第十三章生化藥物制造工藝酶類藥物課件

第四節(jié)酶類藥物

一、酶類藥物的原料來(lái)源（一）原料選擇

選料應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）不同酶的原料選擇。（2）注意不同生長(zhǎng)發(fā)育情況及營(yíng)養(yǎng)狀況：微生物制酶，故需測(cè)其活力來(lái)決定取酶階段。要考慮動(dòng)物年齡及飼養(yǎng)條件等因素；?第四節(jié)酶類藥物?1（3）從原料來(lái)源是否豐富考慮；（4）從簡(jiǎn)化提純步驟著手。（5）如用動(dòng)物組織作原料，則此動(dòng)物宰殺后應(yīng)立即取材。從動(dòng)物或植物中提取酶受到原料的限制。用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)藥用酶，不受季節(jié)、氣候和地域的限制，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，成本低，能大規(guī)模生產(chǎn)。

?（3）從原料來(lái)源是否豐富考慮；?2（二）微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的重要條件。目前，優(yōu)良菌種的獲得有三條途徑：①是從自然界分離篩選；②是用物理或化學(xué)方法處理、誘變；③是用基因重組與細(xì)胞融合技術(shù)。微生物的分離篩選是一切工作的基礎(chǔ)。?（二）微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育?3（三）微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù)有了優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，只是酶生產(chǎn)的先決條件，要有效地進(jìn)行生產(chǎn)還必須探索菌株產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)條件。首先要合理選擇培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、pH和通氣量等。在工業(yè)生產(chǎn)中還要摸索一系列工程和工藝條件，如培養(yǎng)基的滅菌方式、種子培養(yǎng)條件、發(fā)酵罐的型式、通氣條件、攪拌速度、溫度和pH調(diào)節(jié)控制等。還要研究酶的分離提純技術(shù)和制備工藝，這些條件的綜合結(jié)果將決定酶生產(chǎn)本身的經(jīng)濟(jì)效益。?（三）微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù)?4二、酶類藥物的提取和純化（一）生物材料的預(yù)處理一般應(yīng)避免劇烈處理，但如是結(jié)合酶，則必須進(jìn)行劇烈處理。1、動(dòng)物材料的預(yù)處理（1）機(jī)械處理用絞肉機(jī)絞，一般細(xì)胞并不破碎，而有的酶必須細(xì)胞破碎后才能有效地提取，因此須采用特殊的勻漿才行。?二、酶類藥物的提取和純化?5在實(shí)驗(yàn)室常用的是玻璃勻漿器和組織搗碎器。工業(yè)上可用高壓勻漿泵。（2）反復(fù)凍融由于細(xì)胞中冰晶的形成，及剩下液體中鹽濃度的增高，能使細(xì)胞中顆粒及整個(gè)細(xì)胞破碎，從而使某些酶釋放出來(lái)。?在實(shí)驗(yàn)室常用的是玻璃勻漿器和組織搗碎器。?6（3）丙酮粉組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉，不僅可減少酶的變性，同時(shí)因細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的破碎使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合的某些化學(xué)鍵打開(kāi)，促使某些結(jié)合酶釋放到溶液中，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低溫下可保存數(shù)年。2、微生物的預(yù)處理要是酶是胞外酶，則可除去菌體后再直接從發(fā)酵液中吸附提取酶。但對(duì)胞內(nèi)酶則需將菌體細(xì)胞破壁，制成無(wú)細(xì)胞的懸液后再行提取。?（3）丙酮粉?7（1）干燥法干燥方法很多，常見(jiàn)有空氣干燥、真空干燥和冷凍干燥三種。（2）機(jī)械法常用的方法有研磨法，組織勻漿法，超聲波法，高壓勻漿法等。（3）酶法處理用得最多的是溶菌酶，也有用脫氧核糖核酸酶處理，操作與溶菌酶同。?（1）干燥法?8（二）酶的提取一般在提取前，應(yīng)通過(guò)調(diào)查研究，文獻(xiàn)檢索，詳細(xì)了解欲提取酶的性質(zhì)。提取方法主要有水溶液法，有機(jī)溶劑法和表面活性劑法三種。?（二）酶的提取?91、水溶液法常用稀鹽溶液或緩沖液提取。為了防止提取過(guò)程中酶活力降低，一般在低溫下操作。

?1、水溶液法?102、有機(jī)溶劑法某些結(jié)合酶如微粒體和線粒體膜的酶，由于和脂質(zhì)牢固結(jié)合，用水溶液很難提取，為此必須除去結(jié)合的脂質(zhì)，且不能使酶變性。最常用的有機(jī)溶劑是丁醇。

丁醇具有下述性能：

①親脂性強(qiáng)，特別是親磷脂的能力；

②兼具親水性，在0℃在水中的溶解度為10.5％；③在脂與水分子間能起類似去垢劑的橋梁作用。?2、有機(jī)溶劑法?113、表面活性劑法表面活性劑分子具有親水性的或疏水性的原子基團(tuán)。表面活性劑能與蛋白質(zhì)結(jié)合而分散在溶液中，故可用于提取結(jié)合酶，但此法用得較少。（三）酶制劑的工業(yè)提取法工業(yè)生產(chǎn)的酶有二種劑型——液體制劑和粉劑1、發(fā)酵液的預(yù)處理及過(guò)濾現(xiàn)在處理方法是，在發(fā)酵液中加絮凝劑或凝固劑。微生物發(fā)酵液的分離，過(guò)濾，常采用的設(shè)備是轉(zhuǎn)鼓式真空吸濾機(jī)、離心沉降分離機(jī)和板框壓濾機(jī)。?3、表面活性劑法?122、酶液的脫色工業(yè)上廉價(jià)的脫色劑是活性炭，用量通常為0．1％～1．5％。目前工業(yè)上大規(guī)模使用脫色樹(shù)脂國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的幾種脫色樹(shù)脂，效果都較好。3、鹽析法鹽析法的優(yōu)點(diǎn)是在常溫下不會(huì)造成酶的失活，若分級(jí)沉淀應(yīng)用得當(dāng)，雜蛋白雜質(zhì)也較少，適用于多種酶沉淀。?2、酶液的脫色?134、有機(jī)溶劑法用有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)及用分級(jí)沉淀法純化蛋白質(zhì)。工業(yè)上通常采用乙醇作為沉淀劑。5、噴霧干燥直接制各粉末酶制劑

