呼吸道標(biāo)本采集和結(jié)果解讀課件

破解呼吸道感染病原學(xué)診斷的困境：需要你我他王

輝北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科Email：whuibj@163.comL.CN.MKT.GM.04.2016.50591破解呼吸道感染病原學(xué)診斷的困境：需要你我他王輝L.CN.M內(nèi)容

呼吸道感染病原學(xué)

困境和挑戰(zhàn)可能的破解之道22內(nèi)容呼吸道感染病原學(xué)22TheThreeMostImportantElementsinPracticingMedicineWilliamOsler,ThePrinciplesandPracticeofMedicine,1892Diagnosis!Diagnosis!Diagnosis!

Medicineisascienceofuncertaintyandanartofprobability.

最重要的是不要看遠(yuǎn)方模糊的事，而是做好手頭清楚的事

3王輝-實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)TheThreeMostImportantEleme歐洲流調(diào)：CAP的主要病原體病原體檢出率(%)一項(xiàng)1996年11月至2008年7月在西班牙進(jìn)行的CAP流調(diào)研究，納入3,524例CAP患者(15%門診患者,85%住院患者)，其中1,463例患者病原學(xué)呈陽性反應(yīng)。CillónizC,etal.Thorax.2011;66(4):340-346.肺炎鏈球菌和非典型病原體是CAP最主要致病菌，混合感染占重要地位N=14634歐洲流調(diào)：CAP的主要病原體病原體檢出率(%)一項(xiàng)1996年

我國CAP的主要致病菌病原體檢出率(%)入選2003年12月至2004年11月中國7個城市12個中心的665例CAP患者并進(jìn)行病原體檢測2006年我國CAP的大型流調(diào)研究顯示：肺炎支原體是我國CAP的最主要致病菌，其次為肺炎鏈球菌1在我國已經(jīng)完成的另兩項(xiàng)全國多中心成人CAP調(diào)查中，肺炎支原體感染的比例分別達(dá)到了20.7%和38.9%，均已超過了肺炎鏈球菌(分離率分別為10.3%和14.8%)，成為成人CAP最常見的致病原2,3混合感染在社區(qū)呼吸道感染中占有重要地位，以細(xì)菌合并非典型病原體混合感染居多11.劉又寧陳民鈞趙鐵梅等.中華結(jié)核和呼吸雜志.2006;29(1):3-8；LiuYetal.BMCInfectiousDiseases.2009;9:31.3.TaoLLetal.ChinMedJ(Engl).2012;125(17):2967-2972.5

我國CAP的主要致病菌病原體檢出率(%)入選2003年12成人病毒性肺炎發(fā)病率高，但長期被忽視每年新發(fā)病毒性肺炎約200萬例，其中成人和兒童各100萬例10項(xiàng)成年人CAP綜述（共2910例），病毒性肺炎占22%JenningsLC,etal.Thorax2008;

63:42-8.RuuskanenO.Lancet2011;377:1264-75.6病毒科病毒種核酸類型正粘病毒科流感病毒單股RNA副粘病毒科呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、人類偏肺病毒單股RNA披膜病毒科風(fēng)疹病毒單股RNA小RNA病毒科鼻病毒、柯薩奇病毒和埃可病毒的部分型別單股RNA腺病毒科腺病毒雙股DNA冠狀病毒科人類冠狀病毒、SARS冠狀病毒單股RNA皰疹病毒科單純皰疹病毒、帶狀皰疹、EB和CMV雙股DNA細(xì)小病毒科人類博卡病毒單鏈DNA呼腸孤病毒科呼腸孤病毒（1，2，3，4型）雙鏈RNA6成人病毒性肺炎發(fā)病率高，但長期被忽視每年新發(fā)病毒性肺炎約20PathogenidentifiedPatientsn(%)RespiratoryViruses262(27.5)

InfluenzavirusA94(9.9)

Humanrhinovirus41(4.3)

Adenovirus40(4.2)

Humanmetapneumovirus17(1.8)

Parainfluenzavirustype116(1.7)

Parainfluenzavirustype314(1.5)

Parainfluenzavirustype211(1.2)

InfluenzavirusB6(0.6)

