PCR原理技術與應用(附教學用)課件

PCR原理技術與應用PCR原理技術與應用1PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表達調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。PCR（PolymeraseChainReaction）2PCR技術的基本原理

一.PCR反應成分：

1.模板DNA；2.引物；3.四種脫氧核糖核苷酸；

4.DNA聚合酶；5.反應緩沖液、Mg2等。

二.PCR反應基本步驟：

1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（94℃，30s）。

2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補區(qū)結合（55℃，30s）。

3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應（70～72℃，30～60s）

PCR技術的基本原理

一.PCR反應成分：

1.模板DNA；31.變性(denaturation)：通過加熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開而成單鏈的過程。

2.退火(annealling)：當溫度降低時，引物與模板DNA中互補區(qū)域結合成雜交分子。

3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出與模板DNA鏈互補的DNA子鏈。

以上述三個步驟為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個循環(huán)的模板，經(jīng)過n次循環(huán)后，目的DNA以2n的形式增加。

1.變性(denaturation)：通過加熱使模板DNA的4PCR原理技術與應用(附教學用)課件5PCR反應的成分和作用

?總體積：一般為25μl～100μl

（一）無Mg2+buffer：由純水、KCl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應體系pH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。KCl可降低退火溫度，但不能超過50mmol/L，否則會抑制DNA聚合酶活性。

（二）Mg2+:終濃度為1.5～2.0mmol/L，其對應dNTP為200μmol/L，注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關系，由于dNTP與Taq酶竟爭Mg2+，當dNTP濃度達到1mmol/L時會抑制Taq酶的活性。Mg2+能影響反應的特異性和產(chǎn)率。

（三）BSA(牛血清白蛋白）：一般用乙?；腂SA，起著減少PCR管對Taq酶的吸附作用，對Taq酶有保護作用。

（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有較強酸性，其儲存液用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.5，一般存儲濃度為10mmol/L，各成份以等當量配制，反應終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應，但同時增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高精確性，而反應速度會降低。

PCR反應的成分和作用

?總體積：一般為25μl～1006（五）Taq酶：能耐95℃高溫而不失活，其最適pH值為8.3～8.5，最適溫度為75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補原則為基礎，按5’→3’方向逐個將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3’→5’的外切酶活性，沒有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過高,會增加其錯配率。用量一般為0.5～5個單位/100μl。

（六）模板：PCR對模板DNA的純度不要求很高，但應盡量不含有對PCR反應有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結合的蛋白質(zhì)。

模板DNA的量不能太高，否則擴增可能不會成功，在此情況下可適當稀釋模板。（七）引物：引物濃度一般為0.1～0.5μmol/L，濃度過高會引起錯配和非特異擴增，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長度一般15～30個堿基，引物過長或過短都會降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對，末位堿基最好選用A、C、G（因T錯配也能引發(fā)鏈的延伸）。

引物GC約占45～55%，堿基應盡量隨機分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應有互補鏈存在，不能與非目的擴增區(qū)有同源性。

（五）Taq酶：能耐95℃高溫而不失活，其最適pH值為8.37PCR反應條件的選擇（影響因素）溫度參數(shù)：

1.變性：模板變性完全與否是PCR成功的關鍵，一般先于94℃（或95℃）變性3～10min，接著94℃變性30～60s。

2.退火：退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。引物長度在15～25bp可通過公Tm=(GC)×4℃(AT)×2℃計算退火溫度，一般退火溫度在40～60℃之間，時間為30～45s。如果(GC)低于50%，退火溫度應低于55℃。較高的退火溫度可提高反應的特異性。3.延伸：延伸溫度應在Taq酶的最適溫度范圍之內(nèi)，一般在70～75℃。延伸時間要根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴增片段的長度確定，通常對于1kb以內(nèi)的片段1min是夠用的。

循環(huán)數(shù)：

PCR的循環(huán)數(shù)主要由模板DNA的量決定，一般20～30次循環(huán)數(shù)較合適，過多的循環(huán)數(shù)會增加非特異擴增產(chǎn)物，具體要多少循環(huán)數(shù)可通過預試驗確定。

PCR反應條件的選擇（影響因素）溫度參數(shù)：

1.變性：模板8PCR常見問題

一.沒有擴增產(chǎn)物

1.循環(huán)溫度：變性溫度、退火溫度

2.引物設計

3.DNA聚合酶活性

4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份)

5、DNA樣品

PCR常見問題

一.沒有擴增產(chǎn)物

1.循環(huán)溫度：變性溫度、9二.非特異產(chǎn)物及電泳呈涂布狀

1.Mg2濃度

2.調(diào)整引物、模板、聚合酶的用量

3.適當減少循環(huán)數(shù)