噴霧干燥有很大局限性，尤其藥用酶制劑都很難過(guò)溫度這一關(guān)。

噴霧干燥用于菌體干燥，而藥用酶常用冷凍干燥。除上述方法外，工業(yè)上提取酶制劑的方法還有丹寧沉淀法、白土活性氧化鋁吸附法、pH或加熱沉淀法、蛋白質(zhì)表面變性法等。

?4、有機(jī)溶劑法?14（四）酶的純化酶的純化。評(píng)價(jià)主要看二個(gè)指標(biāo)，一是酶比活，二是總活力回收。本節(jié)重點(diǎn)討論酶在純化過(guò)程中遇到的一些技術(shù)難點(diǎn)。

1、雜質(zhì)的除去酶提取液中，除所需酶外，還含有大量的雜蛋白、多糖、脂類和核酸等。?（四）酶的純化?15（1）pH和加熱沉淀法

利用蛋白質(zhì)酸堿變性性質(zhì)的差別可以通過(guò)調(diào)pH和等電點(diǎn)除去某些雜蛋白，也可利用不同蛋白質(zhì)對(duì)熱穩(wěn)定的差異，使雜蛋白變性而沉淀。（2）蛋白質(zhì)表面變性法

利用蛋白質(zhì)表面變性性質(zhì)的差別，也可除去雜蛋白。例如：加入三氯甲烷和乙醇進(jìn)行震蕩，可以除去雜蛋白。（3）選擇性變性法

利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不同，除去雜蛋白。甚至可用2．5％三氯乙酸處理，這時(shí)其他雜蛋白都變性而沉淀。?（1）pH和加熱沉淀法?16（4）核酸沉淀劑法

在用微生物制備酶時(shí)，常含有較多的核酸，為此，可用核酸酶，將核酸降解成核苷酸。也可用一些核酸沉淀劑如二甲基十六烷基溴化銨、硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、魚(yú)精蛋白和二氯化錳等：（5）將酶與底物結(jié)合，酶和底物結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑結(jié)合后，穩(wěn)定性大大提高，這樣就可用加熱法除去雜蛋白。?（4）核酸沉淀劑法?172、脫鹽和濃縮（1）脫鹽酶的提純以及酶的性質(zhì)研究中，常常需要脫鹽。最常用的脫鹽方法是透析和凝膠過(guò)濾。（2）濃縮酶的濃縮方法很多，有冷凍干燥、離子交換、超濾、凝膠吸水、聚乙二醇吸水等。?2、脫鹽和濃縮?183、酶的結(jié)晶把酶提純到一定純度以后（通常純度應(yīng)達(dá)50％以上），可使其結(jié)晶，但伴隨著結(jié)晶的形成，酶的純度經(jīng)常有一定程度的提高。酶的結(jié)晶既是提純的結(jié)果，也是提純的手段，此外，為研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)提供Ⅹ射線衍射樣品，也是酶的結(jié)晶的重要目標(biāo)之一。

?3、酶的結(jié)晶?19（1）酶的結(jié)晶方法

酶的結(jié)晶方法主要是緩慢地改變酶蛋白的溶解度，使其略處于過(guò)飽和狀態(tài)。

改變酶溶解度的方法很多，一般新樣品往往要使用幾種方法才能得到結(jié)晶。?（1）酶的結(jié)晶方法?20

①鹽析法。

在適當(dāng)?shù)膒H、溫度等條件下，保持酶的穩(wěn)定，慢慢改變鹽濃度進(jìn)行結(jié)晶。結(jié)晶時(shí)采用的鹽有硫酸銨、檸檬酸鈉、乙酸鈉、硫酸鎂和甲酸鈉等。

?①鹽析法。?21②有機(jī)溶劑法。酶液中滴加有機(jī)溶劑，有時(shí)也能使酶形成結(jié)晶。結(jié)晶用的有機(jī)溶劑有：乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、異丙醇、二惡烷、二甲亞砜、二氧雜環(huán)己烷等。用有機(jī)溶劑法易引起酶失活。③復(fù)合結(jié)晶法。有時(shí)可以利用某些酶與有機(jī)化合物或金屬離子形成復(fù)合物或鹽的性質(zhì)來(lái)結(jié)晶。

④透析平衡法。對(duì)一定的鹽溶液或有機(jī)溶劑進(jìn)行透析平衡，這時(shí)酶液可緩慢地達(dá)到過(guò)飽和而析出結(jié)晶。?②有機(jī)溶劑法。?22⑤等電點(diǎn)法。一般地說(shuō)，在等電點(diǎn)附近酶的溶解度很小，這一特征為酶的結(jié)晶條件提供了理論根據(jù)。（2）結(jié)晶條件的選擇

在進(jìn)行酶的結(jié)晶時(shí)，要選擇一定條件與相應(yīng)的結(jié)晶方法配合。這不僅為了能夠得到結(jié)晶，也是為了保證不引起酶活力喪失。影響酶結(jié)晶因素很多，下列幾個(gè)條件尤為重要：?⑤等電點(diǎn)法。?23

