常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗

關(guān)于常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗和效力檢驗第一頁，共三十頁，2022年，8月28日常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗

安全檢驗技術(shù)依據(jù)及原理安全檢驗的內(nèi)容常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗的方法安全檢驗的判定原則安全檢驗注意事項第二頁，共三十頁，2022年，8月28日安全檢驗技術(shù)依據(jù)及原理

對人、畜環(huán)境安全是對各類獸用生物制品最基本的要求，獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：對于預(yù)防、治療等用途的不同類型的獸用生物制品必須進(jìn)行安全檢驗。在根據(jù)獸用生物制品研究報告所制定的生物制品標(biāo)準(zhǔn)中，用一定的劑量和合適的途徑接種實驗動物（家兔、小鼠、豚鼠等）、雞胚或靶動物（牛、牦牛、山羊、綿羊、馬、犬、豬、雞、鴨、鵝等），經(jīng)過一定的觀察期，通過對被接種動物（或雞胚）局部或全身的評價，可以反映被接種產(chǎn)品的安全性。第三頁，共三十頁，2022年，8月28日安全檢驗的內(nèi)容檢驗外源性病原污染：如致病性細(xì)菌污染或非致病性細(xì)菌數(shù)量過多（代謝產(chǎn)物影響安全）；外源病毒或支原體污染；活疫苗細(xì)胞培養(yǎng)時帶毒或培養(yǎng)用犢牛血清有其他病毒；原材料、環(huán)境及生產(chǎn)過程各個環(huán)節(jié)污染。檢查病毒滅活情況：對滅活疫苗而言。檢查殘余毒力或毒性物質(zhì)：主要對活疫苗而言。殘余毒力指生產(chǎn)制品的菌毒株本身是活的減毒株或弱毒株，允許有輕微毒力的存在，能在接種的機(jī)體內(nèi)表現(xiàn)出來。按制品的不同，這種殘余毒力的大小有不同的指標(biāo)要求，測定和檢驗的方法也不同。

檢查對胚胎的毒性：如國外豬瘟的某些弱毒株，可通過孕豬的胎盤屏障傳給胚胎造成死胎、胎兒畸形或出生后發(fā)育不良等。如歐洲藥典明確規(guī)定豬瘟病毒應(yīng)經(jīng)過對胚胎毒性的檢查。第四頁，共三十頁，2022年，8月28日安全檢驗的方法△成品的安全檢驗方法主要是動物檢驗。根據(jù)產(chǎn)品的特點選用一定數(shù)目的規(guī)定動物（或雞胚），按指定的接種途徑接種活疫苗，不能出現(xiàn)規(guī)定條件之外的不良反應(yīng)和異常。⊕動物的要求：敏感（一般無母源抗體）、健康、一定的品種、大小。⊕安檢劑量應(yīng)大于使用劑量。一般說來，活毒疫苗的安檢用劑量是使用劑量的10倍，滅活疫苗的安檢用劑量是使用劑量的2倍。⊕凡能以小動物作出正確判斷者，則多用實驗小動物（材料易得，費用較低）?！鞑《绢惍a(chǎn)品的安全檢驗方法主要有四種類型：

