發(fā)酵工程下游加工過程概論

第十二章發(fā)酵工程下游加工過程簡介一、發(fā)酵工程下游加工過程概論1、發(fā)酵工程下游加工過程的特點

1）所需產(chǎn)物在培養(yǎng)液中濃度較低，且穩(wěn)定性差2）普遍存在下游工程代價高，回收率較低等問題發(fā)酵液是復(fù)雜的多相系統(tǒng)2、發(fā)酵工程下游加工過程的一般程序成品加工發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾提取精制采用凝聚和絮凝技術(shù)加速固、液分離；如產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)，還要進(jìn)行細(xì)胞破碎提?。ǔ醪郊兓┠康氖浅ヅc目標(biāo)產(chǎn)物性質(zhì)差異大的雜質(zhì)精制（高度純化）是采用對產(chǎn)品有高度選擇性的分離技術(shù)，除去與產(chǎn)物化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)相近的雜質(zhì)最終獲得質(zhì)量合格的產(chǎn)品3、主要操作單元：絮凝離心過濾細(xì)胞破碎萃取沉淀層析結(jié)晶干燥二、發(fā)酵液預(yù)處理和過濾為什么要對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理？預(yù)處理的目的是什么？發(fā)酵液的基本特性

產(chǎn)物濃度低具有極性黏度大表面張力大性質(zhì)不穩(wěn)定一）發(fā)酵液的預(yù)處理1、目的：

發(fā)酵液中雜質(zhì)多且成分復(fù)雜，其中對純化影響最大的是高價無機離子(Ca2+、Mg2+、Fe3+等)和雜蛋白等改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，加快懸浮液中固形物沉降的速度；盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于以后處理的相中；（一般為液相）能夠除去部分雜質(zhì)。2、高價無機離子的去除鎂離子的去除：常用草酸與鈣離子生成草酸鈣沉淀草酸為弱酸，對發(fā)酵產(chǎn)物的破壞較小，草酸鈣沉淀還能促進(jìn)蛋白質(zhì)凝固，有利于提高濾液的過濾速度；草酸的溶解度較小，需大用量時，可用草酸鈉取代；草酸價格較高，生產(chǎn)上一般需回收鈣離子的去除：鐵離子的去除：常用三聚磷酸鈉與鎂離子形成可溶性絡(luò)合物Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+常用黃血鹽與鐵離子形成普魯氏藍(lán)沉淀3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+3、可溶性雜蛋白的去除

雜蛋白的存在會降低離子交換樹脂和大網(wǎng)格樹脂的吸附量，如采用溶劑萃取，會發(fā)生乳化，影響兩相分離。此外，在常規(guī)過濾和膜過濾時，還會使濾速下降，使膜受到污染。1）沉淀法

調(diào)等電點

因羧基的電離度比氨基大，所以大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點都在酸性范圍(pH4.0-5.5)

但僅靠調(diào)等電點還不能使大部分蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)是兩性物質(zhì)，在酸性溶液中，能與一些陰離子物質(zhì)如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽和過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等形成沉淀2）變性法

變性蛋白溶解度較小

最常用加熱法

加熱不僅能使蛋白變性，還可降低液體黏度，提高過濾速率；

其他方法：

大幅度調(diào)節(jié)pH，加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑

變性法存在一定的局限

如加熱法只適用于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH也會導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且需消耗大量酸堿，而有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。3）吸附法加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白而將其除去

如四環(huán)素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白；在枯草芽孢桿菌發(fā)酵中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去凝聚和絮凝都都是發(fā)酵液預(yù)預(yù)處理的重要要方法，其處處理過程就是是將化學(xué)藥劑劑預(yù)先投加到到懸浮液中，，改變細(xì)胞、、菌體和蛋白白質(zhì)等粒子的的分散狀態(tài)，，破壞其穩(wěn)定定性，使它們們聚集成可分分離的絮凝體體，再進(jìn)行分分離。發(fā)酵液預(yù)處理理的方法—凝凝聚和絮凝凝聚指在投加的化化學(xué)物質(zhì)（如如水解的凝聚聚劑：鋁、鐵鐵的鹽類或石石灰等）作用用下，膠體脫脫穩(wěn)并使粒子子相互聚集成成1mm大小小塊狀凝聚體體的過程。電解質(zhì)的凝聚聚能力可用凝凝聚值表示，，即使膠粒發(fā)發(fā)生凝聚作用用的最小電解解質(zhì)濃度（mmol/L）。一般反離子的的價數(shù)越高，，凝聚值越小，，即凝聚能力力越強。如Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+絮凝指使用絮凝劑劑（通常是天天然或合成的的大分子量聚聚電解質(zhì)）將將膠體粒子交交聯(lián)成網(wǎng)，形形成10mm大小絮凝團團的過程。其中絮凝劑主主要起架橋作作用，工業(yè)上上使用到的有有聚丙烯酰胺胺類衍生物、、聚合鋁鹽、、海藻酸鈉、、殼聚糖等，，目前最常用用的是聚丙烯烯酰胺類衍生生物。1）板框(plateandframe)壓濾機板框過濾機結(jié)構(gòu)圖