①酶的純度?？偟膩?lái)說(shuō)酶的純度越高，結(jié)晶越容易，長(zhǎng)成大的單晶可能性也越大。

②酶的濃度。結(jié)晶母液通常應(yīng)保持盡可能高的濃度。酶的濃度越高越有利于溶液中溶質(zhì)分子間的相互碰撞聚合，形成結(jié)晶的機(jī)會(huì)也越大，對(duì)大多數(shù)酶來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)濃度為5～10mg／ml為好。

③溫度。結(jié)晶的溫度通常在4℃下或室溫25℃下，低溫條件下酶不僅溶解度低，而且不易變性。

?①酶的純度。?24④時(shí)間。結(jié)晶形成的時(shí)間長(zhǎng)短不一，從數(shù)小時(shí)到幾個(gè)月都有，有的甚至需要1年或更長(zhǎng)時(shí)間。

⑤pH。除沉淀劑的濃度外，在結(jié)晶條件方面最重要的因素是pH。結(jié)晶溶液pH一般選擇在被結(jié)晶酶的等電點(diǎn)附近。

⑥金屬離子。許多金屬離子能引起或有助于酶的結(jié)晶，在二價(jià)金屬離子存在情況下，有促進(jìn)結(jié)晶長(zhǎng)大作用。?④時(shí)間。?25

⑦晶種。不易結(jié)晶的蛋白質(zhì)和酶，有的需加入微量的晶種才能結(jié)晶。生長(zhǎng)大的單晶時(shí)，也可引入晶種。⑧結(jié)晶器皿處理。結(jié)晶用的器皿要充分清洗、烘干。使用前用結(jié)晶母液再?zèng)_洗一次，也可用壓縮空氣或惰性氣體吹去灰塵。用于長(zhǎng)結(jié)晶的玻璃器皿，可用硅涂料進(jìn)行表面處理，以使表面光滑且不潤(rùn)濕。這樣可減少晶核數(shù)目，有助于形成大的單晶。?⑦晶種。不易結(jié)晶的蛋白質(zhì)和酶，有的需加入微量的晶種264、酶分離和純化工作中的注意事項(xiàng)酶是蛋白質(zhì)，一般不太穩(wěn)定。提純過(guò)程中，酶純度越高，就越不穩(wěn)定，酶分離純化時(shí)尤其要注意以下幾點(diǎn)：（1）防止酶蛋白變性為防止酶蛋白變性，應(yīng)避免pH過(guò)高或過(guò)低，應(yīng)避免高溫。一般要在中性pH和低溫（4℃左右）下操作。為防止酶蛋白的表面變性，不可劇烈攪拌，以免產(chǎn)生泡沫。應(yīng)避免酶和重金屬或其他蛋白變性劑接觸。如要用有機(jī)溶劑處理酶液，操作盡可能在低溫下，短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。（2）防止輔因子的流失有些酶除酶蛋白外，還含有輔酶、輔基和金屬等輔因子。在進(jìn)行超濾、透析等操作時(shí)，要防止這些輔因子的流失。?4、酶分離和純化工作中的注意事項(xiàng)?27（3）防止酶被蛋白水解酶降解在提取液尤其微生物培養(yǎng)液中，常常同時(shí)存在一些蛋白水解酶，要及時(shí)采取有效措施將它們除去。如果操作時(shí)間長(zhǎng)，還要防止雜菌污染酶液，造成所需要酶的失活。?（3）防止酶被蛋白水解酶降解在提取液尤其微生物培養(yǎng)液中，常28三、重要酶類藥物的制備（一）藥用酶類的概述現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，其制劑品種已超過(guò)700余種。1、與治療胃腸道疾病有關(guān)的酶類藥物利用酶作為消化促進(jìn)劑，早已為人們所采用。

2、消炎酶類3、與纖維蛋白溶解作用有關(guān)的酶類4、抗腫瘤的酶5、其它藥用酶?三、重要酶類藥物的制備?291、胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）

胃蛋白酶廣泛存在于哺乳類動(dòng)物的胃液中，藥用胃蛋白酶系從豬、牛、羊等家畜的胃粘膜中提取。（1）組成（結(jié)構(gòu)）、性質(zhì)藥用胃蛋白酶是胃液中多種蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、組織蛋白酶、膠原酶等，為粗制的酶制劑。水溶液呈酸性，難溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。

pI為pH1.0，最適pH1.5～2.0?？扇苡?0％乙醇和pH4的20％乙醇中。

胃蛋白酶能水解大多數(shù)天然蛋白質(zhì)底物。?1、胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）?30（2）生產(chǎn)工藝1）工藝路線：

胃蛋白酶原鹽酸催化激活成胃蛋白酶。常用的脫脂劑有乙醚、氯仿、四氯化碳。?（2）生產(chǎn)工藝?312）工藝過(guò)程：3）胃膜素和胃蛋白酶聯(lián)產(chǎn)工藝：向經(jīng)消化、提取、脫脂、分層、濃縮及60％丙酮沉淀分離胃膜素的母液中，邊攪拌邊加冷丙酮，至比重為0.91，即有淡黃色胃蛋白酶沉出，靜放過(guò)夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。4）結(jié)晶胃蛋白酶的制備：藥用胃蛋白酶原粉，溶于20％酒精中，加H2SO4調(diào)pH3.0，5℃靜置20h后過(guò)濾，加硫酸鎂至飽和，進(jìn)行鹽析。鹽析物再在pH3.8～4.0的乙醇中溶解，過(guò)濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.8～2.0，即析出針狀胃蛋白酶。沉淀再溶于20%pH4的乙醇中，過(guò)濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.8，在20℃放置，可得板狀或針狀結(jié)晶。?2）工藝過(guò)程：?322、胰蛋白酶