1、用本動物進(jìn)行安全檢驗

2、用本動物或?qū)嶒瀯游铮ɑ螂u胚）任選其一進(jìn)行安全檢驗

3、只用實驗動物進(jìn)行安全檢驗

4、用本動物和實驗動物同時進(jìn)行安全檢驗第五頁，共三十頁，2022年，8月28日安全檢驗四種類型的主要產(chǎn)品用本動物進(jìn)行安全檢驗（18種）：雞新城疫滅活疫苗、雞產(chǎn)蛋下降綜合征滅活疫苗、雞傳染性鼻炎和雞新城疫二聯(lián)滅活疫苗、兔出血癥滅活疫苗、雞痘活疫苗（Ⅰ）、雞痘活疫苗（Ⅱ）、雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120、H52）、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞傳染性法氏囊中等毒力株活疫苗（B87）、鴨溫活疫苗、小鵝瘟活疫苗、雞新城疫、雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、雞傳染性喉氣管炎活疫苗、豬瘟活疫苗（Ⅱ）、偽狂犬活疫苗、山羊痘活疫苗、綿羊痘活疫苗。本動物或?qū)嶒瀯游铮ɑ螂u胚）任選其一的安全檢驗（3種）：雞馬立克氏病活疫苗、雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗、雞新城疫低毒力活疫苗。只用實驗動物進(jìn)行的安全檢驗（3種）：牛瘟活疫苗（Ⅰ）、牛瘟活疫苗（Ⅱ）、偽狂犬滅活疫苗。用本動物和實驗動物同時進(jìn)行的安全檢驗（6種）：牛口蹄疫O型滅活疫苗、口蹄疫O、A型活疫苗、馬傳染性貧血活疫苗、豬口蹄疫O型滅活疫苗、豬瘟活疫苗（Ⅰ）、豬瘟、豬丹毒和豬肺疫三聯(lián)活疫苗。第六頁，共三十頁，2022年，8月28日安全檢驗方法舉例用本動物進(jìn)行安全檢驗：兔病毒性出血癥滅活疫苗的安全檢驗：用體重1.5—3kg家兔4只，每只皮下注射4ml，觀察7日，應(yīng)全部健活。本動物或?qū)嶒瀯游铮ɑ螂u胚）任選其一的安全檢驗：馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗的安全檢驗，下列方法任擇其一：1、用雞檢：選用1-3日齡易感雛雞或SPF雛雞20只，其中10只各肌肉或皮下注射疫苗0.2ml（含10個使用劑量），觀察14日，對照組至少存活8只，免疫組非特異死亡數(shù)不超過對照組，判疫苗合格。2、用雞胚檢：用10日齡易感雞胚或SPF雞胚10只，每胚尿囊腔接種疫苗0.1ml（含10個使用劑量），接種后24-68小時內(nèi)雞胚非特異死亡不超過20%，死亡雞胚尿囊液對雞紅細(xì)胞凝集試驗應(yīng)為陰性，120小時收集活胚尿囊液混合，對雞紅細(xì)胞凝集試驗應(yīng)為陰性。只用實驗動物進(jìn)行的安全檢驗：牛瘟活疫苗(Ⅱ)的安全檢驗:按瓶簽注明頭份，用生理鹽水稀釋為1ml含1個使用劑量，皮下注射小白鼠5只，每只0.2ml；肌肉注射豚鼠2只，每只1ml。觀察10日，均應(yīng)健活。用本動物和實驗動物同時進(jìn)行的安全檢驗：

1、用體重350-450g的豚鼠2只，每只皮下注射疫苗2ml；用體重18-22g的小白鼠5只，每只皮下注射疫苗0.5ml。連續(xù)觀察7日，均不得出現(xiàn)因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應(yīng)或全身反應(yīng)。2、用至少6月齡的健康易感牛（細(xì)胞中和抗體滴度≤1：8，或乳鼠中和抗體滴度≤1：4）3頭，每頭舌背面皮內(nèi)注射20個點，每點0.1ml疫苗，逐日觀察至少4日。之后，每頭牛按推薦的接種途徑接種3頭份疫苗，繼續(xù)逐日觀察6日。均不得出現(xiàn)口蹄疫癥狀或明顯的因注射疫苗引起的毒性反應(yīng)。

第七頁，共三十頁，2022年，8月28日安全檢驗的判定原則

安檢期間死亡的動物經(jīng)解剖明確非制品所致者可以重檢，如結(jié)果可疑難以判斷時，應(yīng)以加倍頭數(shù)的該種動物重檢。凡規(guī)定用多種動物進(jìn)行安檢的制品（如?？谔阋逴型滅活疫苗），每種動物均應(yīng)安全合格。用小動物檢驗不合格者，有的規(guī)定可用使用對象動物重檢。但用使用對象動物檢驗不合格者，不能再以小動物重檢。

第八頁，共三十頁，2022年，8月28日安全檢驗注意事項

1.為保證檢驗的公正性，避免在對安全檢驗結(jié)果判定的主觀影響，因此應(yīng)由2名檢驗員共同進(jìn)行。2.為防止污染，涉及疫苗稀釋等操作步驟，應(yīng)當(dāng)在無菌條件下進(jìn)行。3.動物飼養(yǎng)環(huán)境要符合動物飼養(yǎng)和檢驗的要求，如果環(huán)境因素不穩(wěn)定，應(yīng)當(dāng)設(shè)置合適數(shù)量的同來源動物對照。4.檢驗過程要注意對實驗動物進(jìn)行定時觀察，發(fā)病時要增加觀察次數(shù)，對死亡動物要及時進(jìn)行解剖。第九頁，共三十頁，2022年，8月28日安全檢驗注意事項

