細(xì)胞工程制藥

06細(xì)胞工程制藥S1動(dòng)物細(xì)胞制藥概述S2動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)S3動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景S4植物細(xì)胞制藥S1動(dòng)物細(xì)胞制藥概述細(xì)胞與細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程應(yīng)用于制藥細(xì)胞與細(xì)胞工程1665年，Hooke發(fā)現(xiàn)死細(xì)胞的細(xì)胞壁1674年，Leeuwenhoek首次觀察到活細(xì)胞1838&1839年，Schleiden&Schwann獨(dú)立提出了“細(xì)胞學(xué)說(shuō)”

——細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)細(xì)胞與細(xì)胞工程細(xì)胞工程：是以細(xì)胞為單位，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的地進(jìn)行設(shè)計(jì)和操作，使細(xì)胞獲得新的遺傳特性，并在離體條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)和增殖，生產(chǎn)所需產(chǎn)品。動(dòng)物細(xì)胞工程：就是指按照人們預(yù)定的設(shè)計(jì)，根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)及工程學(xué)原理定向改造動(dòng)物細(xì)胞的遺傳性，并用于生產(chǎn)相關(guān)產(chǎn)品。細(xì)胞與細(xì)胞工程直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操作：1、細(xì)胞水平：細(xì)胞融合、胚胎移植、

單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

人工受精、試管嬰兒技術(shù)

2、亞細(xì)胞水平：核移植、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移3、染色體水平：染色體轉(zhuǎn)移、改造4、基因水平：基因轉(zhuǎn)移、改造動(dòng)物細(xì)胞工程應(yīng)用于制藥1949年，Enders的一篇報(bào)告，為以后采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗奠定了基礎(chǔ)隨著基因工程的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到許多基因工程產(chǎn)物翻譯后的修飾、正確的切割、折疊的必要性，——?jiǎng)游锛?xì)胞成為一種重要的宿主細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞工程應(yīng)用于制藥目前，動(dòng)物細(xì)胞已用于生產(chǎn)疫苗、干擾素、白細(xì)胞介素、EPO等各種基因工程藥物大腸桿菌：表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物有18種，都是結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單、分子量較小的蛋白質(zhì)，主要為細(xì)胞因子類藥物。酵母：表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物有8種，表達(dá)的蛋白可以正確折疊，分子量較大、結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。哺乳動(dòng)物細(xì)胞：表達(dá)或生產(chǎn)的生物技術(shù)藥物有53種，都是分子量大、二硫鍵多、空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖蛋白。動(dòng)物細(xì)胞工程應(yīng)用于制藥目前，動(dòng)物細(xì)胞已用于生產(chǎn)疫苗、干擾素、白細(xì)胞介素、EPO等各種基因工程藥物美國(guó)FDA在2000年后批準(zhǔn)的創(chuàng)新生物技術(shù)藥物，用大腸桿菌表達(dá)的產(chǎn)品只有4種，用酵母表達(dá)的只有2種，而通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的產(chǎn)品則有22種。