1-尾板2-濾框3-濾板4-主梁5-頭板6-緊壓裝置二）發(fā)酵液過過濾常用設(shè)備備板框過濾機

Plateshifter1500x1500FilterPressClothwashing1）板板框(plateandframe)壓濾濾機2）帶帶式壓壓濾機機二）發(fā)發(fā)酵液液過濾濾常用用設(shè)備備發(fā)酵后后期要要少加加消泡泡劑和和少進(jìn)進(jìn)行補補料，，防止止消泡泡劑和和未用用完的的培養(yǎng)養(yǎng)基增增加過過濾難難度；；菌體自自溶前前放罐罐可防防止因因菌體體自溶溶釋放放出的的代謝謝產(chǎn)物物增加加發(fā)酵酵液黏黏度影響發(fā)發(fā)酵液液過濾濾的因因素1）菌菌體細(xì)細(xì)胞體體積真菌菌菌絲體體較粗粗大，，發(fā)酵酵液不不需特特殊處處理，，易過過濾；；放線菌菌菌絲絲細(xì)而而分支支，交交織成成網(wǎng)格格狀，，較難難過濾濾，發(fā)酵液液需經(jīng)經(jīng)預(yù)處處理，，凝固固蛋白白質(zhì)等等膠體體物質(zhì)質(zhì)，提提高過過濾速速度；；細(xì)菌菌菌體更更小，，發(fā)酵酵液如如不經(jīng)經(jīng)絮凝凝等預(yù)預(yù)處理理，很很難用用常規(guī)規(guī)過濾濾設(shè)備備進(jìn)行行過濾濾操作作。2）培培養(yǎng)基基組成成黃豆餅餅粉、、花生生餅粉粉等會會增加加過濾濾難度度3）放放罐時時機當(dāng)發(fā)酵酵液中中有不不溶性性多糖糖時，，會使使發(fā)酵酵液的的黏度度增大大而影影響過過濾速速度；；可用用酶將將其轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化成成可溶溶性單單糖，，提高高濾速速。提高過過濾性性能的的方法法1）加助助濾劑