5.安檢動物舍應(yīng)當(dāng)專用。并按強(qiáng)毒舍進(jìn)行管理（如試驗結(jié)束后動物應(yīng)按有關(guān)規(guī)定進(jìn)行處理、動物舍和飼養(yǎng)器具應(yīng)進(jìn)行全面消毒。6.如果檢驗結(jié)果可疑，難以判斷時，應(yīng)以加倍動物數(shù)量重新檢驗。7凡生產(chǎn)口蹄疫疫苗的生物制品企業(yè)，其生產(chǎn)的豬用活疫苗，均需用乳鼠進(jìn)行安檢；凡使用豬瘟強(qiáng)毒或污染豬瘟強(qiáng)毒的生物制品企業(yè)，其生產(chǎn)的豬用活疫苗均用無豬瘟抗體的敏感豬進(jìn)行安檢。（方法見規(guī)程2000版P20）第十頁，共三十頁，2022年，8月28日安全檢驗注意事項

8.安全措施：（1）檢驗過程中應(yīng)注意防止對檢驗人員和環(huán)境的污染，檢驗人員必須穿戴工作服、口罩及相關(guān)的安全防護(hù)器具，撒在操作臺、地面的產(chǎn)品要進(jìn)行消毒處理。檢驗完畢后開封的產(chǎn)品均要進(jìn)行高壓滅菌處理。（2）發(fā)病或死亡動物、糞便及其污染物必須嚴(yán)格按照“防止散毒”等相關(guān)規(guī)定處理。（3）懷孕或手部有外傷的檢驗人員禁止解剖死亡動物（4）在檢驗過程中發(fā)生烈性傳染病或人員意外時，必須迅速通知有關(guān)部門采取緊急措施。第十一頁，共三十頁，2022年，8月28日常見病毒性產(chǎn)品效力檢驗

效力檢驗的內(nèi)容效力檢驗原理及方法效力檢驗應(yīng)注意的問題第十二頁，共三十頁，2022年，8月28日效力檢驗的內(nèi)容

免疫原性：制備制品的毒種免疫原性應(yīng)良好。制備疫苗的毒株必須要與流行株相對應(yīng)，才能起到好的免疫效果。制品的免疫持續(xù)期：理想的制品應(yīng)具有較長的免疫持續(xù)期，免疫持續(xù)期過短的制品應(yīng)考慮增加免疫接種的次數(shù)?？乖姆€(wěn)定性：一般滅活苗的熱穩(wěn)定性較好，弱毒苗較差，但也可隨制品的種類而已?？乖康臏y定：活疫苗的效力取決于接種動物的毒量，即一定量病毒才能在體內(nèi)增殖，促使機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，若數(shù)量不夠，則達(dá)不到免疫效果。滅活苗同樣也需要一定的抗原量才有效。所以應(yīng)測定制品的最小免疫量。但制品的抗原量并非越多越好，應(yīng)適量，否則會出現(xiàn)副反應(yīng)。第十三頁，共三十頁，2022年，8月28日效力檢驗方法之一：攻毒保護(hù)試驗1、攻毒保護(hù)試驗原理：使用疫苗進(jìn)行接種的最終目的是使接種過的動物獲得抵抗強(qiáng)毒病原感染的能力。因此，對靶動物或已經(jīng)建立的實驗動物模型進(jìn)行接種后，用強(qiáng)毒病原進(jìn)行人工攻毒，根據(jù)動物的保護(hù)情況判斷疫苗的效力，是用以檢驗疫苗效力的最直觀方法。第十四頁，共三十頁，2022年，8月28日效力檢驗方法之一：攻毒保護(hù)試驗2、攻毒保護(hù)試驗方法：按照疫苗的特點和使用對象選擇一定數(shù)目指定年齡（或體重）無特異性抗體的易感健康動物，按照規(guī)定的途徑和劑量給動物接種疫苗。除有特殊規(guī)定外，一般注苗3—4周后連同條件相同的對照動物用指定的強(qiáng)毒和毒量按要求進(jìn)行攻毒。攻毒后在規(guī)定的時間內(nèi)觀察動物的健康狀況，不應(yīng)出現(xiàn)規(guī)定以外的不良反應(yīng)和異常。第十五頁，共三十頁，2022年，8月28日3、采用攻毒保護(hù)試驗方法的常見疫苗如下（17種）：雞新城疫滅活疫苗、雞傳染性鼻炎-雞新城疫二聯(lián)滅活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗、兔病毒性出血癥滅活疫苗、豬口蹄疫O型滅活疫苗、牛口蹄疫O型滅活疫苗、豬瘟活疫苗(I)、豬瘟活疫苗（II）、雞傳染性喉氣管炎活疫苗、雞傳染性法氏囊病中等毒力株活疫苗、豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌三聯(lián)活疫苗、偽狂犬活疫苗、雞傳染性支氣管炎活疫苗、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞新城疫低毒力活疫苗、雞新城疫-雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、鴨瘟活疫苗。