哺乳動(dòng)物細(xì)胞已成為生物技術(shù)藥物最重要的表達(dá)或生產(chǎn)系統(tǒng)，這種局面仍將持續(xù)并且其所占比例有逐年擴(kuò)大趨勢(shì)。動(dòng)物細(xì)胞工程應(yīng)用于制藥另一個(gè)方向：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥（天然的生物反應(yīng)器）07轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物制藥S2動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法動(dòng)物細(xì)胞的形形態(tài)動(dòng)物細(xì)胞的形形態(tài)按照生長(zhǎng)時(shí)的的貼壁性，細(xì)細(xì)胞可分為：：貼壁細(xì)胞懸浮細(xì)胞兼性貼壁細(xì)胞胞貼壁細(xì)胞貼附在支持物物表面生長(zhǎng)，，需貼附因子1、成纖維樣細(xì)細(xì)胞型（fibroblast-likecelltype）——來(lái)源于中胚層組織的細(xì)胞如：成纖維細(xì)胞心肌細(xì)胞平滑滑肌肌細(xì)細(xì)胞胞成骨骨細(xì)細(xì)胞胞貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞懸浮浮細(xì)細(xì)胞胞兼性性貼貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞呈梭梭形形或或不不規(guī)規(guī)則則的的三三角角形形中央央有有圓圓形形核核胞質(zhì)質(zhì)向向外外伸伸出出2-3個(gè)突起起———細(xì)胞胞群群常常借借助助這這些些突突起起連連接接成成網(wǎng)網(wǎng)，，生生長(zhǎng)長(zhǎng)時(shí)時(shí)呈呈放放射射狀狀、、漩漩渦渦狀狀或或火火焰焰狀狀貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞懸浮浮細(xì)細(xì)胞胞兼性性貼貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞1、成成纖纖維維樣樣細(xì)細(xì)胞胞型型貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞貼附附在在支支持持物物表表面面生生長(zhǎng)長(zhǎng)，，需需貼附附因因子子2、上上皮皮樣樣細(xì)細(xì)胞胞型型（epithelium-likecelltype）———來(lái)源源于于外胚胚層層和和內(nèi)內(nèi)胚胚層層組織織的的細(xì)細(xì)胞胞如：：皮膚膚細(xì)細(xì)胞胞腸管管上上皮皮細(xì)細(xì)胞胞肺泡泡上上皮皮細(xì)細(xì)胞胞貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞懸浮浮細(xì)細(xì)胞胞兼性性貼貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞呈扁扁平平的的不不規(guī)規(guī)則則多多角角形形中央央也也有有圓圓形形核核生長(zhǎng)長(zhǎng)時(shí)時(shí)彼彼此此緊緊密密連連接接成成單細(xì)細(xì)胞胞層層貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞懸浮浮細(xì)細(xì)胞胞兼性性貼貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞2、上上皮皮樣樣細(xì)細(xì)胞胞型型貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞貼附附在在支支持持物物表表面面生生長(zhǎng)長(zhǎng)，，需需貼附附因因子子1、成成纖纖維維樣樣細(xì)細(xì)胞胞型型（（FLCtype）2、上上皮皮樣樣細(xì)細(xì)胞胞型型（（ELCtype）———細(xì)胞胞形形態(tài)態(tài)不不是是絕絕對(duì)對(duì)的的，，隨隨培培養(yǎng)養(yǎng)條條件件變變化化貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞懸浮浮細(xì)細(xì)胞胞兼性性貼貼壁壁細(xì)細(xì)胞胞懸浮浮細(xì)細(xì)胞胞生長(zhǎng)長(zhǎng)不不依依賴賴支支持持物物表表面面，，可可在在培培養(yǎng)養(yǎng)液液中中懸懸浮浮生生長(zhǎng)長(zhǎng)，，細(xì)胞胞呈呈圓圓形形例如如：：血血液液內(nèi)內