Humanenterovirus5(0.5)

RespiratorysyncytialvirustypeA5(0.5)

RespiratorysyncytialvirustypeB4(0.4)

CoronavirusOC43/HKU14(0.4)

Coronavirus229E/NL634(0.4)

Parainfluenzavirustype41(0.1)Bocavirus0(0.0)北京市成人CAP監(jiān)測網(wǎng)：病毒性肺炎27.5%2010-2012年本課題組牽頭，聯(lián)合北京市12家醫(yī)院954例成人CAP患者中，病毒性肺炎占27.5%。重要病毒：流感病毒、鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒。

JiuXinQu.BMCInfectDIs2015onlinefirst77PathogenidentifiedPatientsn上呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥88上呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥88上呼吸道感染標(biāo)本的采集9

用拭子同時擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁（3-5次）

咽拭子的采集方法上呼吸道感染標(biāo)本的采集9用拭子同時擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后9咽拭子的采集正確拿咽拭子的方法錯誤拿咽拭子的方法上呼吸道感染標(biāo)本的采集咽拭子的采集正確拿咽拭子的方法錯誤拿咽拭子的方法上呼吸道感10上呼吸道感染標(biāo)本的采集11

請患者頭部保持不動，將拭子輕輕轉(zhuǎn)動緩緩插入患者鼻腔，不要用力，

當(dāng)遇到阻力后即到達(dá)后鼻咽，停留數(shù)秒吸取分泌物，輕輕旋轉(zhuǎn)取出拭子鼻拭子標(biāo)本的采集上呼吸道感染標(biāo)本的采集11請患者頭部保持不動，將11病毒：選用滌綸或人造棉頭塑料柄的拭子（如：聚丙烯纖維頭），不能用藻酸鈣及木柄拭子，可使病毒失活或抑制PCR反應(yīng)。脫脂棉拭子含有熒光物質(zhì)，影響熒光定量PCR結(jié)果細(xì)菌：選用藻酸鈣拭子。棉拭子、尼龍拭子可抑制百日咳博德特菌生長采樣后用于病毒檢測的拭子，將拭子頭浸入含一定量采樣液的螺口管中，尾部棄去，旋緊管蓋，及時送檢，如不能立即送檢，可暫時儲存于4℃冰箱內(nèi)，嚴(yán)禁-20℃冷凍。用于細(xì)菌檢測的拭子插回采樣管中或適宜的轉(zhuǎn)運(yùn)裝置中，立即送檢12上呼吸道感染標(biāo)本的采集支原體保存液病毒采樣拭子細(xì)菌采樣拭子病毒：選用滌綸或人造棉頭塑料柄的拭子（如：聚丙烯纖維頭），不12下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥1313下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥1313下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥14下呼吸道標(biāo)本中，痰&支氣管鏡標(biāo)本最為重要！14下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥14下呼吸道標(biāo)本中，14Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfectious15標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfec16標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534Inconclusion,sputumGramstainishighlyspecificfortheetiologicdiagnosisofCAPandHCAPandusefulinguidingpathogen-targetedantibiotictreatment標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfec17病例1男性，64歲既往史：心肌梗死2次嚴(yán)重的充血性心力衰竭，行雙側(cè)冠狀動脈旁路移植手術(shù)心臟移植（植入式心臟復(fù)律除顫器）癥狀：呼吸困難、干咳、低熱初步診斷：支氣管肺泡灌洗：無致病菌，