4.適當提高退火溫度，縮短退火或延伸時間二.非特異產(chǎn)物及電泳呈涂布狀

1.Mg2濃度

2.調(diào)整10?三.引物二聚體的形成

1.檢查引物的序列

2.提高退火溫度

3.調(diào)整引物與模板濃度

4.增加引物長度

?三.引物二聚體的形成

1.檢查引物的序列

2.提高退火11四.假陽性結果的預防

1、實驗器材應一次性使用(吸咀、PCR管)

2、注意操作環(huán)境，戴一次性手套

3、嚴格PCR操作規(guī)程

4、多次取樣的試劑應分裝

5、設置陰性對照和陽性對照四.假陽性結果的預防

1、實驗器材應一次性使用(吸咀、PC12PCR相關技術

一.錨定PCR(anchoredPCR)：

?引進錨定引物，可以幫助克服序列未知或序列未全知的障礙。

?在DNA3’-末端加上poly(dG)尾，與此相對應的錨定引物poly(dC)一般應在十二聚體以上。

PCR相關技術

一.錨定PCR(anchoredPCR)13二.不對稱PCR(asymmetricPCR)

不對稱PCR主要是在PCR體系中設計不同的引物濃度，兩條引物濃度比為1：50或1：100，前12個循環(huán)兩條模板等量擴增，之后低濃度引物消耗殆盡，其擴增產(chǎn)物減少以至于無；而高濃度引物介導產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物（即單鏈DNA）逐漸增加，可得到大量單鏈DNA（ssDNA）用于直接測序。二.不對稱PCR(asymmetricPCR)

不對稱PC14PCR原理技術與應用(附教學用)課件15四.多重PCR(multiplexPCR)

多重PCR是用多對引物同時對模板DNA上的多個區(qū)域進行擴增。

多重PCR技術的難點不是在于其原理和操作的復雜性，而是在于其多對引物的設計，必需保證多對引物之間不形成引物二聚體，引物與目標模板區(qū)域具有高度特異性。

應用于基因診斷，對與疾病相關的基因（龐大）進行擴增檢測。四.多重PCR(multiplexPCR)

16五.逆轉錄PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)

?由mRNA逆轉錄產(chǎn)生cDNA鏈作為PCR反應模板。

?逆轉錄合成cDNA時，引物可選用特異引物、隨機六聚體引物或寡聚dT(12-18)。

?設計RT-PCR的引物時最好是分散在不同的外顯子上，以免基因組DNA的污染導致假陽性結果五.逆轉錄PCR(reversetranscription17六.差別PCR(differentialPCR)

差別PCR是將靶基因與已知拷貝的參照基因置于同一PCR反應體系中，用同一套引物進行擴增，電泳染色后可根據(jù)參照基因的擴增產(chǎn)物與待測基因擴增產(chǎn)物的相對豐度對待測基因進行定量。六.差別PCR(differentialPCR)

18七.原位PCR(InsituPCR)

原位PCR是指在組織或細胞標本片上直接進行PCR，對細胞中的靶DNA進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法?？煞譃橹苯臃ê烷g接法。

基本步驟：組織切片或細胞固定→蛋白酶消化→原位PCR擴增→沖洗→產(chǎn)物檢測

優(yōu)點：靈敏度高，可進行細胞內(nèi)定位七.原位PCR(InsituPCR)

原位PCR是指在組19八.熒光定量PCR(FQ-PCR)

熒光定量PCR：融匯PCR技術、DNA探針雜交技術(標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團)，結合先進的光譜檢測技術發(fā)展起來的一項新技術。

主要原理是在待擴增區(qū)域結合上DNA探針，PCR過程中，具有5’→3’外切酶活性的Taq酶延伸引物鏈到DNA探針時，將DNA探針逐個降解，釋放出熒光報告基團，這樣PCR體系中熒光的強度與PCR產(chǎn)物量之間存在正比關系，可通過測定熒光強度而對PCR產(chǎn)物定量。

八.熒光定量PCR(FQ-PCR)

熒光定量PCR：融匯PC20?熒光定量PCR的優(yōu)點：

?1.可進行準確的定量檢測。用于基因診斷。

?2.定量范圍寬。

?3.特異性更強，克服了假陽性。

?4.操作簡單快速，無須后處理和電泳檢測。

?5.安全，技術易于學習，易于進行電腦化數(shù)據(jù)管理。?熒光定量PCR的優(yōu)點：

?1.可進行準確的定量檢測21PCR技術的應用

1.遺傳性疾病的基因診斷

2.傳染病的診斷(肝炎病毒)