(nèi)的的淋巴巴細(xì)細(xì)胞胞、用于生產(chǎn)干干擾素的Namalwa細(xì)胞等貼壁細(xì)胞懸浮細(xì)胞兼性貼壁細(xì)胞胞兼性貼壁細(xì)胞胞不嚴(yán)格依賴支支持物，貼附生長(zhǎng)時(shí)：：呈上皮或成纖纖維細(xì)胞的形形狀懸浮生長(zhǎng)時(shí)：：呈圓形例如：中國(guó)倉(cāng)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞胞（CHO）（chinesehamsterovary）貼壁細(xì)胞懸浮細(xì)胞兼性貼壁細(xì)胞胞CHO-K1貼壁細(xì)胞懸浮細(xì)胞兼性貼壁細(xì)胞胞兼性貼壁細(xì)胞胞原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞系系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系通過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化化過(guò)程形成異異倍體轉(zhuǎn)化：自發(fā)（多見于于嚙齒動(dòng)物））、人工誘發(fā)發(fā)（病毒或化化學(xué)試劑）、、利用腫瘤組組織特點(diǎn)：具有無(wú)限增殖殖的能力，倍增時(shí)間較較短，對(duì)培養(yǎng)養(yǎng)條件和生長(zhǎng)長(zhǎng)因子等要求求較低，更適合大規(guī)模模工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)的需要S2動(dòng)物細(xì)胞的培培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞的形形態(tài)和生理特點(diǎn)點(diǎn)生產(chǎn)用動(dòng)物物細(xì)胞的獲獲得動(dòng)物細(xì)胞的的培養(yǎng)條件件動(dòng)物細(xì)胞培培養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞大大規(guī)模培養(yǎng)養(yǎng)的方法動(dòng)物細(xì)胞的的生理特點(diǎn)點(diǎn)1、分裂周期期長(zhǎng)：12-48hG1期（DNA合成前期））：4-5hS期（DNA合成期）：：6-8hG2期（DNA合成后期））：2-5hM期（細(xì)胞分裂裂期）：僅僅0.5-1h動(dòng)物細(xì)胞的的生理特點(diǎn)點(diǎn)2、一般需貼貼附于基質(zhì)質(zhì)，并有接接觸抑制現(xiàn)現(xiàn)象貼附生長(zhǎng)：：電荷作用、、鈣鎂離子子、貼附因因子（如膠膠原、纖維維結(jié)合蛋白白）接觸抑制：：在基質(zhì)上分分裂增殖，，每個(gè)細(xì)胞胞都與其周周圍的細(xì)胞胞相互接觸觸時(shí)，細(xì)胞胞就停止增增殖；但是當(dāng)細(xì)胞胞轉(zhuǎn)化為異倍體后，接觸抑抑制現(xiàn)象消消失動(dòng)物細(xì)胞的的生理特點(diǎn)點(diǎn)3、正常二倍倍體細(xì)胞的的生長(zhǎng)壽命命有限幾個(gè)概念原代培養(yǎng)：：次代培養(yǎng)：：直接從組織織中分散的的細(xì)胞進(jìn)行行培養(yǎng)將原代培養(yǎng)養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到到新鮮培養(yǎng)養(yǎng)基上培養(yǎng)養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的的生理特點(diǎn)點(diǎn)3、正常二倍倍體細(xì)胞的的生長(zhǎng)壽命命有限有限細(xì)胞系系：無(wú)限細(xì)胞系系：由原代培養(yǎng)養(yǎng)產(chǎn)生，只只能進(jìn)行有有限的傳代代，決定于于細(xì)胞來(lái)源源的種族和和年齡細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化后后變成異倍體，具有無(wú)限增增殖的能力，，適合于工業(yè)業(yè)化生產(chǎn)細(xì)胞系：由原代培養(yǎng)產(chǎn)產(chǎn)生的、或轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的細(xì)細(xì)胞群動(dòng)物細(xì)胞的生生理特點(diǎn)4、對(duì)周圍環(huán)境境十分敏感對(duì)各種物理化化學(xué)因素（如滲透壓、、PH、離子濃度、、剪切力、微微量元素等））的變化耐受力力很弱原因：沒(méi)有細(xì)胞壁，影響脂質