血紅蛋白的提取和分離(經(jīng)典)課件

(一）蛋白質(zhì)占細(xì)胞干重的50％以上，細(xì)胞中含量最多的有機物2、組成元素C、H、O、N一、基礎(chǔ)知識1、含量3、相對分子質(zhì)量高分子化合物4、基本組成單位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸連接方式脫水縮合寫出氨基酸脫水縮合形成二肽示意圖氨基酸的結(jié)合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH氨基酸的結(jié)合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二肽肽鍵脫水縮合氨基酸的結(jié)合方式:脫水縮合肽鍵CHCOOHR3HNOHHCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O氨基酸的結(jié)合方式:脫水縮合CCHR1NH2COCHR2HNO肽鍵二肽CHCOOHR3HNH2O肽鍵三肽以此類推，由多個氨基酸分子縮合而成的含有多個肽鍵的化合物，叫多肽（鏈狀）。肽鏈盤曲，折疊，形成有一定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子。H2O8、分子結(jié)構(gòu)7、肽鍵CONH氨基酸肽鏈蛋白質(zhì)脫水縮合盤曲折疊（一條或者多條）①氨基酸間脫水縮合時，原來的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一個氨基，另一端只有一個羧基（不計R基上的氨基和羧基）。所以對于一條多肽鏈說，至少應(yīng)有的氨基和羧基都是一個②若有個n氨基酸分子縮和成m條肽鏈,則可形成________個肽鍵,脫去______個水分子，至有氨基和羧基各____個11、相關(guān)計算n-mn-mm血紅蛋白思考1

高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性、空間結(jié)構(gòu)思考2

人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。本課題學(xué)習(xí)目標(biāo)

體驗從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝膠色譜法②電泳法③緩沖溶液④它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。2、主要原理：①凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理②電泳法分離樣品的原理③緩沖溶液的組成和作用機理3、課題重點：凝膠色譜法的原理和方法4、課題難點：

①樣品的處理②色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。

1、凝膠色譜法凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一，又稱分子篩層析。凝膠實際上是一些微小的多孔球體，例如：浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等一、基本概念及原理4.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過程凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動畫演示

二、緩沖溶液

在一定范圍內(nèi)，能夠抵制

對溶液PH值的影響，維持PH

不變。1.作用:2.配制:

通常由

溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑

的就可以制得在

使用的緩沖液。3.提問：在本課題中使用的緩沖液是:__________,其目的是:

利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)磷酸緩沖液外界的酸和堿基本1~2種緩沖劑使用比例不同PH范圍內(nèi)思考：說出人體血液中緩沖對。

NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3三、電泳血紅蛋白的分離鑒定方法1.概念：帶電粒子在

作用下發(fā)生

的過程。2.原理：

許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有

的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會帶上

或

。在電場的作用下，這些帶電分子會向著的

的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子

以及分子本身的

、

的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的

，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3.類型:瓊脂糖凝膠電泳、聚丙稀酰胺凝膠電泳。電場遷移可解離正電負(fù)電與其所帶電荷相反帶電性質(zhì)的差異大小形狀遷移速度

在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動瓊脂糖凝膠電泳示意圖迷你雙垂直電泳槽等電聚焦多用電泳槽臥式電泳槽電泳槽9

（1）、蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于

等因素。它所帶靜電荷的多少以及分子的大小（2）、SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于（）。分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）①瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需要事先處理；電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。②測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量常用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，這是因為該方法分離蛋白質(zhì)完全取決于分子的大小，而非所帶電荷的性質(zhì)和分子的大小、形狀。【典例1】有關(guān)凝膠色譜法和電泳法的說法正確的是A.它們都是分離蛋白質(zhì)的重要方法B.它們的原理相同C.使用凝膠色譜法需要使用緩沖溶液而電泳不需要D.以上說法都正確

【解題關(guān)鍵】解答本題的關(guān)鍵應(yīng)明確以下兩點：(1)凝膠色譜法的原理；(2)電泳法的原理。A二、實驗步驟蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定（電泳）實驗操作樣品處理（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟（二）操作過程紅細(xì)胞的洗滌粗分離：血紅蛋白的釋放分離血紅蛋白溶液純化：純度鑒定透析—去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)用凝膠色譜法除去相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳血液血漿水分其他物質(zhì)：血漿蛋白、無機鹽、磷脂、葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（90％）兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團(tuán)2.血液有哪些成分？

1.用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用哺乳動物的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？

雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提??；人的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。血紅蛋白血紅蛋白兩個α－肽鏈兩個β一肽鏈四個亞鐵紅素基團(tuán)每個肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。血紅蛋白的特點：采集得到血液（加入抗凝血劑檸檬酸鈉）（1）紅細(xì)胞的洗滌A、洗滌目的:B、分離時采用

