細胞凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳課件

細胞凋亡的DNA

瓊脂糖凝膠電泳細胞凋亡（apoptosis/programmedcelldeath）細胞凋亡是為維持內環(huán)境穩(wěn)定，一個由基因控制的主動的有序的死亡過程，凋亡細胞將被吞噬細胞吞噬。生物學意義：①確保正常發(fā)育生長：清除多余的細胞②維持內環(huán)境穩(wěn)定：清除受損、突變、衰老的細胞③積極防御功能：對病毒感染細胞阻止復制其中最重要和最具有特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴性的核酸內切酶的激活而導致染色質DNA在核小體連接部位斷裂，形成以180~200bp為最小單位的單體或寡聚體片段。凋亡和壞死的區(qū)別壞死（necrosis）：壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細胞脹大，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴重的炎癥反應。凋亡是細胞對環(huán)境的生理性病理性刺激信號，環(huán)境條件的變化或緩和性損傷產(chǎn)生的應答有序變化的死亡過程。其細胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。凋亡和壞死的形態(tài)學特征凋亡壞死單細胞或一小群細胞相鄰的細胞團細胞皺縮和卷積細胞腫脹核固縮和和碎裂核溶解完整的細胞膜破壞的細胞膜細胞質保留在凋亡小體細胞質釋放無炎癥一般都存在炎癥材料1.凋亡細胞：經(jīng)地塞米松誘導的小鼠胸腺細胞2.提取DNA：基因組DNA抽提試劑盒（RNA酶、蛋白酶K、懸浮液、裂解液、洗滌液、洗脫液、DNAladder標準品等）3.DNA電泳：1%的瓊脂糖凝膠、點樣緩沖液4.實驗器材：1.5mlEP管、吸附柱、收集管、臺式高速離心機、65℃水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、紫外透射儀二、提取胸腺細胞DNA：⑴裂解細胞階段（使用到的試劑：裂解液=L液、RNaseA/蛋白酶K液=A液）將細胞離心后小心倒出液體，離心管中加入100μlL液和20μlA液，充分混勻，置于55℃溫浴20分鐘，其間來回顛倒離心管3-5次。(3)漂洗階段（使用試劑：600ul漂洗緩沖液×2=W液）倒掉收集管中的廢液，再加入600ulW液，12000rpm離心30秒。重復上敘步驟，再次加入600ulW液，12000rpm離心30秒。倒掉廢液，再次12000rpm離心30秒。(4)洗脫收獲（使用試劑：50μl洗脫緩沖液=T液）小心取出離心吸附柱（不可沾上W液，因其中含有乙醇，會使提取DNA變性），將其套入一個干凈的1.5mleppendorf管中，沿吸附柱的正中間小心加入50μlT液，靜置1分鐘后，于12000rpm離心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因組DNA,取10μl電泳。三、DNA瓊脂糖凝膠電泳：(5)制板:將1%的瓊脂糖凝膠加熱溶化，取20ml倒板,待凝,取梳。置板于電泳槽中，加電泳緩沖液至淹沒過膠。(6)加樣：取50uLDNA樣品與10uL點樣緩沖液,混勻,10ul/孔。（DNAmarker直接加樣，5ul/孔）。(7)電泳：點樣孔置負極，電壓80-100V，電泳至溴酚蘭移出2/3距離時，關閉電源。(8)觀察：取出凝膠板，置紫外透射儀上，可見綠色DNA區(qū)帶。注意事項：a步驟2中，加入B液后一定要充分混勻。離心后，小心取出上清，Tips頭不可吸附上白色沉淀（為基因組蛋白）。b漂洗階段（步驟3）一定要離心充分去除漂洗緩沖液，可適當將離心時間延長。c洗脫緩沖液一定要保證加入到吸附柱中央。地塞米松誘導小鼠胸腺細胞凋亡1：DNAmarker;2-3：細胞壞死對照4-6：細胞凋亡；7：正常細胞對照基因組DNA抽提試劑盒SDS（十二烷基硫酸鈉）：破細胞膜、核膜，使組織蛋白與DNA分離EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：抑制DNA酶活性，確保目的DNA不再降解ProteinaseK：使染色質上蛋白質與DNA分離，并進一步降解為小肽/氨基酸酚、氯仿：抽提除去蛋白質異丙醇：沉淀DNAGoldview：DNA螢光染料，與DNA結合形成一種光絡合物，在紫外光下呈綠色螢光TNFreceptor-associateddeathdomain(TRADD)Fas-associateddeathdomainprotein(FADD)cysteine-asparticproteases（caspase）細胞形態(tài)的改變電鏡檢測：

可檢測單個凋亡細胞的變化，但細胞凋亡早期無明顯形態(tài)學變化的，需做其他實驗證實。正常胸腺細胞凋亡胸腺細胞凋亡的淋巴細胞凋亡的淋巴細胞被巨噬細胞吞噬Caspase等凋亡相關因子檢測westernblot,immunoprecipitationImmunohistochemistryApoptosisPCRmicroarrayApoptoticoranti-apoptoticregulatorproteinssuchasBax,Bid,andBcl-2canalsobedetectedusingfluorescenceandconfocalmicroscopy檢測細胞膜的改變AnnexinV基本原理：正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。AnnexinV作為一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。線粒體的改變線粒體檢測：激光掃描共聚焦顯微鏡檢測1）線粒體通透性轉換（MPT），