正常菌群（真菌和分枝桿菌）胸片：右下肺局限性密度影肺癌？SeifertH.CID,2009,48:S238-45病例1男性，64歲肺癌？SeifertH.CID,2018手術(shù)，抗菌藥物患者治愈血培養(yǎng)：初次：類白喉?xiàng)U菌（皮膚污染）第二次：馬紅球菌（免疫缺陷宿主的條件致病菌）最終診斷：細(xì)菌性肺炎治療：紅霉素，3個月，治愈微生物結(jié)果—條件致病菌感染診斷關(guān)鍵肺內(nèi)腫塊基本吸收SeifertH.CID,2009,48:S238-45手術(shù)，抗菌藥物患者治愈血培養(yǎng)：微生物結(jié)果—條件19醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）的微生物標(biāo)本采集和送檢要求病原檢驗(yàn)項(xiàng)目最優(yōu)標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)要求；送檢最佳時間銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌屬、粘質(zhì)沙雷菌、不動桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌和MRSA、流感嗜血桿菌血培養(yǎng)血培養(yǎng)已經(jīng)注入標(biāo)本的培養(yǎng)瓶室溫下盡快送抵實(shí)驗(yàn)室。革蘭染色定量或半定量需氧和厭氧細(xì)菌培養(yǎng)痰；支氣管抽吸物；支氣管肺泡灌洗液；PSB；肺組織無菌杯或管，室溫，2h肺炎鏈球菌同上尿液無菌容器，室溫，2h混合厭氧菌（吸入）革蘭染色培養(yǎng)PSB標(biāo)本肺組織無菌管；無菌容器放組織；室溫，2h曲霉菌屬真菌涂片或其他真菌染色方法支氣管抽吸物無菌杯或管，室溫，2h真菌培養(yǎng)支氣管肺泡灌洗液；PSB半乳甘露聚糖（GM）1-3β-D葡聚糖（G）血清支氣管肺泡灌洗液促凝管，室溫，立即送檢無菌杯或管，室溫，2h20醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）的微生物標(biāo)本采集和送檢要求病原檢驗(yàn)項(xiàng)老年CAP患者的病原學(xué)診斷2011年ERS/ESCMD指南建議所有住院患者均應(yīng)進(jìn)行血培養(yǎng)北美指南建議對更嚴(yán)重的患者進(jìn)行血培養(yǎng)血培養(yǎng)有助于確診潛在的肺炎病原體和根據(jù)分離病原菌對疾病進(jìn)行重新評估血培養(yǎng)染色法呼吸樣本培養(yǎng)尿抗原檢測對初始抗生素治療方案調(diào)整具有重要的影響作用但同樣的呼吸道標(biāo)本缺乏較高的預(yù)測老年患者存在功能障礙：無法獲得可評價的痰液；口咽定植的G-菌、金黃色葡萄球菌和MDR菌較多肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌的細(xì)菌抗原采用尿免疫層析技術(shù)檢測肺炎鏈球菌抗原的敏感性約大于60%，成人患者大于90%軍團(tuán)菌抗原檢測的敏感性大于90%老年CAP患者的病原學(xué)診斷方法González-CastilloJ,etal.RevEspQuimioter.2014;27(1)：69-86老年CAP患者的病原學(xué)診斷2011年ERS/ESCMD指南建2122指南中強(qiáng)調(diào)：血培養(yǎng)至少送2套

在發(fā)熱開始的24h內(nèi)進(jìn)行血培養(yǎng)。盡力保證在抗感染治療前獲得首份血培養(yǎng)標(biāo)本。同時經(jīng)2個獨(dú)立部位抽取血標(biāo)本，此結(jié)果比單一部位的血培養(yǎng)更有臨床意義。除外新生兒外，不建議只進(jìn)行單套血培養(yǎng)（Ⅱ級）。48-96h后評估治療效果，再次血培養(yǎng)不能單取1套，必須同時抽取2套標(biāo)本（Ⅱ級）。但對懷疑血管內(nèi)的感染，則應(yīng)該間隔一段時間取不同部位的靜脈穿刺抽血，有助于診斷持續(xù)性菌血癥（Ⅱ級）。CritCareMed2008Vol.36,No.4；CLSI指南；英國指南22指南中強(qiáng)調(diào)：血培養(yǎng)至少送2套

在發(fā)熱開始的24h內(nèi)進(jìn)行2223“雙抽四瓶”，每瓶8-10ml

標(biāo)示“左側(cè)”、“右側(cè)”