助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，從而增加濾速；

常用硅藻土、珍珠巖等；

加入方法有兩種：a)預(yù)先在濾布上鋪上一層1-2mm厚的助濾劑；b)直接把助濾劑加入發(fā)酵液中。2）添加加填充凝凝固劑如CaSO4、AlPO4等本身就就是助濾濾劑，且且能使膠膠狀物和和懸浮物物凝固3）酶解解法（沉淀、吸附、萃取、超濾、結(jié)晶）發(fā)酵液初步純化細(xì)胞碎片分離細(xì)胞破碎細(xì)胞分離高度純化成品加工預(yù)處理胞外產(chǎn)物（加熱、調(diào)pH、絮凝）（過濾、離心分離、膜分離)（勻漿、研磨、酶解）（離心分離、雙水相萃取、膜分離）（重結(jié)晶、離子交換、色譜分離、膜分離）（濃縮、無菌過濾、干燥、成型）胞內(nèi)產(chǎn)物提取精制——產(chǎn)品品的收得得率和質(zhì)質(zhì)量控制制。細(xì)胞破碎碎目的代謝謝產(chǎn)物并并非都是是分泌型型的，許許多是存存在于細(xì)細(xì)胞內(nèi)的的，特別別是基因因工程菌菌在細(xì)胞胞內(nèi)形成成的包含含體是不不分泌的的，故需需進(jìn)行細(xì)細(xì)胞破碎碎。大規(guī)模破破碎細(xì)胞胞常用方方法；利用高壓壓使細(xì)胞胞懸液通通過針型型閥，由由于突然然減壓和和高速沖沖擊撞擊擊環(huán)，造造成細(xì)胞胞破碎。。影響破碎的主主要因素是壓壓力、溫度和和循環(huán)次數(shù)1）高壓勻漿漿法高壓勻漿器排出閥2）高速球磨磨法高速球磨機1-物料進(jìn)口2-物料出口3、4-冷卻水進(jìn)、出口5、6-夾套冷卻水進(jìn)、出口由于圓盤的高高速旋轉(zhuǎn)，細(xì)細(xì)胞懸浮液與與極細(xì)的玻璃璃小珠、石英英砂或氧化鋁鋁一起快速攪攪拌或研磨，，使細(xì)胞得以以破碎。3）超聲波法法常用超聲波頻頻率15-25kHz；；原理：由于超超聲波產(chǎn)生極極為強烈的沖沖擊波壓力，，引起黏滯性性旋渦在介質(zhì)質(zhì)中的細(xì)胞上上造成了剪切切力，促使細(xì)細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)發(fā)生流動，造造成細(xì)胞破碎碎；超聲波振蕩易易引起溫度的的劇烈上升，，操作時需冷冷卻；通常桿菌比球球菌易破，陰陰性菌比陽性性菌易破4）酶解法專一性強，條條件溫和；但但費用較高酶解法的另一一方式是利用用微生物的自自溶作用大多數(shù)微生物物都能產(chǎn)生一一種可以水解解自身細(xì)胞壁壁的酶；當(dāng)改改變一定的環(huán)環(huán)境條件，可可誘發(fā)這種酶酶的過量產(chǎn)生生或激發(fā)其他他自溶酶產(chǎn)生生，而發(fā)生自自溶現(xiàn)象。5）滲透壓沖沖擊法將細(xì)胞先放入入高滲透壓的的介質(zhì)中，如如高濃度的甘甘油或蔗糖液液，在達(dá)到平平衡后，介質(zhì)質(zhì)突然被稀釋釋，或?qū)⒓?xì)胞胞轉(zhuǎn)入水或緩緩沖液中，水水就會迅速進(jìn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，，致使細(xì)胞膨膨脹，引起細(xì)細(xì)胞壁的破裂裂；此法適用于細(xì)細(xì)胞壁較脆弱弱的，或者細(xì)細(xì)胞壁預(yù)先用用酶處理的，，或細(xì)胞壁合合成受到抑制制的微生物；；6）反復(fù)凍結(jié)結(jié)-融化法將細(xì)胞反復(fù)在在低溫下突然然冷凍后在室室溫下融化，，引起細(xì)胞破破裂；低溫冷冷凍一方面能能使細(xì)胞膜的的疏水鍵結(jié)構(gòu)構(gòu)斷裂，從而而增加細(xì)胞的的親水性能；；另一方面胞胞內(nèi)水結(jié)晶使使細(xì)胞內(nèi)外溶溶液濃度發(fā)生生變化，引起起細(xì)胞突然膨膨脹而破裂。。該法適用于細(xì)細(xì)胞壁較脆弱弱的細(xì)胞細(xì)胞破碎方法法二、提?。ǔ醭醪椒蛛x）（一）沉淀法法（Precipitation））沉淀是通過改改變條件或加加入某種試劑劑，使溶液中中的溶質(zhì)由液液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣坦滔辔龀龅倪^過程。