胰蛋白酶是從牛、羊胰臟提取、結(jié)晶的凍干制劑。（1）化學(xué)組成與性質(zhì)

易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。在pH1.8時(shí)，短時(shí)煮沸幾乎不失活；在堿溶液中加熱則變性沉淀，Ca2+有保護(hù)和激活作用，胰蛋白酶的pI為10.1。牛胰蛋白酶在腸激酶或自身催化下，釋放出6肽，變成有活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶專一作用于由堿性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所組成的肽鍵。酶本身很容易自溶。?2、胰蛋白酶?33（2）生產(chǎn)工藝1）工藝路線：?（2）生產(chǎn)工藝?343、尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）

尿激酶，是一種堿性蛋白酶。由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人及哺乳動(dòng)物的尿中。（1）組成（結(jié)構(gòu)）性質(zhì)1）尿中的尿胃蛋白酶原，在酸性條件下可以激活生成尿胃蛋白酶，把天然尿激酶原降解成為尿激酶。2）尿激酶是專一性很強(qiáng)的蛋白水解酶，它作用于精氨酸-纈氨酸鍵使纖溶酶原轉(zhuǎn)為纖溶酶。尿激酶也具有酯酶活力。?3、尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）?353）尿激酶的pI為pH8～9，主要部分在pH8.6左右。溶液狀態(tài)不穩(wěn)定，凍干狀態(tài)可穩(wěn)定數(shù)年。加入1％EDTA、人血白蛋白或明膠可防止酶的表面變性作用。（2）生產(chǎn)工藝1）工藝路線：?3）尿激酶的pI為pH8～9，主要部分在pH8.6左362）工藝過(guò)程：硅藻土吸附，0.02％氨水加0.1mol／L氯化鈉洗脫。QAE—Sephadex層析柱去熱原、色素。CM—C濃縮。

?2）工藝過(guò)程：?374、蚯蚓纖溶酶

《本草綱目》中記載蚯蚓又稱地龍、曲蟮，能活血化淤，主治肢體麻木，口眼歪斜．語(yǔ)言障礙，半身不遂等。近代生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，蚯蚓死后，其死體能很快的自行溶解。經(jīng)研究揭示，蚯蚓體內(nèi)存在有纖維蛋白水解酶及纖維蛋白酶原激活物質(zhì)而使其死體自行溶解。人們以人工養(yǎng)殖的蚯蚓為原料，獲得一組能水解纖維蛋白的活性物質(zhì)，稱為蚯蚓纖溶酶。經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)體內(nèi)、體外血栓和纖維蛋白均有明顯的溶解作用，能使纖維蛋白的精氨酸及賴氨酸羧基端鏈水解，又能激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶，具有雙重作用，溶栓更迅速，更徹底。?4、蚯蚓纖溶酶?38（1）化學(xué)組成和性質(zhì)

蚯蚓纖溶酶是一組蛋白水解酶類。蚯蚓的種類不同，其含酶量和酶的活性也不同活性組分的相對(duì)分子量通常在20000～70000。呈白色或微黃色粉末，易溶于水，最適pH8，加熱70℃全部失去活力。制備時(shí)，常選用赤子愛(ài)勝蚓、鋸齒遠(yuǎn)蚓、太平2號(hào)蚓（赤子愛(ài)勝蚓與美國(guó)紅蚯蚓雜交種）、湖北環(huán)毛蚓）等。?（1）化學(xué)組成和性質(zhì)?392）以赤子愛(ài)勝蚓為原料制備蚯蚓纖溶酶取人工養(yǎng)殖蚯蚓放入水中浸泡1h，盡量排出內(nèi)臟污物，洗凈，于組織搗碎機(jī)中勻漿，再加入等體積0．1mol／LNaCl液，于冰箱中提取6h，以6000r／min離心20min，棄取沉淀，上清液加固體（NH4）2SO4至70％飽和度，冰箱放置過(guò)夜，次日過(guò)濾，收集沉淀，透析去鹽，以8000r／min離心30min，上清液冷凍干燥，得蚯蚓纖溶酶粗品。將粗品經(jīng)SephadexG－175柱凝膠過(guò)濾，分出3個(gè)組分，纖溶活性幾種在B峰。將B峰合并，透析，冷凍干燥。

?2）以赤子愛(ài)勝蚓為原料制備蚯蚓纖溶酶?40取B峰40mg在DEAE－SephadexCL－6B柱上層析分離，層析柱以0．02mol／L，pH7．8磷酸鹽緩沖液平衡，樣品上柱，用NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，其中峰B－Ⅱ至峰B－Ⅷ有纖溶活性。?取B峰40mg在DEAE－SephadexCL415、溶菌酶（Lysozyme）

溶菌酶，又稱胞壁質(zhì)酶或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶。它廣泛存在于鳥(niǎo)類和家禽的蛋清、哺乳動(dòng)物的淚、唾液、血漿、尿、乳汁、白細(xì)胞和組織（如肝、腎）細(xì)胞內(nèi)，其中以蛋清含量最豐富。

溶菌酶是一種具有殺菌作用的天然抗感染物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗炎癥。（1）組成（結(jié)構(gòu)）和性質(zhì)