無菌體液

如胸水等手冊宣講23“雙抽四瓶”，每瓶8-10ml手冊宣講23痰標(biāo)本在病原學(xué)診斷中面臨的困難CAP患者40%以上患者無法或及時產(chǎn)生痰痰標(biāo)本合格率較低，甚至送檢唾液培養(yǎng)：痰培養(yǎng)陽性率受多種影響因素影響且影響極大，包括標(biāo)本采集、運(yùn)輸、快速處理、合理應(yīng)用細(xì)胞學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)、前期無抗生素治療、解釋技能涂片革蘭染色：最新數(shù)據(jù)表明，通過革蘭染色辨別1669個CAP住院病人合格標(biāo)本，只有14%可以辨別出主要形態(tài)類型24AmericanThoracicSociety,InfectiousDiseasesSocietyofAmerica.GuidelinesontheManagementofCommunity-AcquiredPneumoniainAdults,2007:44(Suppl2)24痰標(biāo)本在病原學(xué)診斷中面臨的困難CAP患者40%以上患者無法或痰標(biāo)本不同外觀25唾液膿痰粘液樣痰帶血痰25痰標(biāo)本不同外觀25唾液膿痰粘液樣痰帶血痰2526標(biāo)本質(zhì)量評估－痰涂片Garbagein！唾液2626標(biāo)本質(zhì)量評估－痰涂片Garbagein！唾液26一個小調(diào)查隨機(jī)調(diào)查中國15家醫(yī)院2014年痰標(biāo)本數(shù)據(jù)2727一個小調(diào)查隨機(jī)調(diào)查中國15家醫(yī)院2014年痰標(biāo)本數(shù)據(jù)2727痰標(biāo)本判讀標(biāo)準(zhǔn)的比較2828痰標(biāo)本判讀標(biāo)準(zhǔn)的比較2828合格痰標(biāo)本：吞噬很重要29WBC內(nèi)吞噬：葡萄球菌29合格痰標(biāo)本：吞噬很重要29WBC內(nèi)吞噬：葡萄球菌29涂片項(xiàng)目報告格式30普通細(xì)菌涂片及染色30涂片項(xiàng)目報告格式30普通細(xì)菌涂片及染色30

痰培養(yǎng)標(biāo)本質(zhì)量情況

總數(shù)不合格不合格率兒科9777.78%內(nèi)科2620188371.87%急診64444168.48%血液科1501102067.95%外科39726767.25%婦產(chǎn)科231356.52%門診26715056.18%ICU121555745.84%

13家醫(yī)院，痰標(biāo)本合格率不足50%31痰培養(yǎng)標(biāo)本質(zhì)量情況總數(shù)不合格不合格率兒科9777.粒缺患者肺炎的致病菌CurrOpinPulmMed2015,21:260–27132粒缺患者肺炎的致病菌CurrOpinPulmMed2對于確診IA：GM的診斷效能CurrOpinPulmMed2015,21:260–27133對于確診IA：GM的診斷效能CurrOpinPulmM粒缺腫瘤肺炎：微生物學(xué)評價BAL是很好的診斷工具CurrOpinPulmMed2015,21:260–27134粒缺腫瘤肺炎：微生物學(xué)評價BAL是很好的診斷工具CurrO惡性粒細(xì)胞減少患者的肺炎診斷臨床評估+微生物學(xué)評估+分子微生物學(xué)評估：①最可靠：從無菌部位分離or呼吸道分泌物中非共生菌②BAL是首選下呼吸道標(biāo)本，越早采集越好，尤其使用抗生素之前，但不能延誤治療③支氣管活檢（TBBX）可揭示侵入血流感染，但培養(yǎng)不優(yōu)于BAL，且因?yàn)閻盒粤＜?xì)胞減少繼發(fā)血小板減少使得并發(fā)癥風(fēng)險高④分子方法：半乳甘露聚糖分子試驗(yàn)測試侵襲性曲霉病（FDA已經(jīng)批準(zhǔn)）ScottE.EvansandDavidE.Ost,Pneumoniaintheneutropeniccancerpatient,Infectiousdiseases,2015,21(3):261-27135惡性粒細(xì)胞減少患者的肺炎診斷臨床評估+微生物學(xué)評估+分子Sc日均痰標(biāo)本與BAL送檢對比3636日均痰標(biāo)本與BAL送檢對比3636BAL標(biāo)本量要求生理鹽水總灌入量不少于100ml，分3-5份進(jìn)行（標(biāo)準(zhǔn)為200-240ml，分4等份進(jìn)行）好的BAL標(biāo)本，至少30%灌入液回收<30%回收率的被視作不合格，需要重新采集（尤其是<10%回收率的標(biāo)本）MeyerKC,AnofficialAmericanThoracicSocietyclinicalpracticeguideline:theclinicalutilityofbronchoalveolarlavagecellularanalysisininterstitiallungdisease,AmJRespirCritCareMed.2012May1;185(9):1004-14BAL標(biāo)本量要求生理鹽水總灌入量不少于100ml，分3-5份37肺泡灌洗液標(biāo)本的優(yōu)點(diǎn)BALF標(biāo)本培養(yǎng)的陽性率高，合格率高BALF的采集不需要患者的配合【1】BALF能避免上呼吸道的定植菌的污染，減少對培養(yǎng)結(jié)果判斷的干擾。381.AmericanThoracicSociety,InfectiousDiseasesSocietyofAmerica.GuidelinesontheManagementofCommunity-AcquiredPneumoniainAdults,2007:44(Suppl2)38肺泡灌洗液標(biāo)本的優(yōu)點(diǎn)BALF標(biāo)本培養(yǎng)的陽性率高，合格率高3肺泡灌洗液標(biāo)本的處理39將所有標(biāo)本裝入50ml離心管內(nèi)漩渦震蕩30-60s每個平板定量涂10μLUsepipette.用吸管吸取0.1ml至1mlTSB（1：10稀釋）生長出>10個菌落培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)：相同形態(tài)菌落數(shù)×103CFU/mL