離心，用

洗滌，重復(fù)洗滌

，直至

C、能否用蒸餾水代替生理鹽水？去除雜質(zhì)血漿蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化低速短時間五倍體積的生理鹽水三次

上清液不再呈現(xiàn)黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈不能，生理鹽水能保持紅細(xì)胞的滲透壓而不至于破裂，若紅細(xì)胞提前破裂，使血紅蛋白與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大分離難度。初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果（2）釋放血紅蛋白思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？

（使用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢瑁┠康姆治觯赫麴s水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂磁力攪拌器攪拌器轉(zhuǎn)子攪拌器正在工作（3）分離血紅蛋白溶液：

用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。甲苯層（無色透明）白色薄層固體紅色透明液體雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次柜式離心機

2.粗分離透析（去除分子量較小的雜質(zhì)）（1）用

方法進(jìn)行粗分離，透析袋由半透膜制成，常用。將透析袋放入

溶液中進(jìn)行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是

。

透析玻璃紙、腸衣、膀胱膜

透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)磷酸緩沖透析過程動畫演示（1）凝膠色譜柱的制作①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。

3、純化（凝膠色譜）去除相對分子量較大的雜質(zhì)蛋白

凝膠色譜柱的制作（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。

②凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：

A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。

B、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。教材P70：為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？如果裝填不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，影響分離的效果。思考裝配好的凝膠柱(3）樣品加入與洗脫①加樣前打開下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的（）緩慢下降到與（）平齊，關(guān)閉出口緩沖液凝膠面注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。②加透析樣品立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75

20mmol/L磷酸緩沖液“G”表示什么？75代表什么？3.樣品的加入和洗脫

1.調(diào)液面2.加樣3.再調(diào)液面

4.洗脫5.收集緩沖液凝膠①調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：加到色譜柱的（）③樣品滲入凝膠床：（）④再調(diào)整緩沖液面洗脫：⑤收集：待（）接近色譜柱底端時收集頂端樣品完全進(jìn)凝膠層紅色的蛋白質(zhì)色譜柱制作成功的標(biāo)志：紅色區(qū)帶均勻一致的移動記4、純度鑒定（電泳）SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。1、垂直板電泳裝置2、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀；3、微量進(jìn)樣器（可用微量移液器代替）（1）、膠板的制備：①.將玻璃板用蒸餾水洗凈晾干②.把玻璃板在灌膠支架上固定好

（2）、分離膠的制備：

按下表制備分離膠(T=12%,pH=8.8)試劑雙蒸水分離膠緩沖液丙膠貯液ApTEMED

用量1.65mL1.3mL

2.0mL0.05mL0.002mL

膠灌至距梳子齒下端1cm→灌畢→封上一層水→當(dāng)膠與水出現(xiàn)清晰界限時表明聚合好。（3）、濃縮膠的制備：按下表制備濃縮膠(T=4%,pH=6.8)試劑雙蒸水濃縮膠緩沖液丙膠貯液ApTEMED用量1.46mL0.25mL 0.27mL0.02mL0.002mL

用濾紙吸干水→倒入濃縮膠→插入梳子→聚合。（4）、取樣

取純化后的血紅蛋白樣品10μL加入10μL上樣buffer（內(nèi)含少許溴酚藍(lán)的40％蔗糖）混勻。（5）裝槽、點樣：

拔出梳子→將膠板固定在電泳槽上（凹板一側(cè)向內(nèi)）→在電泳槽中加入緩沖液→點樣。（6）電泳：（7)、剝膠、染色及脫色

凝膠板剝離：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，加染色液染色，然后用脫色液脫色。(8)、結(jié)果

1、由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。

2、TEMED和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。

3、在進(jìn)行電泳操作時一定按照實驗要求和步驟完成。操作時要戴好一次性手套。注意事項：SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素√√√√√√√思考下面的問題：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能正常。1、在血紅蛋白純化的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？2、與其他蛋白質(zhì)相比，血紅蛋白有什么特點？這一特點對你進(jìn)行血紅蛋白的分離有什么啟示？血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。3、你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、分離血紅蛋白溶液（離心）等操作收集到血紅蛋白溶液，即:樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)蛋白除去，即:樣品的純化；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定?！镜淅?】(2011·揚州高二檢測)如圖表示血紅蛋白提取和分離的部分實驗裝置，請回答下列問題：(1)血紅蛋白是人和其他脊椎動物紅細(xì)胞的主要組成成分，其在紅細(xì)胞中的作用體現(xiàn)了蛋白質(zhì)具有____________功能。(2)甲裝置中，B是血紅蛋白溶液，則A是____________；乙裝置中，C溶液的作用是_____________________________。(3)甲裝置用于____________，目的是__________________________________。用乙裝置分離蛋白質(zhì)的方法叫____________，是根據(jù)_________________分離蛋白質(zhì)的有效方法。(4)用乙裝置分離血紅蛋白時，待_____________-_________時，用試管收集流出液，每5mL收集一管，連續(xù)收集。運輸磷酸緩沖液洗脫血紅蛋白透析(粗分離)去除樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)凝膠色譜法相對分子質(zhì)量的大小紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實驗結(jié)果分析與評價