(zhì)和和蛋白質(zhì)分子子的因素都會(huì)會(huì)影響細(xì)胞膜膜，并影響動(dòng)動(dòng)物細(xì)胞的存存活動(dòng)物細(xì)胞的生生理特點(diǎn)5、對(duì)培養(yǎng)基的的要求高需要葡萄糖作作為碳源、12種必需氨基酸酸、8種以上維生素素、多種無(wú)機(jī)機(jī)鹽和微量元元素需要多種細(xì)胞胞生長(zhǎng)因子和貼壁因子等才能生長(zhǎng)，，且隨細(xì)胞種類的的不同而不同同動(dòng)物細(xì)胞的生生理特點(diǎn)6、蛋白質(zhì)的合合成途徑和修修飾功能與細(xì)細(xì)菌不同游離核糖體——胞內(nèi)蛋白粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核核糖體——胞外或膜蛋白白，且多經(jīng)糖基化化S2動(dòng)物細(xì)胞的培培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞的形形態(tài)和生理特特點(diǎn)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)細(xì)胞的獲得動(dòng)物細(xì)胞的培培養(yǎng)條件動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)規(guī)模培養(yǎng)的方方法生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)細(xì)胞的獲得原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞系系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系原代細(xì)胞直接取自動(dòng)物組織織、器官——制成細(xì)胞懸液液不能完全形成成單細(xì)胞，且某一組織織常由多種細(xì)細(xì)胞組成生產(chǎn)中需要大大量的動(dòng)物，，費(fèi)錢，費(fèi)勞勞力常用：雞胚細(xì)細(xì)胞、兔腎或或鼠腎細(xì)胞、、血液淋巴細(xì)細(xì)胞二倍體細(xì)胞系系從原代細(xì)胞純化出一定的細(xì)胞胞株具有明顯的貼貼壁依賴和接接觸抑制的特特性有限的增殖能能力，50代無(wú)致瘤性一般均從動(dòng)物物的胚胎組織織中獲得，如如：WI-38、MRC-5、2BSMRC-5轉(zhuǎn)化細(xì)胞系通過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化化過(guò)程形成異倍體轉(zhuǎn)化：自發(fā)（多見于于嚙齒動(dòng)物））、人工誘發(fā)發(fā)（病毒或化化學(xué)試劑）、、利用腫瘤組組織特點(diǎn)：具有無(wú)限增殖殖的能力，倍增時(shí)間較較短，對(duì)培養(yǎng)養(yǎng)條件和生長(zhǎng)長(zhǎng)因子等要求求較低，更適合大規(guī)模模工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)的需要常見：Namalwa、CHO-K1、BHK-21、VeroCHO-K1BHK-21uninfectedinfectedS2動(dòng)物細(xì)胞的培培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞的形形態(tài)和生理特特點(diǎn)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)細(xì)胞的獲得動(dòng)物細(xì)胞的培培養(yǎng)條件動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)規(guī)模培養(yǎng)的方方法動(dòng)物細(xì)胞的培培養(yǎng)條件1、器材的清洗洗和消毒2、保證良好的的水質(zhì)3、PH值去除有害因子子，防污染經(jīng)特殊處理最適為7.2-7.4；使用緩沖體系系動(dòng)物細(xì)胞的培培養(yǎng)條件4、滲透壓5、溫度6、空氣最適290-300mOsm/kg；NaCl調(diào)節(jié)；平衡鹽鹽最適370.5oC足夠的氧氣；；常采用不同比比例的O2、N2、CO2和空氣S2動(dòng)物細(xì)胞的培培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞的形形態(tài)和生理特特點(diǎn)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)細(xì)胞的獲得動(dòng)物細(xì)胞的培培養(yǎng