不應放在有氣流和陽光照射的地方，氣流和陽光都會使柱子產生溫度梯度而造成基線漂移；不要使其碰撞，以免柱床因震動產生空隙或通道。色譜柱的維護反相色譜柱應將柱內充滿乙腈或甲醇來保存，通常用20倍柱體積（50-60ml）沖洗。柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內靜置過夜或更長時間；柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5-30mm），可以起到保護、延長柱壽命的作用。反相色譜柱應將柱內充滿乙腈或甲醇來保存，通常用20倍柱體六HPLC的使用與維護流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質和其他物質(使用0.45um或更細的膜過濾)。

流動相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應該恢復到室溫后使用。使用緩沖鹽溶液為流動相時，做完樣品后應立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時，以免鹽類堵塞柱子與管路；然

后用甲醇沖洗40分鐘以上，以充分沖洗柱子。絕對禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間；對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水緩慢沖洗20ml以上。不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導致泵不進液長時間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用甲醇等有機溶劑，因為純水易長霉。

六HPLC的使用與維護流動相必須用HPLC級的試劑，使每次做完樣品后應該用溶解樣品的溶劑清洗進樣器，再以水清洗。C18柱絕對不能進蛋白樣品，血樣、生物樣品。堵塞導致壓力太大，按柱子→預柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗。要注意柱子的PH值范圍（2-8），不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。更換流動相時要先將流速降到零，不要在有流速的狀態(tài)下將濾頭置于空氣中；另外更換時應先將濾頭部分沖洗或放入燒杯中邊振動邊清洗，然后插入新的

流動相中。更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下。高效液相色譜分析課件每次開機時，流速與柱壓要逐漸增加。尤其是用兩種流動相時，可以考慮在低于預設流速