幻燈片終稿課件

第九組泌尿外科專(zhuān)業(yè)腫瘤專(zhuān)業(yè)：12/27/2022

VHL基因的研究進(jìn)展及在腎癌基因治療中的應(yīng)用PrograssofVHLGeneandItsApplicayionintheGeneTherapyforRenalCellCarcinoma綜述報(bào)告12/27/2022背景One:腎透明細(xì)胞癌顆粒細(xì)胞型腎癌透明細(xì)胞型腎癌混合細(xì)胞型腎癌未分化細(xì)胞型腎癌腎癌70~80%12/27/2022

two:VHL基因潛力

其得名于VonHippel-Lindau(VHL)病定位于染色體3p25-26為抑癌基因，該基因的失活會(huì)導(dǎo)致正常的VHL蛋白合成障礙，這與腎透明細(xì)胞癌（clearcellrenalcellcarcinoma,CCRCC）的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。背景12/27/2022

背景

VHL基因的失活機(jī)制:包括基因突變，雜合性缺失和甲基化。

12/27/20221.VHL基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物VHL基因的結(jié)構(gòu):

VHL基因定位于染色體3p25-26區(qū)，含有14543bp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)顯子（圖1），轉(zhuǎn)錄的mRNA長(zhǎng)度為4859bp，包括5和3端的非翻譯區(qū)。圖1VHL基因結(jié)構(gòu)示意圖exon1exon2intron1intron2exon314543bp1bp643bp-1054bp5392bp-5514bp8867bp-12993bp12/27/2022VHL基因的編碼產(chǎn)物：

VHLmRNA編碼兩種不同的蛋白質(zhì)，pVHL30和pVHL19，分子量分別為30kD和19kD，各由213個(gè)氨基酸和180個(gè)氨基酸組成，pVHL19是在VHL基因的第二轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（54號(hào)密碼子）上轉(zhuǎn)錄形成的，pVHL30和pVHL19的不同之處在于前者有8個(gè)氨基酸末端重復(fù)的存在。12/27/2022

VHL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由位于N-末端7個(gè)β折疊和C端的4個(gè)α螺旋構(gòu)成。其中3個(gè)α螺旋位于蛋白的一側(cè)，構(gòu)成了α區(qū)；另外4個(gè)β折疊和1個(gè)α螺旋位于一側(cè)，構(gòu)成了β區(qū)。這兩個(gè)區(qū)域包含不同的蛋白結(jié)合位點(diǎn)：α區(qū)可以與轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子B、C（ElonginB、C）復(fù)合物相連接，β區(qū)可以與缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）等底物分子相連接，這兩個(gè)區(qū)域的完整對(duì)VHL蛋白的功能有重要意義。12/27/20222.1VHL基因與Wnt-β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控

1.Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可以促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。

2.pVHL與Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)Jade-1的作用連接起來(lái)。pVHL對(duì)Jade-1的穩(wěn)定性起促進(jìn)作用，Jade-1可以通過(guò)泛素化作用降解β-catenin，從而使Wnt/β-catenin致癌信號(hào)通路受到抑制。12/27/20222.2VHL基因介導(dǎo)HIF的降解調(diào)控細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄

VHL基因通過(guò)介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）的降解來(lái)調(diào)控細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制已被證實(shí)。

pVHL首先與ElonginB、ElonginC、Cul2以及Rbxl組成E-3泛素連接酶復(fù)合體，然后再與HIF-α結(jié)合，在常氧狀態(tài)下，HIF的α亞單位可以被3個(gè)不同的脯氨酸酰羥化酶羥基化，進(jìn)而被E-3泛素連接酶復(fù)合體泛素化，進(jìn)而被降解。相反，在缺氧情況下，低氧阻止羥基化的發(fā)生，HIF的α亞單位被轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，與VHL蛋白的β亞單位結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)一些包含缺氧反應(yīng)元件（HRE）的基因表達(dá)。12/27/2022

Derek等分析了99例腎透明細(xì)胞癌患者的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子（TGF-α）的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在VHL基因突變的患者中EGFR和TGF-α表達(dá)量較高。TGF-α的高表達(dá)會(huì)引起腎透明細(xì)胞癌中的EGFR/PBK/AKT/IKKα/NK-κB這一信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活轉(zhuǎn)錄因子NK-κB，NK-κB與癌細(xì)胞的增殖、侵染、抗凋亡有著密切的關(guān)系。

因此可以通過(guò)調(diào)控HIF的降解與多個(gè)相關(guān)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.VHL基因的功能12/27/20222.3VHL基因與氧化磷酸化的調(diào)控