)條件動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)規(guī)模培養(yǎng)的方方法動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基基天然培養(yǎng)基早期階段：多多采用天然培培養(yǎng)基常用：血漿凝凝塊、血清、淋巴液液、胚胎浸液、、羊水、腹水等缺點(diǎn)：1、培養(yǎng)基成分分復(fù)雜，組分分不穩(wěn)定，2、來(lái)源有限——因此不適合大大量培養(yǎng)和生生產(chǎn)的需要合成培養(yǎng)基1950年，Morgan等首先采用成分明確的化學(xué)試劑配配制培養(yǎng)基，，開創(chuàng)了合成成培養(yǎng)基的研研究使用階段段優(yōu)點(diǎn)：成分明明確，組分穩(wěn)穩(wěn)定，可大量量生產(chǎn)供應(yīng)組成：糖類、、氨基酸、維維生素、無(wú)機(jī)機(jī)鹽、核酸前前體等尚需添加成分分：動(dòng)物血清（如5-10%的小牛血清））合成培養(yǎng)基可能的機(jī)制：：1、提供有利于于細(xì)胞生長(zhǎng)所所需的各種生生長(zhǎng)因子和激激素2、提供有利于于細(xì)胞貼壁所所需的貼附因因子和延伸因因子3、提供可識(shí)別別金屬、激素素、維生素和和脂類的結(jié)合合蛋白4、提供細(xì)胞生生長(zhǎng)所必需的的脂肪酸和微微量元素5、提供良好的的緩沖體系無(wú)血清培養(yǎng)基基無(wú)血清培養(yǎng)基基：在合成培養(yǎng)基基（未添加動(dòng)動(dòng)物血清）內(nèi)內(nèi)加入不同種種類的添加劑劑：1、激素和生長(zhǎng)長(zhǎng)因子：如胰島素——促進(jìn)糖原和脂脂肪酸合成，，并刺激細(xì)胞胞生長(zhǎng)2、結(jié)合蛋白：：如鐵傳遞蛋白白和白蛋白；；為了便于純純化，可改用用硫酸亞鐵、、檸檬酸鐵、、葡萄糖酸鐵鐵3、貼附因子和和延伸因子4、其他有利于于細(xì)胞生長(zhǎng)的的因子和元素素?zé)o血清培養(yǎng)基基無(wú)血清培養(yǎng)基基的優(yōu)點(diǎn)：1、提高了細(xì)胞培培養(yǎng)的可重復(fù)復(fù)性，避免了了由于血清批批次間差異的的影響2、減少了由血清清帶來(lái)的病毒毒、真菌和支支原體等微生生物污染3、避免了血清中中某些因素對(duì)對(duì)有些細(xì)胞的的毒性4、減少了血清中中蛋白對(duì)某些些生物測(cè)定的的干擾，便于于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的的分析5、供應(yīng)充足、穩(wěn)穩(wěn)定，產(chǎn)品易易于純化S2動(dòng)物細(xì)胞的培培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞的形形態(tài)和生理特特點(diǎn)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)細(xì)胞的獲得動(dòng)物細(xì)胞的培培養(yǎng)條件動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)規(guī)模培養(yǎng)的方方法動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)規(guī)模培養(yǎng)的方方法懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)適用：所有非貼壁依依賴性細(xì)胞和和兼性貼壁細(xì)細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件比比較均一，傳傳質(zhì)和傳氧較較好，容易擴(kuò)擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模模，在培養(yǎng)設(shè)設(shè)備的設(shè)計(jì)和和實(shí)際操作中中可借鑒許多多有關(guān)細(xì)菌發(fā)發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)不足：細(xì)胞密度較低低懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)設(shè)備：通氣攪拌罐式式生物反應(yīng)器器懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)類似于細(xì)菌發(fā)發(fā)酵罐，但由由于動(dòng)物細(xì)胞胞的特性，具具體要求又有有所不同：1）低速攪拌：：20-100rpm2）高徑比?。