3.癌基因檢測

4.法醫(yī)學(親子鑒定)上的應用

5.DNA測序

6.基因克隆

7.引入基因點突變,基因融合等

PCR技術的應用

1.遺傳性疾病的基因診斷

2.傳染病的診斷22關于親子鑒定人類基因組是一個結構十分穩(wěn)定的體系，同時又是一個變異的體系，在長期的進化過程中，基因組DNA的序列不斷發(fā)生變異。這些變異有些被保存下來，導致了不同種族，群體和個體基因組的差異和多態(tài)性，除同卵雙生子外，沒有兩個個體基因組是完全相同的。關于親子鑒定人類基因組是一個結構十分穩(wěn)定的體系，同時又是一個23《基因工程原理》吳乃虎P112用隨機引物擴增出來的PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳之后呈現(xiàn)的帶型，反應了模板DNA分子的總體特征。如果起始材料用的是細胞的總DNA，那么擴增的帶型代表著細胞基因組的結構特征，因此用隨機引物的PCR擴增能夠測定除兩個生物體基因組之間的差異。兩個物種的個體之間，親緣關系越近，其相應的PCR擴增帶型也就越相似，反之差異就越懸殊。這種技術也稱為隨機擴增多態(tài)DNA分析引物(randomamplifiedpolymorphicDNA,簡稱RAPD)《基因工程原理》吳乃虎P112用隨機引物擴增出來的PCR產(chǎn)24美一研究小組試圖通過RAPD技術分析檢測松樹是具有異常尾巴的一種兔子的假說，結果表明，松樹和兔子的RAPD帶型差異顯著，從而否認了這個假說。圖p113美一研究小組試圖通過RAPD技術分析檢測松樹是具有異常尾巴的25PCR原理技術與應用PCR原理技術與應用26PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表達調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。PCR（PolymeraseChainReaction）27PCR技術的基本原理

一.PCR反應成分：

1.模板DNA；2.引物；3.四種脫氧核糖核苷酸；

4.DNA聚合酶；5.反應緩沖液、Mg2等。

二.PCR反應基本步驟：

1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（94℃，30s）。

2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補區(qū)結合（55℃，30s）。

3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應（70～72℃，30～60s）

PCR技術的基本原理

一.PCR反應成分：

1.模板DNA；281.變性(denaturation)：通過加熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開而成單鏈的過程。

2.退火(annealling)：當溫度降低時，引物與模板DNA中互補區(qū)域結合成雜交分子。

3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出與模板DNA鏈互補的DNA子鏈。

以上述三個步驟為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個循環(huán)的模板，經(jīng)過n次循環(huán)后，目的DNA以2n的形式增加。

1.變性(denaturation)：通過加熱使模板DNA的29PCR原理技術與應用(附教學用)課件30PCR反應的成分和作用

?總體積：一般為25μl～100μl

（一）無Mg2+buffer：由純水、KCl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應體系pH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。KCl可降低退火溫度，但不能超過50mmol/L，否則會抑制DNA聚合酶活性。

（二）Mg2+:終濃度為1.5～2.0mmol/L，其對應dNTP為200μmol/L，注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關系，由于dNTP與Taq酶竟爭Mg2+，當dNTP濃度達到1mmol/L時會抑制Taq酶的活性。Mg2+能影響反應的特異性和產(chǎn)率。

（三）BSA(牛血清白蛋白）：一般用乙?；腂SA，起著減少PCR管對Taq酶的吸附作用，對Taq酶有保護作用。

（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有較強酸性，其儲存液用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.5，一般存儲濃度為10mmol/L，各成份以等當量配制，反應終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應，但同時增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高精確性，而反應速度會降低。

PCR反應的成分和作用

?總體積：一般為25μl～10031（五）Taq酶：能耐95℃高溫而不失活，其最適pH值為8.3～8.5，最適溫度為75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補原則為基礎，按5’→3’方向逐個將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3’→5’的外切酶活性，沒有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過高,會增加其錯配率。用量一般為0.5～5個單位/100μl。

（六）模板：PCR對模板DNA的純度不要求很高，但應盡量不含有對PCR反應有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結合的蛋白質(zhì)。

模板DNA的量不能太高，否則擴增可能不會成功，在此情況下可適當稀釋模板。（七）引物：引物濃度一般為0.1～0.5μmol/L，濃度過高會引起錯配和非特異擴增，濃度過低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過低。引物長度一般15～30個堿基，引物過長或過短都會降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對，末位堿基最好選用A、C、G（因T錯配也能引發(fā)鏈的延伸）。

引物GC約占45～55%，堿基應盡量隨機分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應有互補鏈存在，不能與非目的擴增區(qū)有同源性。

（五）Taq酶：能耐95℃高溫而不失活，其最適pH值為8.332PCR反應條件的選擇（影響因素）溫度參數(shù)：

1.變性：模板變性完全與否是PCR成功的關鍵，一般先于94℃（或95℃）變性3～10min，接著94℃變性30～60s。

2.退火：退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。引物長度在15～25bp可通過公Tm=(GC)×4℃(AT)×2℃計算退火溫度，一般退火溫度在40～60℃之間，時間為30～45s。如果(GC)低于50%，退火溫度應低于55℃。較高的退火溫度可提高反應的特異性。3.延伸：延伸溫度應在Taq酶的最適溫度范圍之內(nèi)，一般在70～75℃。延伸時間要根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴增片段的長度確定，通常對于1kb以內(nèi)的片段1min是夠用的。