方法簡單、成成本低、使用用廣泛，初步步分離的常用用手段。鹽析法有機溶劑沉淀淀法等電點沉淀法法非離子型聚合合物沉淀法聚電解質(zhì)沉淀淀法生成鹽復(fù)合物物沉淀法熱變性及酸堿堿變性沉淀法法中性鹽的加入入能破壞蛋白質(zhì)的的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)的的溶解度降低低而析出。1.鹽析法(Saltingout)破壞了蛋白質(zhì)質(zhì)在水中存在在的兩個因素素(水化層和和電荷),從從而使蛋白質(zhì)質(zhì)沉淀。將大量鹽加到到蛋白質(zhì)溶液液中，高濃度度的鹽離子（（如硫酸銨的的SO4和NH4)有很很強的水化力力，可奪取蛋蛋白質(zhì)分子的的水化層，使使之“失水””，于是蛋白白質(zhì)膠粒凝結(jié)結(jié)并沉淀析出出。蛋白質(zhì)鹽析常常用的中性鹽鹽，主要有硫硫酸銨、硫酸酸鎂、硫酸鈉鈉、氯化鈉、、磷酸鈉等。。鹽溶(saltingin)：許多蛋白在低低鹽濃度下發(fā)發(fā)生鹽溶現(xiàn)象象（比在純水水中的溶解度度大大增加））；高鹽濃度則鹽鹽析，離子強強度越大，蛋蛋白質(zhì)的溶解解度越低；由于各種蛋白白質(zhì)分子顆粒粒大小、親水水程度不同，，故鹽析所需需的鹽濃度也也不一樣，因因此調(diào)節(jié)混合合蛋白質(zhì)溶液液中的中性鹽鹽濃度可使各各種蛋白質(zhì)分分段沉淀。1）蛋白質(zhì)濃濃度蛋白質(zhì)濃度高高時，欲分離離的蛋白質(zhì)常常常夾雜著其其他蛋白質(zhì)地地一起沉淀出出來（共沉現(xiàn)現(xiàn)象）。因此此在鹽析前血血清要加等量量生理鹽水稀稀釋，使蛋白白質(zhì)含量在2.5-3.0%。2）離子強度度和種類3）溫度溫度是影響溶溶質(zhì)溶解度的的重要因素，，升高溫度可可以增加許多多無機鹽和小小分子有機化化合物的溶解解度；4）pH由于蛋白質(zhì)在在等電點時最最易沉淀，故故可選擇等電電點的pH作作為鹽析pH影響鹽析的因因素2.等電點沉沉淀法原理：利用兩性電解解質(zhì)在電中性性時溶解度最最低優(yōu)點：許多蛋白的等等電點都在偏偏酸范圍內(nèi)，，而許多無機機酸的價格低低廉；缺點：酸化時易引起起蛋白失活不少蛋白質(zhì)與與金屬結(jié)合后后會發(fā)生等電電點偏移，如如胰島素的等等電點為5.3，在與Zn2+結(jié)合形成胰島島素鋅鹽，其其等電點升為為6.2；故故加入金屬離離子后選擇等等電點沉淀時時，要注意調(diào)調(diào)整pH。二、提取（初初步分離）（二）結(jié)晶法法（crystallization）物質(zhì)從液態(tài)（（液體或熔融融體）或氣態(tài)態(tài)形成晶體的的過程叫結(jié)晶。加入能使結(jié)晶晶溶質(zhì)溶解度度降低的物質(zhì)質(zhì)，讓結(jié)晶溶溶質(zhì)形成過飽飽和液；例如卡那霉素素不溶于乙醇醇，向卡那霉霉素脫色液中中加入終濃度度為60%-80%的乙乙醇，就結(jié)晶晶析出;在普魯卡因青青霉素結(jié)晶時時，加入一定定量的食鹽，，可使結(jié)晶更更易析出結(jié)晶方法（過飽和溶液液形成的方法法）1）濃縮結(jié)晶晶減壓蒸發(fā)濃縮縮，達(dá)到過飽飽和2）冷卻結(jié)晶晶適用于溶解度度隨溫度變化化很大的物質(zhì)質(zhì)；先加熱使使其溶解，然然后冷卻結(jié)晶晶；3）化學(xué)反應(yīng)應(yīng)結(jié)晶加入反應(yīng)劑或或調(diào)pH，使使生成更低可可溶性物質(zhì)；如在青霉素醋醋酸丁酯提取取液中，加入入乙醇-醋酸酸鉀，因形成成的青霉素鉀鉀鹽難溶于醋醋酸丁酯而結(jié)結(jié)晶析出。4）解析結(jié)晶晶（drowningout）三、精制（高高度純化）（一）離子交交換法(Ionexchange)離子交換工作作原理根據(jù)物質(zhì)的酸酸堿性、極性性不同，在水水溶液中所帶帶陰陽離子不不同，電荷不不同的物質(zhì)對對層析柱上的的離子交換劑劑有不同的親親和力，改變變洗脫液的離離子強度或pH，不同物物質(zhì)就能依次次從層析柱中中分離出來。。在離子交換過過程中，離子子首先擴散到到樹脂表面，，通過樹脂擴擴散到交換位位置，在交換換位置進(jìn)行離離子交換。