海?-1.5：1（微生物：2-3：1）3）無(wú)氣泡通氣氣系統(tǒng)懸浮培養(yǎng)設(shè)備：氣升式生物器器（AirliftBioreactor）懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)設(shè)備：攪拌瓶（spinnerflask）簡(jiǎn)易的實(shí)驗(yàn)室室規(guī)模，最大大10L懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)小常識(shí)：培養(yǎng)規(guī)模的劃劃分實(shí)驗(yàn)室規(guī)模（（labscale）中試規(guī)模（pilotscale）生產(chǎn)規(guī)模（industrialscale）<20L：培養(yǎng)工藝的研研究20-100L：進(jìn)一步優(yōu)化工工藝，純化、、臨床前研究究>100L：生產(chǎn)和提供產(chǎn)產(chǎn)品這種劃分不是是絕對(duì)的，還還需根據(jù)細(xì)胞胞的產(chǎn)量和臨臨床用藥劑量量的大小而定定。貼壁培養(yǎng)適用：所有貼壁細(xì)胞胞和兼性貼壁壁細(xì)胞優(yōu)缺點(diǎn)恰好與與懸浮培養(yǎng)相相反貼壁培養(yǎng)與懸懸浮培養(yǎng)的一一個(gè)重要不同同：傳代或擴(kuò)大培培養(yǎng)時(shí)，常需需要用酶使細(xì)細(xì)胞間質(zhì)和一一些貼附因子子水解，使細(xì)細(xì)胞從基質(zhì)分分離成單細(xì)胞胞。懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)細(xì)胞密度高；；操作復(fù)雜貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)設(shè)備：轉(zhuǎn)瓶（rollerbottle）早期大量培養(yǎng)養(yǎng)原代雞胚或或腎細(xì)胞生產(chǎn)產(chǎn)疫苗，后來(lái)引入了計(jì)計(jì)算機(jī)自動(dòng)控控制。貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)設(shè)備：轉(zhuǎn)瓶（rollerbottle）貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)設(shè)備：固定床式生物物反應(yīng)器（fixedbedbioreactor）（hollow-fiberbioreactor）貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)設(shè)備：中空纖維式生生物反應(yīng)器（membranebioreactor）貼壁培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)設(shè)備：膜式生物反應(yīng)應(yīng)器10個(gè)內(nèi)腔，每個(gè)個(gè)表面積600cm22L培養(yǎng)液=6000cm2的轉(zhuǎn)瓶，12.5L聚苯乙烯，可可隨意處理懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)設(shè)備：Cellfactory由圓柱形陶瓷瓷基質(zhì)套筒構(gòu)構(gòu)成，內(nèi)含許許多1mm2正方形體腔，，可用面積達(dá)達(dá)0.4-12.5m2，放大面積可可達(dá)210m2懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)設(shè)備：Opticell貼壁-懸浮培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)，又稱假懸浮培養(yǎng)，主要是為了了結(jié)合懸浮培培養(yǎng)和貼壁培培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)而而避免其不足足。懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)：操作簡(jiǎn)便，細(xì)胞密度低貼壁培養(yǎng)：操作復(fù)雜，細(xì)胞密度高貼壁-懸浮培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)，又稱假懸浮培養(yǎng)，主要是為了了結(jié)合懸浮培培養(yǎng)和貼壁培培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)而而避免其不足足。