1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？

由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。

3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？ 教學(xué)反饋1．凝膠色譜法是根據(jù)（）分離蛋白質(zhì)的有效方法。A分子的大小B相對分子質(zhì)量的大小C帶電荷的多少D溶解度2．緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（）基本不變。A溫度BpHC滲透壓D氧氣濃度3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動。A相同B相反C相對D相向4.哺乳動物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（）與氧氣的運輸有關(guān)。A血紅蛋白B肌紅蛋白C肌動蛋白D肌球蛋白BBBA5．血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（）的含量最多。A白細(xì)胞B血小板C紅細(xì)胞D淋巴細(xì)胞6．為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血劑（）。A.NaClB.甲苯C.蒸餾水D.檸檬酸鈉7．將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層，其中第3層是（）A無色透明的甲苯層B脂溶性物質(zhì)的沉淀層C血紅蛋白的水溶液D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物CDC1、隨著人類跨入蛋白質(zhì)組時代，對蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過程D獲得高純度的蛋白質(zhì)2、用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的過程中，關(guān)于蛋白質(zhì)的敘述，正確的是A相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程大于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)B相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程小于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)C相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)行程等于相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)D二者根本無法比較3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A調(diào)節(jié)pHB維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng)C防止微生物生長D防止血液凝固6、記住樣品處理中的血紅蛋白溶液離心后分層順序自上而下是：有機溶劑脂類物質(zhì)血紅蛋白溶液紅細(xì)胞破碎物沉淀1.答:凝膠色譜法也稱為分配色譜法,它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一.所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體,這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成,小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道,當(dāng)一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時,各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運動,即垂直向下的運動和無規(guī)則的擴散運動.相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,只能分布在顆粒之間,通過的路程較短,移動速度較快;相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道,通過的路程較長,移動速度較慢.因此,樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出,相對分子質(zhì)量中等的分子后流出,相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出,這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象.1.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的的原理是怎樣的?課后練習(xí)答:在一定范圍內(nèi),能對抗外來少量強酸,強堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用,具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液.緩沖溶液通常是由一或兩種緩沖劑溶解于水中制得,調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液.

緩沖溶液的作用維持反應(yīng)體系的pH不變.在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的pH下進(jìn)行的,受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控.為了在實驗室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境,就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有與體內(nèi)過程完全相同的pH.

2.什么是緩沖溶液?它的作用是什么?原理：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程.許多重要的生物大分子,如氨基酸,多肽,蛋白質(zhì),核苷酸,核酸等都具有可解離基團(tuán),它們在某個特定的pH下會帶上正電或負(fù)電;在電場的作用下,這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動.作用：電泳技術(shù)就是在電場的作用下,利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小,形狀等性質(zhì)的差異,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而達(dá)到對樣品進(jìn)行分離,鑒定或提純的目的.

3.電泳的作用及其原理是什么?答:血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步,包括:樣品處理,粗分離,純化和純度鑒定.首先通過洗滌紅細(xì)胞,血紅蛋白的釋放,離心等操作收集到血紅蛋白溶液,即樣品的處理;再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì),即樣品的粗分離;然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去,即樣品的純化;最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定.

答:血紅蛋白是有色蛋白,因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液.這使血紅蛋白的分離過程非常直觀,大大簡化了實驗操作.

4.你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎?5.與其他真核細(xì)胞相比,紅細(xì)胞有什么特點?這一特點對你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?3、SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳：2.試劑的配制：鑒定血紅蛋白純度。1.目的：

①丙烯酰胺和N,N-亞甲基雙丙烯酰胺:

用去離子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的貯存液。②十二烷基硫酸鈉（SDS）:

用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存。③用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液。④TEMED：作用通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。⑤用去離子水配制10%過硫酸銨：作用是提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液。⑥Tris—甘氨酸電泳緩沖液：25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS。⑦樣品處理液：

50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚藍(lán)，10%的甘油。⑧染色液：

0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。⑨脫色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。

①SDS-聚丙烯酰胺分離膠制備：用去離子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris緩沖液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的過硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間