被被交換的分子子所帶電荷越越多，它與樹樹脂的結(jié)合越越緊密，也就就越不容易被被其它離子所所取代。被交交換的離子擴擴散到樹脂表表面，洗脫液液通過，被交交換的離子擴擴散到外部溶溶液中。三、精制（高高度純化）（二）色譜分分離法用微量注射器器針頭或微細(xì)細(xì)管把樣品點點一小點在層層析床的一端端。要求層析析床必須完全全干燥，點樣樣之后轉(zhuǎn)入裝裝有展層劑的的玻璃槽中。。當(dāng)展層劑的的前沿跑到濾濾紙全長的80％-90％時，將層析析床取出。紙層析可以用相對遷移率（（Rf）來表示一種物物質(zhì)的遷移：：或者也可以用用相對于一種已已知遷移率的的標(biāo)準(zhǔn)物的遷遷移（Rx））來表示：待測物移動的距離標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離Rx=組分移動的距離溶劑移動的距離Rf=薄層掃描儀快速；可用腐蝕性試試劑顯色；易于制備少量量樣品。薄層層析十六元環(huán)大環(huán)環(huán)內(nèi)酯類抗生生素的薄層色色譜圖1:乙酰螺旋霉素素;2:麥迪霉素;3:麥白霉素;4:吉他霉素;5:乙酰吉他霉素素9、靜夜四無鄰鄰，荒居舊業(yè)業(yè)貧。。12月-2212月-22Wednesday,December21,202210、雨中黃葉樹樹，燈下白頭頭人。。21:28:0421:28:0421:2812/21/20229:28:04PM11、以我獨沈久久，愧君相見見頻。。12月-2221:28:0421:28Dec-2221-Dec-2212、故人江海別別，幾度隔山山川。。21:28:0421:28:0421:28Wednesday,December21,202213、乍見見翻疑疑夢，，相悲悲各問問年。。。12月月-2212月月-2221:28:0421:28:04December21,202214、他鄉(xiāng)鄉(xiāng)生白白發(fā)，，舊國國見青青山。。。21十十二二月20229:28:04下下午21:28:0412月月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月229:28下下午12月-2221:28December21,202216、行動出成成果，工作作出財富。。。2022/12/2121:28:0421:28:0421December202217、做前，能能夠環(huán)視四四周；做時時，你只能能或者最好好沿著以腳腳為起點的的射線向前前。。9:28:04下下午9:28下下午21:28:0412月-229、沒沒有有失失敗敗，，只只有有暫暫時時停停止止成成功功??！。。12月月-2212月月-22Wednesday,December21,202210、很多多事情情努力力了未未必有有結(jié)果果，但但是不不努力力卻什什么改改變也也沒有有。。。21:28:0421:28:0421:2812/21/20229:28:04PM11、成成功功就就是是日日復(fù)復(fù)一一日日那那一一點點點點小小小小努努力力的的積積累累。。。。12月月-2221:28:0421:28Dec-2221-Dec-2212、世間成事，，不求其絕對對圓滿，留一一份不足，可可得無限完美美。。21:28:0421:28:0421:28Wednesday,December21,202213、不知知香積積寺，，數(shù)里里入云云峰。。。12月月-2212月月-2221:28:0421:28:04December21,202214、意意志志堅堅強強的的人人能能把把世世界界放放在在手手中中像像泥泥塊塊一一樣樣任任意意揉揉捏捏。。21十十二二月月20229:28:05下下午午21:28:0512月月-2215、楚楚塞塞三三湘湘接接，，荊荊門門九九派派通通。。。。。十二二月月229:28下下午午12月月-2221:28December21,202216、少年十十五二十十時，步步行奪得得胡馬騎騎。。2022/12/2121:28:0521:28:0521December202217、空山山新雨雨后，，天氣氣晚來來秋。。。9:28:05下下午9:28下下午午21:28:0512月月-229、楊柳散和和風(fēng)，青山山澹吾慮。。。12月-2212月-22