制作涂片（細(xì)胞離心)血平皿巧克力平皿麥康凱平皿若用接種環(huán)密涂平板，生長的菌落數(shù)量會低于實(shí)際數(shù)量。但用L棒涂布平板計(jì)數(shù)，定量培養(yǎng)結(jié)果更準(zhǔn)確39肺泡灌洗液標(biāo)本的處理39將所有標(biāo)本裝入50ml離心管內(nèi)漩渦震肺泡灌洗液的涂片革蘭染色適量BALF標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞離心，經(jīng)自然干燥、甲醇固定或火焰快速固定3次，革蘭染色標(biāo)本質(zhì)量判斷以扁平鱗狀上皮細(xì)胞占全部細(xì)胞比例<1%為合格標(biāo)本敏感度為104個細(xì)胞/mL，若每個油鏡視野可見1個或多個細(xì)菌，報告革蘭染色形態(tài)及白細(xì)胞結(jié)果，提示此菌與活動性肺炎相關(guān)。40PatrickRM.Manualofclinicalmicrobiology.9thed.US:ASMPress,2007:307-308中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——下呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)操作規(guī)范[S].40肺泡灌洗液的涂片革蘭染色適量BALF標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞離心，經(jīng)自然肺泡灌洗液定量培養(yǎng)的意義細(xì)菌性感染，濃度閾值104CFU/mL，低于閾值濃度時，定植可能性大;高于閾值時，感染可能性大。真菌性感染，目前沒有BAL的診斷性閾值。絲狀真菌也沒有閾值。但絲狀真菌在呼吸道分泌物中的價值遠(yuǎn)大于酵母菌屬。該類菌在EORTC/MSG指南中有“臨床診斷(probablediagnosis)”價值411.AGuidetoUtilizationoftheMicrobiologyLaboratoryforDiagnosisofInfectiousDiseases:2013RecommendationsbytheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica(IDSA)andtheAmericanSocietyforMicrobiology(ASM),2013:57(15August)2.EORTC/MSG41肺泡灌洗液定量培養(yǎng)的意義細(xì)菌性感染，濃度閾值104CFU/m培養(yǎng)與涂片結(jié)果不符：重新讀片中華結(jié)核和呼吸雜志,2011,34(9)42王輝-感染醫(yī)師培訓(xùn)培養(yǎng)與涂片結(jié)果不符：重新讀片中華結(jié)核和呼吸雜志,2011,3哮喘患者：結(jié)晶和庫什曼螺旋體43哮喘患者：結(jié)晶和庫什曼螺旋體43有意義的細(xì)菌濃度值（CFU/ml）標(biāo)本有意義的濃度CFU/ml自然咳痰107誘導(dǎo)痰不確定氣管內(nèi)吸取物106支氣管肺泡灌洗液104保護(hù)性毛刷103支氣管灌洗液不做培養(yǎng)44王輝-感染醫(yī)師培訓(xùn)有意義的細(xì)菌濃度值（CFU/ml）標(biāo)本有意義的濃度CFU/FilmArrayRespiratoryPanel第一個用單個標(biāo)本同時檢測病毒和細(xì)菌性呼吸道感染的測試2min上機(jī)時間，1h周轉(zhuǎn)時間300μl樣本（鼻咽拭子即可）/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm304177.htm/the-panels/FilmArrayRespiratoryPanel第一個45征集：最想對呼吸科大夫說的話留取痰培養(yǎng)后，能否先肉眼評估一下標(biāo)本質(zhì)量送檢痰培養(yǎng)的目的是什么？微生物檢驗(yàn)報告您參考嗎？何時參考？少送痰！多采血！我們盡全力幫您找破案證據(jù)（病原菌），前提是您提供一個好的案發(fā)現(xiàn)場（合格標(biāo)本）當(dāng)您面對感染病人時，微生物室與您零距離！不要忘了病毒不要用了抗生素之后，才想起送培養(yǎng)4646征集：最想對呼吸科大夫說的話留取痰培養(yǎng)后，能否先肉眼評估一下4747藥敏報告共識概要藥敏試驗(yàn)的意義和基本原則具體的專業(yè)要求特殊耐藥性和耐藥表型的審核要點(diǎn)報告形式48藥敏報告共識概要藥敏試驗(yàn)的意義和基本原則48藥敏試驗(yàn)的基本原則