溶菌酶是一堿性球蛋白，分子中堿性氨基酸、酰氨殘基及芳香族氨基酸（如色氨酸）比例很高。?5、溶菌酶（Lysozyme）?42

溶菌酶能催化粘多糖或甲殼素中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵。

溶菌酶是一種罕見(jiàn)的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。在pH5.5加熱4h后，酶變得更活潑。低濃度的Mn（10-7mol／L）在中性和堿性條件下能使酶免受熱的失活作用。?溶菌酶能催化粘多糖或甲殼素中的N-乙酰胞壁酸和N-乙43（2）生產(chǎn)工藝1）工藝路線?（2）生產(chǎn)工藝?44每一次的加油，每一次的努力都是為了下一次更好的自己。12月-2212月-22Thursday,December29,2022天生我材必有用，千金散盡還復(fù)來(lái)。14:38:4514:38:4514:3812/29/20222:38:45PM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。12月-2214:38:4514:38Dec-2229-Dec-22得道多助失道寡助，掌控人心方位上。14:38:4514:38:4514:38Thursday,December29,2022安全在于心細(xì)，事故出在麻痹。12月-2212月-2214:38:4514:38:45December29,2022加強(qiáng)自身建設(shè)，增強(qiáng)個(gè)人的休養(yǎng)。2022年12月29日2:38下午12月-2212月-22擴(kuò)展市場(chǎng)，開(kāi)發(fā)未來(lái)，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)在。29十二月20222:38:45下午14:38:4512月-22做專業(yè)的企業(yè)，做專業(yè)的事情，讓自己專業(yè)起來(lái)。十二月222:38下午12月-2214:38December29,2022時(shí)間是人類發(fā)展的空間。2022/12/2914:38:4514:38:4529December2022科學(xué)，你是國(guó)力的靈魂；同時(shí)又是社會(huì)發(fā)展的標(biāo)志。2:38:45下午2:38下午14:38:4512月-22每天都是美好的一天，新的一天開(kāi)啟。12月-2212月-2214:3814:38:4514:38:45Dec-22人生不是自發(fā)的自我發(fā)展，而是一長(zhǎng)串機(jī)緣。事件和決定，這些機(jī)緣、事件和決定在它們實(shí)現(xiàn)的當(dāng)時(shí)是取決于我們的意志的。2022/12/2914:38:45Thursday,December29,2022感情上的親密，發(fā)展友誼；錢(qián)財(cái)上的親密，破壞友誼。12月-222022/12/2914:38:4512月-22謝謝大家！每一次的加油，每一次的努力都是為了下一次更好的自己。12月-45第四節(jié)酶類藥物

一、酶類藥物的原料來(lái)源（一）原料選擇

選料應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）不同酶的原料選擇。（2）注意不同生長(zhǎng)發(fā)育情況及營(yíng)養(yǎng)狀況：微生物制酶，故需測(cè)其活力來(lái)決定取酶階段。要考慮動(dòng)物年齡及飼養(yǎng)條件等因素；?第四節(jié)酶類藥物?46（3）從原料來(lái)源是否豐富考慮；（4）從簡(jiǎn)化提純步驟著手。（5）如用動(dòng)物組織作原料，則此動(dòng)物宰殺后應(yīng)立即取材。從動(dòng)物或植物中提取酶受到原料的限制。用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)藥用酶，不受季節(jié)、氣候和地域的限制，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，成本低，能大規(guī)模生產(chǎn)。

?（3）從原料來(lái)源是否豐富考慮；?47（二）微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑的重要條件。目前，優(yōu)良菌種的獲得有三條途徑：①是從自然界分離篩選；②是用物理或化學(xué)方法處理、誘變；③是用基因重組與細(xì)胞融合技術(shù)。微生物的分離篩選是一切工作的基礎(chǔ)。?（二）微生物酶制劑高產(chǎn)菌株的選育?48（三）微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù)有了優(yōu)良的生產(chǎn)菌株，只是酶生產(chǎn)的先決條件，要有效地進(jìn)行生產(chǎn)還必須探索菌株產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)條件。首先要合理選擇培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、pH和通氣量等。在工業(yè)生產(chǎn)中還要摸索一系列工程和工藝條件，如培養(yǎng)基的滅菌方式、種子培養(yǎng)條件、發(fā)酵罐的型式、通氣條件、攪拌速度、溫度和pH調(diào)節(jié)控制等。還要研究酶的分離提純技術(shù)和制備工藝，這些條件的綜合結(jié)果將決定酶生產(chǎn)本身的經(jīng)濟(jì)效益。?（三）微生物酶制劑生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù)?49二、酶類藥物的提取和純化（一）生物材料的預(yù)處理一般應(yīng)避免劇烈處理，但如是結(jié)合酶，則必須進(jìn)行劇烈處理。1、動(dòng)物材料的預(yù)處理（1）機(jī)械處理用絞肉機(jī)絞，一般細(xì)胞并不破碎，而有的酶必須細(xì)胞破碎后才能有效地提取，因此須采用特殊的勻漿才行。?二、酶類藥物的提取和純化?50在實(shí)驗(yàn)室常用的是玻璃勻漿器和組織搗碎器。工業(yè)上可用高壓勻漿泵。（2）反復(fù)凍融由于細(xì)胞中冰晶的形成，及剩下液體中鹽濃度的增高，能使細(xì)胞中顆粒及整個(gè)細(xì)胞破碎，從而使某些酶釋放出來(lái)。?在實(shí)驗(yàn)室常用的是玻璃勻漿器和組織搗碎器。?51（3）丙酮粉組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉，不僅可減少酶的變性，同時(shí)因細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的破碎使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合的某些化學(xué)鍵打開(kāi)，促使某些結(jié)合酶釋放到溶液中，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低溫下可保存數(shù)年。2、微生物的預(yù)處理要是酶是胞外酶，則可除去菌體后再直接從發(fā)酵液中吸附提取酶。但對(duì)胞內(nèi)酶則需將菌體細(xì)胞破壁，制成無(wú)細(xì)胞的懸液后再行提取。?（3）丙酮粉?52（1）干燥法干燥方法很多，常見(jiàn)有空氣干燥、真空干燥和冷凍干燥三種。（2）機(jī)械法常用的方法有研磨法，組織勻漿法，超聲波法，高壓勻漿法等。（3）酶法處理用得最多的是溶菌酶，也有用脫氧核糖核酸酶處理，操作與溶菌酶同。?（1）干燥法?53（二）酶的提取一般在提取前，應(yīng)通過(guò)調(diào)查研究，文獻(xiàn)檢索，詳細(xì)了解欲提取酶的性質(zhì)。提取方法主要有水溶液法，有機(jī)溶劑法和表面活性劑法三種。?（二）酶的提取?541、水溶液法常用稀鹽溶液或緩沖液提取。為了防止提取過(guò)程中酶活力降低，一般在低溫下操作。