循環(huán)數(shù)：

PCR的循環(huán)數(shù)主要由模板DNA的量決定，一般20～30次循環(huán)數(shù)較合適，過多的循環(huán)數(shù)會增加非特異擴增產(chǎn)物，具體要多少循環(huán)數(shù)可通過預試驗確定。

PCR反應條件的選擇（影響因素）溫度參數(shù)：

1.變性：模板33PCR常見問題

一.沒有擴增產(chǎn)物

1.循環(huán)溫度：變性溫度、退火溫度

2.引物設計

3.DNA聚合酶活性

4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份)

5、DNA樣品

PCR常見問題

一.沒有擴增產(chǎn)物

1.循環(huán)溫度：變性溫度、34二.非特異產(chǎn)物及電泳呈涂布狀

1.Mg2濃度

2.調(diào)整引物、模板、聚合酶的用量

3.適當減少循環(huán)數(shù)

4.適當提高退火溫度，縮短退火或延伸時間二.非特異產(chǎn)物及電泳呈涂布狀

1.Mg2濃度

2.調(diào)整35?三.引物二聚體的形成

1.檢查引物的序列

2.提高退火溫度

3.調(diào)整引物與模板濃度

4.增加引物長度

?三.引物二聚體的形成

1.檢查引物的序列

2.提高退火36四.假陽性結果的預防

1、實驗器材應一次性使用(吸咀、PCR管)

2、注意操作環(huán)境，戴一次性手套

3、嚴格PCR操作規(guī)程

4、多次取樣的試劑應分裝

5、設置陰性對照和陽性對照四.假陽性結果的預防

1、實驗器材應一次性使用(吸咀、PC37PCR相關技術

一.錨定PCR(anchoredPCR)：

?引進錨定引物，可以幫助克服序列未知或序列未全知的障礙。

?在DNA3’-末端加上poly(dG)尾，與此相對應的錨定引物poly(dC)一般應在十二聚體以上。

PCR相關技術

一.錨定PCR(anchoredPCR)38二.不對稱PCR(asymmetricPCR)

不對稱PCR主要是在PCR體系中設計不同的引物濃度，兩條引物濃度比為1：50或1：100，前12個循環(huán)兩條模板等量擴增，之后低濃度引物消耗殆盡，其擴增產(chǎn)物減少以至于無；而高濃度引物介導產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物（即單鏈DNA）逐漸增加，可得到大量單鏈DNA（ssDNA）用于直接測序。二.不對稱PCR(asymmetricPCR)

不對稱PC39PCR原理技術與應用(附教學用)課件40四.多重PCR(multiplexPCR)

多重PCR是用多對引物同時對模板DNA上的多個區(qū)域進行擴增。

多重PCR技術的難點不是在于其原理和操作的復雜性，而是在于其多對引物的設計，必需保證多對引物之間不形成引物二聚體，引物與目標模板區(qū)域具有高度特異性。

應用于基因診斷，對與疾病相關的基因（龐大）進行擴增檢測。四.多重PCR(multiplexPCR)

41五.逆轉錄PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)

?由mRNA逆轉錄產(chǎn)生cDNA鏈作為PCR反應模板。

?逆轉錄合成cDNA時，引物可選用特異引物、隨機六聚體引物或寡聚dT(12-18)。

?設計RT-PCR的引物時最好是分散在不同的外顯子上，以免基因組DNA的污染導致假陽性結果五.逆轉錄PCR(reversetranscription42六.差別PCR(differentialPCR)

差別PCR是將靶基因與已知拷貝的參照基因置于同一PCR反應體系中，用同一套引物進行擴增，電泳染色后可根據(jù)參照基因的擴增產(chǎn)物與待測基因擴增產(chǎn)物的相對豐度對待測基因進行定量。六.差別PCR(differentialPCR)

43七.原位PCR(InsituPCR)

原位PCR是指在組織或細胞標本片上直接進行PCR，對細胞中的靶DNA進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法?？煞譃橹苯臃ê烷g接法。

基本步驟：組織切片或細胞固定→蛋白酶消化→原位PCR擴增→沖洗→產(chǎn)物檢測

優(yōu)點：靈敏度高，可進行細胞內(nèi)定位七.原位PCR(InsituPCR)

原位PCR是指在組44八.熒光定量PCR(FQ-PCR)

熒光定量PCR：融匯PCR技術、DNA探針雜交技術(標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團)，結合先進的光譜檢測技術發(fā)展起來的一項新技術。

主要原理是在待擴