藥敏試驗(yàn)的前提條件實(shí)驗(yàn)室的人員能力和客觀條件檢測環(huán)節(jié)的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果可信具有解釋結(jié)果的能力，能提供臨床會診分離株應(yīng)有臨床意義檢測結(jié)果應(yīng)準(zhǔn)確遵照CLSI文件質(zhì)控符合要求定期參加室間比對保留菌株49藥敏試驗(yàn)的基本原則藥敏試驗(yàn)的前提條件檢測結(jié)果應(yīng)準(zhǔn)確49標(biāo)本類型

腦脊髓液不報告：不能穿過血腦屏障的僅有口服劑型的抗菌藥、一二代頭孢菌素（除靜脈用頭孢呋辛）、頭霉素類、克林霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類

尿液僅在尿液標(biāo)本報告的藥：呋喃妥因不報告：氯霉素呼吸道不報告：達(dá)托霉素50標(biāo)本類型50標(biāo)本類型：糞便

X鶉雞腸球菌51標(biāo)本類型：糞便X鶉雞腸球菌51藥敏方法的選擇和判定標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范化遵照CLSI要求選擇采用近兩年的折點(diǎn)每年評審本室的藥敏折點(diǎn)范圍采用新折點(diǎn)前，先進(jìn)行臨床驗(yàn)證無法采用新折點(diǎn)，應(yīng)補(bǔ)充相應(yīng)耐藥表型檢測試驗(yàn)適用性：與菌種、藥敏方法、檢測條件、紙片含量、感染部位、藥物有關(guān)。CLSIM100未給折點(diǎn)的藥，參考國內(nèi)外專家共識、權(quán)威文獻(xiàn)52藥敏方法的選擇和判定標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范化遵照CLSI要求選擇52常規(guī)測試和報告藥物的選擇

最重要的依據(jù)：CLSI文件（CLSIM100-S25\M45）

菌種/藥物測試報告組合

結(jié)合當(dāng)?shù)夭≡V、代表藥、臨床需求、實(shí)驗(yàn)室條件、充分聽取臨床科室意見

自動化藥敏板：手工法補(bǔ)充無法滿足的重要藥物

連續(xù)性和靈活性：不同時期藥物的可比性、滿足臨床需求

有選擇地報告：同時報告多類敏感藥、A/B/C/U類藥物的意義

中國大陸最少必測藥/菌種組合參考：CLSIM100-S2553常規(guī)測試和報告藥物的選擇53讀書，使我們更加專業(yè)讀書，使我們更加專業(yè)54一個真正的感染與微生物交流平臺關(guān)注訂閱號