注：紅色字體疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。第十六頁，共三十頁，2022年，8月28日4、攻毒保護(hù)試驗效檢方法舉例?？谔阋逴型滅活疫苗效力檢驗：用至少6月齡的健康易感牛（細(xì)胞中和抗體滴度≤1：8，或乳鼠中和抗體滴度≤1：4）15頭，分為3組，每組5頭，將待檢疫苗分為1頭份、1/3頭份、1/9頭份3個劑量組，每一劑量組分別于頸部肌肉注射5頭牛。接種21天后，連同條件相同的對照牛2頭，每頭牛舌上表面兩側(cè)分兩點皮內(nèi)注射?？谔阋逴型病毒強(qiáng)毒，每點0.1ml（共0.2ml，含10000ID50）。連續(xù)觀察10日。對照牛應(yīng)至少3蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍。免疫牛僅在舌面出現(xiàn)水泡或潰瘍，而其他部位無病變時判為保護(hù)，除舌面以外任一部位出現(xiàn)典型口蹄疫水泡或潰瘍判為不保護(hù)。根據(jù)免疫牛的保護(hù)數(shù)，按Reed-Muench法計算被檢疫苗的PD50，每頭份疫苗應(yīng)至少含3PD50。第十七頁，共三十頁，2022年，8月28日效力檢驗方法之二：病毒含量測定1、病毒含量測定原理：病毒含量的高低直接反映了產(chǎn)品的質(zhì)量。因此用動物（雞胚、細(xì)胞培養(yǎng)物）接種測定病毒性活制品的病毒含量可作為評定效力高低的依據(jù)。第十八頁，共三十頁，2022年，8月28日效力檢驗方法之二：病毒含量測定2、病毒含量測定方法：每批疫苗按瓶簽注明的頭份用指定的稀釋液作適當(dāng)稀釋后，通常選擇三個最佳稀釋液，按規(guī)定的途徑和劑量接種一定數(shù)目指定的實驗動物（細(xì)胞、雞胚），在規(guī)定的時間內(nèi)觀察，根據(jù)動物（細(xì)胞、雞胚）對疫苗的反應(yīng)情況來計算疫苗的LD5O（TCID50

、ELD50、PD50、EID5O）或蝕班數(shù)（PFU），以此來判定疫苗的效力。第十九頁，共三十頁，2022年，8月28日3、病毒含量測定常見疫苗（12種）：口蹄疫O、A型活疫苗、山羊活疫苗、雞傳染性喉氣管炎活疫苗、雞傳染性法氏囊病中等毒力株活疫苗、雞傳染性支氣管炎活疫苗、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞新城疫低毒力活疫苗、雞新城疫、雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、雞痘活疫苗（Ⅰ）、小鵝瘟活疫苗、雞馬立克氏病活疫苗、雞馬力克氏病火雞皰疹病毒活疫苗。注：紅色字體疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。第二十頁，共三十頁，2022年，8月28日4、病毒含量測定效檢方法舉例口蹄疫O、A型活疫苗單價苗的效力檢驗：將疫苗用PBS做10倍系列稀釋，O型苗以10-5、10-6、10-7三個個稀釋度，A型苗以10-6、10-7、10-83個稀釋度，各皮下接種3—4日齡乳鼠4只，每只0.1ml，觀察4-5日，根據(jù)乳鼠發(fā)病死亡數(shù)計算LD50，每0.1mlO型苗≥105.5LD50，A型苗≥106.5LD50，判為合格。