?1、水溶液法?552、有機(jī)溶劑法某些結(jié)合酶如微粒體和線粒體膜的酶，由于和脂質(zhì)牢固結(jié)合，用水溶液很難提取，為此必須除去結(jié)合的脂質(zhì)，且不能使酶變性。最常用的有機(jī)溶劑是丁醇。

丁醇具有下述性能：

①親脂性強(qiáng)，特別是親磷脂的能力；

②兼具親水性，在0℃在水中的溶解度為10.5％；③在脂與水分子間能起類似去垢劑的橋梁作用。?2、有機(jī)溶劑法?563、表面活性劑法表面活性劑分子具有親水性的或疏水性的原子基團(tuán)。表面活性劑能與蛋白質(zhì)結(jié)合而分散在溶液中，故可用于提取結(jié)合酶，但此法用得較少。（三）酶制劑的工業(yè)提取法工業(yè)生產(chǎn)的酶有二種劑型——液體制劑和粉劑1、發(fā)酵液的預(yù)處理及過(guò)濾現(xiàn)在處理方法是，在發(fā)酵液中加絮凝劑或凝固劑。微生物發(fā)酵液的分離，過(guò)濾，常采用的設(shè)備是轉(zhuǎn)鼓式真空吸濾機(jī)、離心沉降分離機(jī)和板框壓濾機(jī)。?3、表面活性劑法?572、酶液的脫色工業(yè)上廉價(jià)的脫色劑是活性炭，用量通常為0．1％～1．5％。目前工業(yè)上大規(guī)模使用脫色樹(shù)脂國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的幾種脫色樹(shù)脂，效果都較好。3、鹽析法鹽析法的優(yōu)點(diǎn)是在常溫下不會(huì)造成酶的失活，若分級(jí)沉淀應(yīng)用得當(dāng)，雜蛋白雜質(zhì)也較少，適用于多種酶沉淀。?2、酶液的脫色?584、有機(jī)溶劑法用有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)及用分級(jí)沉淀法純化蛋白質(zhì)。工業(yè)上通常采用乙醇作為沉淀劑。5、噴霧干燥直接制各粉末酶制劑

噴霧干燥有很大局限性，尤其藥用酶制劑都很難過(guò)溫度這一關(guān)。

噴霧干燥用于菌體干燥，而藥用酶常用冷凍干燥。除上述方法外，工業(yè)上提取酶制劑的方法還有丹寧沉淀法、白土活性氧化鋁吸附法、pH或加熱沉淀法、蛋白質(zhì)表面變性法等。

?4、有機(jī)溶劑法?59（四）酶的純化酶的純化。評(píng)價(jià)主要看二個(gè)指標(biāo)，一是酶比活，二是總活力回收。本節(jié)重點(diǎn)討論酶在純化過(guò)程中遇到的一些技術(shù)難點(diǎn)。

1、雜質(zhì)的除去酶提取液中，除所需酶外，還含有大量的雜蛋白、多糖、脂類和核酸等。?（四）酶的純化?60（1）pH和加熱沉淀法

利用蛋白質(zhì)酸堿變性性質(zhì)的差別可以通過(guò)調(diào)pH和等電點(diǎn)除去某些雜蛋白，也可利用不同蛋白質(zhì)對(duì)熱穩(wěn)定的差異，使雜蛋白變性而沉淀。（2）蛋白質(zhì)表面變性法

利用蛋白質(zhì)表面變性性質(zhì)的差別，也可除去雜蛋白。例如：加入三氯甲烷和乙醇進(jìn)行震蕩，可以除去雜蛋白。（3）選擇性變性法

利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的不同，除去雜蛋白。甚至可用2．5％三氯乙酸處理，這時(shí)其他雜蛋白都變性而沉淀。?（1）pH和加熱沉淀法?61（4）核酸沉淀劑法

在用微生物制備酶時(shí)，常含有較多的核酸，為此，可用核酸酶，將核酸降解成核苷酸。也可用一些核酸沉淀劑如二甲基十六烷基溴化銨、硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、魚(yú)精蛋白和二氯化錳等：（5）將酶與底物結(jié)合，酶和底物結(jié)合或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑結(jié)合后，穩(wěn)定性大大提高，這樣就可用加熱法除去雜蛋白。?（4）核酸沉淀劑法?622、脫鹽和濃縮（1）脫鹽酶的提純以及酶的性質(zhì)研究中，常常需要脫鹽。最常用的脫鹽方法是透析和凝膠過(guò)濾。（2）濃縮酶的濃縮方法很多，有冷凍干燥、離子交換、超濾、凝膠吸水、聚乙二醇吸水等。?2、脫鹽和濃縮?633、酶的結(jié)晶把酶提純到一定純度以后（通常純度應(yīng)達(dá)50％以上），可使其結(jié)晶，但伴隨著結(jié)晶的形成，酶的純度經(jīng)常有一定程度的提高。酶的結(jié)晶既是提純的結(jié)果，也是提純的手段，此外，為研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)提供Ⅹ射線衍射樣品，也是酶的結(jié)晶的重要目標(biāo)之一。