PIDMIC2016年11月18-20日第五屆京港感染論壇，北京55一個真正的感染與微生物交流平臺2016年11月18-20日第

結(jié)

論規(guī)范呼吸道標(biāo)本送檢：痰、BAL至關(guān)重要提高血培養(yǎng)的送檢意識！臨床和實(shí)驗(yàn)室密切關(guān)注標(biāo)本的質(zhì)量、送檢時間實(shí)驗(yàn)室規(guī)范操作，包括評估標(biāo)本質(zhì)量、建立培養(yǎng)規(guī)范快速、高通量分子技術(shù)漸入臨床，但標(biāo)本質(zhì)量、性能評價、結(jié)果解讀仍存在諸多問題未來大家攜手前行！56結(jié)論規(guī)范呼吸道標(biāo)本送檢：痰破解呼吸道感染病原學(xué)診斷的困境：需要你我他王

輝北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科Email：whuibj@163.comL.CN.MKT.GM.04.2016.505957破解呼吸道感染病原學(xué)診斷的困境：需要你我他王輝L.CN.M內(nèi)容

呼吸道感染病原學(xué)

困境和挑戰(zhàn)可能的破解之道5858內(nèi)容呼吸道感染病原學(xué)22TheThreeMostImportantElementsinPracticingMedicineWilliamOsler,ThePrinciplesandPracticeofMedicine,1892Diagnosis!Diagnosis!Diagnosis!

Medicineisascienceofuncertaintyandanartofprobability.

最重要的是不要看遠(yuǎn)方模糊的事，而是做好手頭清楚的事

59王輝-實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)TheThreeMostImportantEleme歐洲流調(diào)：CAP的主要病原體病原體檢出率(%)一項(xiàng)1996年11月至2008年7月在西班牙進(jìn)行的CAP流調(diào)研究，納入3,524例CAP患者(15%門診患者,85%住院患者)，其中1,463例患者病原學(xué)呈陽性反應(yīng)。CillónizC,etal.Thorax.2011;66(4):340-346.肺炎鏈球菌和非典型病原體是CAP最主要致病菌，混合感染占重要地位N=146360歐洲流調(diào)：CAP的主要病原體病原體檢出率(%)一項(xiàng)1996年

我國CAP的主要致病菌病原體檢出率(%)入選2003年12月至2004年11月中國7個城市12個中心的665例CAP患者并進(jìn)行病原體檢測2006年我國CAP的大型流調(diào)研究顯示：肺炎支原體是我國CAP的最主要致病菌，其次為肺炎鏈球菌1在我國已經(jīng)完成的另兩項(xiàng)全國多中心成人CAP調(diào)查中，肺炎支原體感染的比例分別達(dá)到了20.7%和38.9%，均已超過了肺炎鏈球菌(分離率分別為10.3%和14.8%)，成為成人CAP最常見的致病原2,3混合感染在社區(qū)呼吸道感染中占有重要地位，以細(xì)菌合并非典型病原體混合感染居多11.劉又寧陳民鈞趙鐵梅等.中華結(jié)核和呼吸雜志.2006;29(1):3-8；LiuYetal.BMCInfectiousDiseases.2009;9:31.3.TaoLLetal.ChinMedJ(Engl).2012;125(17):2967-2972.61

我國CAP的主要致病菌病原體檢出率(%)入選2003年12成人病毒性肺炎發(fā)病率高，但長期被忽視每年新發(fā)病毒性肺炎約200萬例，其中成人和兒童各100萬例10項(xiàng)成年人CAP綜述（共2910例），病毒性肺炎占22%JenningsLC,etal.Thorax2008;