大多數(shù)腫瘤細(xì)胞包括腎透明細(xì)胞癌，腫瘤細(xì)胞的生存與增殖所需要的ATP主要來(lái)自糖酵解而非氧化磷酸化。腎透明細(xì)胞癌中pVHL的缺失會(huì)導(dǎo)致HIF的穩(wěn)定表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致氧化磷酸化的減弱，這主要是由于切割細(xì)胞色素氧化酶c亞單位4前體的線粒體中間肽酶（MIP）的活性受到抑制所致。在正常細(xì)胞中，丙酮酸主要在丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（PDH）的作用下轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A從而進(jìn)入三羧酸循環(huán),而PDH的活性則是由磷酸化/去磷酸化來(lái)調(diào)控。在丙酮酸脫氫酶激酶12/27/2022（PDK1）的作用下，PDH被磷酸化而失去活性，此時(shí)，丙酮酸不能轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，也就不能進(jìn)入三羧酸循環(huán)。PDK1是HIF的作用靶點(diǎn)，在腎透明細(xì)胞癌中HIF穩(wěn)定表達(dá)，由于HIF的存在使得PDK1活性增強(qiáng)，這也就間接減弱了氧化磷酸化的進(jìn)行。此外，在腎透明細(xì)胞癌中，由于VHL基因的失活導(dǎo)致HIF穩(wěn)定表達(dá)，而HIF的穩(wěn)定表達(dá)促使GLUT-1含量升高，GLUT-1在糖降解過(guò)程中起著重要的運(yùn)輸作用，因而能夠促進(jìn)糖降解的進(jìn)行。

2.VHL基因的功能12/27/2022

綜上所述，VHL基因與β-連環(huán)蛋白、缺氧誘導(dǎo)因子、氧化磷酸化的調(diào)控有著密切的關(guān)系（圖2），其產(chǎn)物pVHL可以通過(guò)調(diào)控β-catenin、HIF來(lái)抑制腎透明細(xì)胞癌的生長(zhǎng)，此外，pVHL也能夠通過(guò)氧化磷酸化來(lái)抑制腎透明細(xì)胞癌的生長(zhǎng)。12/27/2022

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VHL基因失活的機(jī)制研究大部分的腎透明細(xì)胞癌中都伴有VHL抑癌基因的失活，其失活機(jī)制主要包括基因突變（mutation）、雜合性缺失（lossofheterozygosity,LOH）和甲基化（methyiation）

12/27/20223.1VHL基因的突變

在腎透明細(xì)胞癌中基因突變是導(dǎo)致VHL基因失活的主要機(jī)制之一。大量實(shí)驗(yàn)表明腎透明細(xì)胞癌中VHL基因突變具有較高的發(fā)生率（見(jiàn)下表）。12/27/20223.2VHL基因雜合性缺失與甲基化

腎癌中普遍存在3號(hào)染色體短臂（3p）基因雜合性缺失現(xiàn)象。Kurynin等通過(guò)微衛(wèi)星標(biāo)志檢測(cè)了64例腎透明細(xì)胞癌VHL基因表達(dá)，18例存在VHL基因雜合性缺失，LOH發(fā)生率為28%。

12/27/2022調(diào)查總例數(shù)

VHL基因甲基化例數(shù)比例Kurynin等6457.8%Masahiro等187105.3%James等26519%基因5‘-2CpG島的甲基化：12/27/20224VHL基因在腎透明細(xì)胞癌治療中的應(yīng)用探索4.1VHL基因治療腎細(xì)胞癌的探索

人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ＶＨＬｃＤＮＡ腺粒體轉(zhuǎn)入發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞活力及增殖能力明顯受抑制最早將ＶＨＬ基因轉(zhuǎn)入人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的報(bào)道，這促進(jìn)了利用ＶＨＬ基因治療腎癌的研究。Theresa12/27/2022

正常的ＶＨＬ基因轉(zhuǎn)入不表達(dá)ＶＨＬ蛋白的腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498和UMRC6發(fā)現(xiàn)ＶＨＬ基因產(chǎn)物明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)Fan但是VHL基因（713號(hào)核苷酸G→A,Arg→GLU）轉(zhuǎn)入A498和UMRC6這兩種腎癌細(xì)胞系卻不能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，將野生型VHL基因轉(zhuǎn)入其他表達(dá)VHL的非腎癌腫瘤細(xì)胞株，卻不能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。這為VHL基因治療腎癌奠定了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)12/27/2022Datta等用HIV-TAT蛋白（一種肽段傳遞系統(tǒng)）將VHL蛋白β區(qū)的104-123氨基酸序列（TATFLAGVHL-肽）引入腎癌細(xì)胞系786-0,1次/d注射TATFLAGVHL-肽，11d后，注射TATFLAGVHL-肽能使種植在裸鼠背側(cè)的腎癌部分消退；治療組與對(duì)照組相比，腫瘤細(xì)胞增殖指數(shù)下降56%。該結(jié)果表明，VHL蛋白β區(qū)的104-123氨基酸序列能阻止腫瘤生長(zhǎng)和浸潤(rùn).該研究為腫瘤治療提供了新方法，即可應(yīng)用某抑癌基因（如VHL）產(chǎn)物的一小部分阻止已存腫瘤的生長(zhǎng)浸潤(rùn)。12/27/2022

為了解決這一問(wèn)題，人們開(kāi)展了大量的研究。研究設(shè)想：1.設(shè)法構(gòu)建在腫瘤組織中才能表達(dá)的特異性表達(dá)載體2.構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)表達(dá)載體12/27/20225展望通過(guò)對(duì)VHL基因結(jié)構(gòu)、功能的研究，可以從中發(fā)現(xiàn)一些特異的分子標(biāo)志物，為腎細(xì)胞癌的診斷與治療提供新思路。此外，VHL基因與氧化磷酸化有著密切的聯(lián)系，而氧化磷酸化是一個(gè)復(fù)雜的生物代謝途徑，通過(guò)對(duì)二者關(guān)系的研究，可以發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，為腎細(xì)胞癌的治療提供新的方法。

12/27/2022

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