?3、酶的結(jié)晶?64（1）酶的結(jié)晶方法

酶的結(jié)晶方法主要是緩慢地改變酶蛋白的溶解度，使其略處于過(guò)飽和狀態(tài)。

改變酶溶解度的方法很多，一般新樣品往往要使用幾種方法才能得到結(jié)晶。?（1）酶的結(jié)晶方法?65

①鹽析法。

在適當(dāng)?shù)膒H、溫度等條件下，保持酶的穩(wěn)定，慢慢改變鹽濃度進(jìn)行結(jié)晶。結(jié)晶時(shí)采用的鹽有硫酸銨、檸檬酸鈉、乙酸鈉、硫酸鎂和甲酸鈉等。

?①鹽析法。?66②有機(jī)溶劑法。酶液中滴加有機(jī)溶劑，有時(shí)也能使酶形成結(jié)晶。結(jié)晶用的有機(jī)溶劑有：乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、異丙醇、二惡烷、二甲亞砜、二氧雜環(huán)己烷等。用有機(jī)溶劑法易引起酶失活。③復(fù)合結(jié)晶法。有時(shí)可以利用某些酶與有機(jī)化合物或金屬離子形成復(fù)合物或鹽的性質(zhì)來(lái)結(jié)晶。

④透析平衡法。對(duì)一定的鹽溶液或有機(jī)溶劑進(jìn)行透析平衡，這時(shí)酶液可緩慢地達(dá)到過(guò)飽和而析出結(jié)晶。?②有機(jī)溶劑法。?67⑤等電點(diǎn)法。一般地說(shuō)，在等電點(diǎn)附近酶的溶解度很小，這一特征為酶的結(jié)晶條件提供了理論根據(jù)。（2）結(jié)晶條件的選擇

在進(jìn)行酶的結(jié)晶時(shí)，要選擇一定條件與相應(yīng)的結(jié)晶方法配合。這不僅為了能夠得到結(jié)晶，也是為了保證不引起酶活力喪失。影響酶結(jié)晶因素很多，下列幾個(gè)條件尤為重要：?⑤等電點(diǎn)法。?68

①酶的純度?？偟膩?lái)說(shuō)酶的純度越高，結(jié)晶越容易，長(zhǎng)成大的單晶可能性也越大。

②酶的濃度。結(jié)晶母液通常應(yīng)保持盡可能高的濃度。酶的濃度越高越有利于溶液中溶質(zhì)分子間的相互碰撞聚合，形成結(jié)晶的機(jī)會(huì)也越大，對(duì)大多數(shù)酶來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)濃度為5～10mg／ml為好。

③溫度。結(jié)晶的溫度通常在4℃下或室溫25℃下，低溫條件下酶不僅溶解度低，而且不易變性。

?①酶的純度。?69④時(shí)間。結(jié)晶形成的時(shí)間長(zhǎng)短不一，從數(shù)小時(shí)到幾個(gè)月都有，有的甚至需要1年或更長(zhǎng)時(shí)間。

⑤pH。除沉淀劑的濃度外，在結(jié)晶條件方面最重要的因素是pH。結(jié)晶溶液pH一般選擇在被結(jié)晶酶的等電點(diǎn)附近。

⑥金屬離子。許多金屬離子能引起或有助于酶的結(jié)晶，在二價(jià)金屬離子存在情況下，有促進(jìn)結(jié)晶長(zhǎng)大作用。?④時(shí)間。?70

⑦晶種。不易結(jié)晶的蛋白質(zhì)和酶，有的需加入微量的晶種才能結(jié)晶。生長(zhǎng)大的單晶時(shí)，也可引入晶種。⑧結(jié)晶器皿處理。結(jié)晶用的器皿要充分清洗、烘干。使用前用結(jié)晶母液再?zèng)_洗一次，也可用壓縮空氣或惰性氣體吹去灰塵。用于長(zhǎng)結(jié)晶的玻璃器皿，可用硅涂料進(jìn)行表面處理，以使表面光滑且不潤(rùn)濕。這樣可減少晶核數(shù)目，有助于形成大的單晶。?⑦晶種。不易結(jié)晶的蛋白質(zhì)和酶，有的需加入微量的晶種714、酶分離和純化工作中的注意事項(xiàng)酶是蛋白質(zhì)，一般不太穩(wěn)定。提純過(guò)程中，酶純度越高，就越不穩(wěn)定，酶分離純化時(shí)尤其要注意以下幾點(diǎn)：（1）防止酶蛋白變性為防止酶蛋白變性，應(yīng)避免pH過(guò)高或過(guò)低，應(yīng)避免高溫。一般要在中性pH和低溫（4℃左右）下操作。為防止酶蛋白的表面變性，不可劇烈攪拌，以免產(chǎn)生泡沫。應(yīng)避免酶和重金屬或其他蛋白變性劑接觸。如要用有機(jī)溶劑處理酶液，操作盡可能在低溫下，短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。（2）防止輔因子的流失有些酶除酶蛋白外，還含有輔酶、輔基和金屬等輔因子。在進(jìn)行超濾、透析等操作時(shí)，要防止這些輔因子的流失。?4、酶分離和純化工作中的注意事項(xiàng)?72（3）防止酶被蛋白水解酶降解在提取液尤其微生物培養(yǎng)液中，常常同時(shí)存在一些蛋白水解酶，要及時(shí)采取有效措施將它們除去。如果操作時(shí)間長(zhǎng)，還要防止雜菌污染酶液，造成所需要酶的失活。?（3）防止酶被蛋白水解酶降解在提取液尤其微生物培養(yǎng)液中，常73三、重要酶類藥物的制備（一）藥用酶類的概述現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療，其制劑品種已超過(guò)700余種。1、與治療胃腸道疾病有關(guān)的酶類藥物利用酶作為消化促進(jìn)劑，早已為人們所采用。