山羊痘活疫苗效力檢驗方法之一：按瓶簽注明頭份，用生理鹽水稀釋測其毒價，每頭份病毒含量應(yīng)≥103.5TCID50。第二十一頁，共三十頁，2022年，8月28日效力檢驗方法之三：血清學(xué)試驗1、血清學(xué)試驗原理：根據(jù)相關(guān)血清學(xué)檢驗的原理，檢驗抗體水平和抗原活性，從而評定產(chǎn)品的效力。病毒性產(chǎn)品主要采用以下兩種：（1）抗體效價測定：動物體的免疫系統(tǒng)能夠?qū)M(jìn)入體內(nèi)的外源物質(zhì)進(jìn)行吸收、加工處理和遞呈，使有關(guān)淋巴細(xì)胞活化并產(chǎn)生特異性抗體。在部分疾病的免疫防治中，以這種體液免疫機(jī)制為主，其特異性抗體水平與攻毒保護(hù)率之間有一定平行關(guān)系。在這種情況下，對本動物或已經(jīng)建立的實驗動物模型進(jìn)行接種后，通過適宜的血清學(xué)試驗檢測動物的抗體水平，可以作為判斷疫苗效力高低的有效方法。第二十二頁，共三十頁，2022年，8月28日效力檢驗方法之三：血清學(xué)試驗2）中和試驗：病毒與適量抗體完全中和后，接種敏感動物或細(xì)胞，可不受侵害而獲得保護(hù)。如果用一定抗原分別與系列稀釋的抗體（血清）中和，可得到使50%動物或細(xì)胞獲得保護(hù)的最高血清稀釋度，即血清的中和效價進(jìn)而評價某疫苗（抗原）的效價或試驗動物的相關(guān)抗體是否符合規(guī)定。2、血清學(xué)試驗方法：血清學(xué)相關(guān)方法，如紅細(xì)胞凝集抑制試驗、中和試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗等。第二十三頁，共三十頁，2022年，8月28日3、血清學(xué)試驗常見疫苗抗體效價測定：主要有雞產(chǎn)蛋下降綜合征滅活疫苗（HI抗體測定）、馬傳染性貧血活疫苗（補(bǔ)體結(jié)合試驗和瓊脂擴(kuò)散試驗）。中和試驗法：雞新城疫-雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、小鵝瘟活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗。注：紅色字體疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。第二十四頁，共三十頁，2022年，8月28日4、血清學(xué)試驗效檢方法舉例雞產(chǎn)蛋下降綜合癥效力檢驗：用3-6周齡的健康易感雞（HI抗體≤1：4）10只，每只肌肉或皮下注射疫苗0.5ml,另取10只雞飼養(yǎng)不免疫；3-5周后采血，測定HI抗體，免疫雞HI抗體幾何平均滴度≥1：128，對照雞抗體HI抗體效價應(yīng)≤1：4。小鵝瘟活疫苗效力檢驗方法之一；取健康成年鵝4只，分別采血1ml,分離血清并混合備用。然后注射1個使用劑量的疫苗，每只鵝1ml，21-28日后采血，分離血清混合，將接種疫苗前后的2次血清分別與小鵝瘟GD株在鴨胚中作中和試驗。兩次ELD50值之差≥2對數(shù)值為合格。第二十五頁，共三十頁，2022年，8月28日其他效力檢驗方法熱型反應(yīng)和發(fā)病觀察：某些疫苗以適當(dāng)劑量及途徑接種實驗動物（本動物、雞胚）后，可產(chǎn)生典型的熱型反應(yīng)或特征癥狀及病理變化，借以判定疫苗的效力。主要產(chǎn)品如下：山羊活疫苗、綿羊痘活疫苗、牛瘟活疫苗（Ⅰ）、牛瘟活疫苗（Ⅱ）、豬瘟活疫苗(I)、豬瘟活疫苗（II）、雞痘活疫苗（Ⅰ）、雞痘活疫苗（Ⅱ）。注：紅色字體疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。第二十六頁，共三十頁，2022年，8月28日方法舉例：

牛瘟活疫苗效力檢驗：按瓶簽注明頭份，用生理鹽水稀釋為1ml含0.01個使用劑量，耳靜脈注射1.5-2kg家兔4只，每只1ml。應(yīng)出現(xiàn)典型牛瘟兔化弱毒的臨床反應(yīng)和病理變化。（癥狀：體溫升高，食欲減退，呼吸急迫，鼻分泌物增多，精神不佳，懷孕后期母兔，間或流產(chǎn)；感染后3-14日