微載體培養(yǎng)包埋（或微囊囊）培養(yǎng)結(jié)團(tuán)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)微載體培養(yǎng)1967年，荷蘭的vanWezel首先采用葡聚糖SephadexA50微小顆粒培養(yǎng)養(yǎng)貼壁細(xì)胞獲獲得成功1980S已被正式用于于工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)各種疫苗和和其他細(xì)胞產(chǎn)產(chǎn)品，并出現(xiàn)現(xiàn)了一大批商商品化的微載體（microcarrier）。懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)微載體培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)微載體體培養(yǎng)養(yǎng)1980S后期期，，又又開開發(fā)發(fā)出出多孔孔微微載載體體（或或稱稱多多孔孔微微球球）），，極極大大地地增增加加了了供供細(xì)細(xì)胞胞附附著著的的比表面積，且適用于于懸浮培養(yǎng)養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)微載體培養(yǎng)養(yǎng)加入鈦等金金屬增加比比重——適用于于固定定床反反應(yīng)器器不加鈦鈦比重重輕——可用于于通氣氣攪拌拌罐式式生物物反應(yīng)應(yīng)器、、氣升升式生生物反反應(yīng)器器。懸浮培培養(yǎng)貼壁培培養(yǎng)貼壁-懸浮培培養(yǎng)微載體體培養(yǎng)養(yǎng)理想的的微載載體：：1、表面性性質(zhì)與與細(xì)胞胞有良良好的的相容容性，，適于于細(xì)胞胞附著著、伸伸展和和增殖殖2、材料無(wú)無(wú)毒性性，對(duì)對(duì)細(xì)胞胞、人人體3、材料惰惰性，，不與與培養(yǎng)養(yǎng)基成成分發(fā)發(fā)生化化學(xué)變變化，，也不不吸收收營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)成分分4、材料軟軟性，，避免免在攪攪拌中中損傷傷細(xì)胞胞5、比重適適中，，在1.030-1.045g/ml，在低低速攪攪拌下下就可可懸浮浮，而而靜止止時(shí)又又很快快沉降降，便便于換換液和和收獲獲懸浮培培養(yǎng)貼壁培培養(yǎng)貼壁-懸浮培培養(yǎng)微載體體培養(yǎng)養(yǎng)理想的的微載載體：：6、粒徑溶溶脹性性均一一，在在60-250m之間間，差差異不不大于于20m，有有利于于細(xì)胞胞均勻勻地分分布在在各微微載體體表面面7、具有良良好的的光學(xué)學(xué)透明明性，，適于于在倒倒置顯顯微鏡鏡下觀觀察細(xì)細(xì)胞在在載體體上的的生長(zhǎng)長(zhǎng)情況況8、可耐120℃高溫，，便于于采用用高壓壓蒸汽汽滅菌菌9、經(jīng)簡(jiǎn)單單處理理后可可反復(fù)復(fù)使用用多次次10、、原料充充分，，制作作簡(jiǎn)便便，廉廉價(jià)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)包埋（或微囊囊）培養(yǎng)細(xì)胞不是貼附附在載體表面面，而是被包包埋或包裹在在凝膠載體或微囊中早期主要用于于固定細(xì)菌和酵酵母等，廣泛應(yīng)用于于工業(yè)生產(chǎn)和和環(huán)境保護(hù)中中，后來(lái)才被被移植于動(dòng)植植物細(xì)胞的培培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)包埋培養(yǎng)用于包埋細(xì)胞胞的材料人工高分子聚聚合物：聚丙烯酰胺、、環(huán)氧樹脂多糖：纖維素、瓊脂脂、瓊脂糖、、海藻酸鈣等等蛋白質(zhì)：膠原、明膠、、纖維蛋白等等目前最普遍實(shí)實(shí)用的是瓊脂糖和海藻酸鈣凝膠膠控制溫度或離離子種類可來(lái)來(lái)改變材料的的物相懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)微囊培養(yǎng)微囊培養(yǎng)在包包埋培養(yǎng)的基基礎(chǔ)上發(fā)展而而來(lái)微囊的制備：：在形成凝膠后后，用另一種種電荷相反的的材料與之作作用，使在載載體外形成一一層聚合膜，，然后再使膜膜內(nèi)的載體液液化目前，使用最最多、最成熟熟的材料搭配配是海藻酸鈉-聚賴氨酸。懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)包埋（或微囊囊）培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：1、細(xì)胞可獲得得保護(hù)，避免了剪切力力的損害2、可獲得較高的細(xì)胞密密度>107-108cells/ml3、控制微囊囊膜的孔徑徑可使產(chǎn)品品濃縮在微微囊內(nèi)，有利于下游游產(chǎn)物的純純化4、可采用多多種生物反反應(yīng)器進(jìn)行行大規(guī)模培培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)結(jié)團(tuán)培養(yǎng)1980年，Tolbert首先利用有有些正常需需要貼附在在基質(zhì)表面面的細(xì)胞有有形成結(jié)團(tuán)團(tuán)的特點(diǎn)，，用攪拌式式反應(yīng)器和和灌流培養(yǎng)養(yǎng)的方式獲獲得了高密密度的細(xì)胞胞實(shí)質(zhì)：用細(xì)胞本身身作為基質(zhì)質(zhì)，相互貼貼附后，再再用懸浮的的方法進(jìn)行行培養(yǎng)如何促進(jìn)結(jié)結(jié)團(tuán)：在培養(yǎng)基內(nèi)內(nèi)加入有些些直徑較小小的顆粒，，促使細(xì)胞胞先附著其其上后再相相互附著優(yōu)點(diǎn)：載體用量少少，細(xì)胞不不能在載體體上伸展，，細(xì)胞呈球球形；操作作簡(jiǎn)便，節(jié)節(jié)省了用于于微載體的的成本懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)貼壁-懸浮培養(yǎng)S3動(dòng)物細(xì)胞制制藥的前景景提高產(chǎn)量降低成本改進(jìn)質(zhì)量轉(zhuǎn)基因動(dòng)物物組織工程07轉(zhuǎn)基因動(dòng)植植物制藥提高產(chǎn)量降低成本改進(jìn)質(zhì)量組織工程提高產(chǎn)量首要的是提提高表達(dá)水水平鼠骨髓瘤細(xì)細(xì)胞生產(chǎn)IgG5pg/cell··min10L反應(yīng)器培養(yǎng)養(yǎng)，細(xì)胞密密度為107/ml，理論上上720g/d，實(shí)際際卻只只有1g/d主要原原因：：不了解解細(xì)胞胞在體體外調(diào)調(diào)控基基因表表達(dá)的的機(jī)制制提高產(chǎn)產(chǎn)量降低成成本改進(jìn)質(zhì)質(zhì)量組織工工程提高產(chǎn)產(chǎn)量雜交瘤瘤細(xì)胞胞中加加入IPSF-I/-II：產(chǎn)量可可增加加20倍Immunoglobulinproductionstimulatingfactor如何提提高表表達(dá)水水平，，還存存在著著很大大的潛潛力提高產(chǎn)產(chǎn)量降低成成本改進(jìn)質(zhì)質(zhì)量組織工工程提高產(chǎn)產(chǎn)量在同一一種CHO細(xì)胞中中，所所表達(dá)達(dá)尿激激酶原原的產(chǎn)產(chǎn)量，，在幾幾種不不同的的表達(dá)達(dá)載體之間存在著很很大的差異。。鼠白血病病毒毒啟動(dòng)子載體體——表達(dá)量高達(dá)100g/106·d提高產(chǎn)量降低成本改進(jìn)質(zhì)量組織工程降低成本1、提高細(xì)胞的的表達(dá)水平2、改進(jìn)培養(yǎng)基基配方，盡可可能利用廉價(jià)價(jià)原料如：用蛋白胨胨取代昂貴的的生長(zhǎng)因子3、改變細(xì)胞的的代謝途徑（“代謝工程程”）Bird:宿主細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)導(dǎo)入谷氨酰胺合成成酶基因，培養(yǎng)基中就就不需加谷氨氨酰胺Pak:超級(jí)CHO（已轉(zhuǎn)入胰島島素樣生長(zhǎng)因因子基因、鐵鐵傳遞蛋白基基因），可直直接培養(yǎng)于無(wú)無(wú)血清培養(yǎng)基基中，而無(wú)需需另加這些因因子。提高產(chǎn)量降低成本改進(jìn)質(zhì)量組織工程改進(jìn)質(zhì)量主要是指糖基化質(zhì)量問(wèn)題——糖基化的有無(wú)無(wú)和正確與否否直接關(guān)系到到藥效、藥代代動(dòng)力學(xué)和免免疫原性如：非糖基化EPO在體內(nèi)沒(méi)有生生物活性大腸桿菌生產(chǎn)產(chǎn)的CSF會(huì)引起抗體的的產(chǎn)生提高產(chǎn)量降低成本改進(jìn)質(zhì)量組織工程改進(jìn)質(zhì)量細(xì)胞種屬不同同，糖基化質(zhì)量也不同昆蟲表達(dá)系統(tǒng)統(tǒng)——產(chǎn)量最高但是糖基化的的種類與天然然產(chǎn)品相差很很大——因此，雖有300多種產(chǎn)品表達(dá)達(dá)成功，但