2、消炎酶類3、與纖維蛋白溶解作用有關(guān)的酶類4、抗腫瘤的酶5、其它藥用酶?三、重要酶類藥物的制備?741、胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）

胃蛋白酶廣泛存在于哺乳類動(dòng)物的胃液中，藥用胃蛋白酶系從豬、牛、羊等家畜的胃粘膜中提取。（1）組成（結(jié)構(gòu)）、性質(zhì)藥用胃蛋白酶是胃液中多種蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶、組織蛋白酶、膠原酶等，為粗制的酶制劑。水溶液呈酸性，難溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。

pI為pH1.0，最適pH1.5～2.0。可溶于70％乙醇和pH4的20％乙醇中。

胃蛋白酶能水解大多數(shù)天然蛋白質(zhì)底物。?1、胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）?75（2）生產(chǎn)工藝1）工藝路線：

胃蛋白酶原鹽酸催化激活成胃蛋白酶。常用的脫脂劑有乙醚、氯仿、四氯化碳。?（2）生產(chǎn)工藝?762）工藝過(guò)程：3）胃膜素和胃蛋白酶聯(lián)產(chǎn)工藝：向經(jīng)消化、提取、脫脂、分層、濃縮及60％丙酮沉淀分離胃膜素的母液中，邊攪拌邊加冷丙酮，至比重為0.91，即有淡黃色胃蛋白酶沉出，靜放過(guò)夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。4）結(jié)晶胃蛋白酶的制備：藥用胃蛋白酶原粉，溶于20％酒精中，加H2SO4調(diào)pH3.0，5℃靜置20h后過(guò)濾，加硫酸鎂至飽和，進(jìn)行鹽析。鹽析物再在pH3.8～4.0的乙醇中溶解，過(guò)濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.8～2.0，即析出針狀胃蛋白酶。沉淀再溶于20%pH4的乙醇中，過(guò)濾，濾液用硫酸調(diào)pH至1.8，在20℃放置，可得板狀或針狀結(jié)晶。?2）工藝過(guò)程：?772、胰蛋白酶

胰蛋白酶是從牛、羊胰臟提取、結(jié)晶的凍干制劑。（1）化學(xué)組成與性質(zhì)

易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。在pH1.8時(shí)，短時(shí)煮沸幾乎不失活；在堿溶液中加熱則變性沉淀，Ca2+有保護(hù)和激活作用，胰蛋白酶的pI為10.1。牛胰蛋白酶在腸激酶或自身催化下，釋放出6肽，變成有活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶專一作用于由堿性氨基酸精氨酸及亮氨酸羧基所組成的肽鍵。酶本身很容易自溶。?2、胰蛋白酶?78（2）生產(chǎn)工藝1）工藝路線：?（2）生產(chǎn)工藝?793、尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）

尿激酶，是一種堿性蛋白酶。由腎臟產(chǎn)生，主要存在于人及哺乳動(dòng)物的尿中。（1）組成（結(jié)構(gòu)）性質(zhì)1）尿中的尿胃蛋白酶原，在酸性條件下可以激活生成尿胃蛋白酶，把天然尿激酶原降解成為尿激酶。2）尿激酶是專一性很強(qiáng)的蛋白水解酶，它作用于精氨酸-纈氨酸鍵使纖溶酶原轉(zhuǎn)為纖溶酶。尿激酶也具有酯酶活力。?3、尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）?803）尿激酶的pI為pH8～9，主要部分在pH8.6左右。溶液狀態(tài)不穩(wěn)定，凍干狀態(tài)可穩(wěn)定數(shù)年。加入1％EDTA、人血白蛋白或明膠可防止酶的表面變性作用。（2）生產(chǎn)工藝1）工藝路線：?3）尿激酶的pI為pH8～9，主要部分在pH8.6左812）工藝過(guò)程：硅藻土吸附，0.02％氨水加0.1mol／L氯化鈉洗脫。QAE—Sephadex層析柱去熱原、色素。CM—C濃縮。

?2）工藝過(guò)程：?824、蚯蚓纖溶酶

《本草綱目》中記載蚯蚓又稱地龍、曲蟮，能活血化淤，主治肢體麻木，口眼歪斜．語(yǔ)言障礙，半身不遂等。近代生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，蚯蚓死后，其死體能很快的自行溶解。經(jīng)研究揭示，蚯蚓體內(nèi)存在有纖維蛋白水解酶及纖維蛋白酶原激活物質(zhì)而使其死體自行溶解。人們以人工養(yǎng)殖的蚯蚓為原料，獲得一組能水解纖維蛋白的活性物質(zhì)，稱為蚯蚓纖溶酶。經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)體內(nèi)、體外血栓和纖維蛋白均有明顯的溶解作用，能使纖維蛋白的精氨酸及賴氨酸羧基端鏈水解，又能激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶，具有雙重作用，溶栓更迅速，更徹底。?4、蚯蚓纖溶酶?83（1）化學(xué)組成和性質(zhì)

蚯蚓纖溶酶是一組蛋白水解酶類。蚯蚓的種類不同，其含酶量和酶的活性也不同活性組分的相對(duì)分子量通常在20000～70000。呈白色或微黃色粉末，易溶于水，最適pH8，加熱70℃全部失去活力。制備時(shí)，常選用赤子愛(ài)勝蚓、鋸齒遠(yuǎn)蚓、太平2號(hào)蚓（赤子愛(ài)勝蚓與美國(guó)紅蚯蚓雜交種）、湖北環(huán)毛蚓）等。?（1）化學(xué)組成和性質(zhì)?842）