63:42-8.RuuskanenO.Lancet2011;377:1264-75.62病毒科病毒種核酸類型正粘病毒科流感病毒單股RNA副粘病毒科呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、人類偏肺病毒單股RNA披膜病毒科風(fēng)疹病毒單股RNA小RNA病毒科鼻病毒、柯薩奇病毒和?？刹《镜牟糠中蛣e單股RNA腺病毒科腺病毒雙股DNA冠狀病毒科人類冠狀病毒、SARS冠狀病毒單股RNA皰疹病毒科單純皰疹病毒、帶狀皰疹、EB和CMV雙股DNA細(xì)小病毒科人類博卡病毒單鏈DNA呼腸孤病毒科呼腸孤病毒（1，2，3，4型）雙鏈RNA62成人病毒性肺炎發(fā)病率高，但長期被忽視每年新發(fā)病毒性肺炎約20PathogenidentifiedPatientsn(%)RespiratoryViruses262(27.5)

InfluenzavirusA94(9.9)

Humanrhinovirus41(4.3)

Adenovirus40(4.2)

Humanmetapneumovirus17(1.8)

Parainfluenzavirustype116(1.7)

Parainfluenzavirustype314(1.5)

Parainfluenzavirustype211(1.2)

InfluenzavirusB6(0.6)

Humanenterovirus5(0.5)

RespiratorysyncytialvirustypeA5(0.5)

RespiratorysyncytialvirustypeB4(0.4)

CoronavirusOC43/HKU14(0.4)

Coronavirus229E/NL634(0.4)

Parainfluenzavirustype41(0.1)Bocavirus0(0.0)北京市成人CAP監(jiān)測網(wǎng)：病毒性肺炎27.5%2010-2012年本課題組牽頭，聯(lián)合北京市12家醫(yī)院954例成人CAP患者中，病毒性肺炎占27.5%。重要病毒：流感病毒、鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒。

JiuXinQu.BMCInfectDIs2015onlinefirst6363PathogenidentifiedPatientsn上呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥6464上呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥88上呼吸道感染標(biāo)本的采集65

用拭子同時擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁（3-5次）

咽拭子的采集方法上呼吸道感染標(biāo)本的采集9用拭子同時擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后65咽拭子的采集正確拿咽拭子的方法錯誤拿咽拭子的方法上呼吸道感染標(biāo)本的采集咽拭子的采集正確拿咽拭子的方法錯誤拿咽拭子的方法上呼吸道感66上呼吸道感染標(biāo)本的采集67

請患者頭部保持不動，將拭子輕輕轉(zhuǎn)動緩緩插入患者鼻腔，不要用力，

當(dāng)遇到阻力后即到達(dá)后鼻咽，停留數(shù)秒吸取分泌物，輕輕旋轉(zhuǎn)取出拭子鼻拭子標(biāo)本的采集上呼吸道感染標(biāo)本的采集11請患者頭部保持不動，將67病毒：選用滌綸或人造棉頭塑料柄的拭子（如：聚丙烯纖維頭），不能用藻酸鈣及木柄拭子，可使病毒失活或抑制PCR反應(yīng)。脫脂棉拭子含有熒光物質(zhì)，影響熒光定量PCR結(jié)果細(xì)菌：選用藻酸鈣拭子。棉拭子、尼龍拭子可抑制百日咳博德特菌生長采樣后用于病毒檢測的拭子，將拭子頭浸入含一定量采樣液的螺口管中，尾部棄去，旋緊管蓋，及時送檢，如不能立即送檢，可暫時儲存于4℃冰箱內(nèi)，嚴(yán)禁-20℃冷凍。用于細(xì)菌檢測的拭子插回采樣管中或適宜的轉(zhuǎn)運(yùn)裝置中，立即送檢68上呼吸道感染標(biāo)本的采集支原體保存液病毒采樣拭子細(xì)菌采樣拭子病毒：選用滌綸或人造棉頭塑料柄的拭子（如：聚丙烯纖維頭），不68下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥6969下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥1313下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥70下呼吸道標(biāo)本中，痰&支氣管鏡標(biāo)本最為重要！70下呼吸道標(biāo)本類型及適應(yīng)癥14下呼吸道標(biāo)本中，14Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfectious71標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfec72標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534Inconclusion,sputumGramstainishighlyspecificfortheetiologicdiagnosisofCAPandHCAPandusefulinguidingpathogen-targetedantibiotictreatment標(biāo)本的質(zhì)量Fukuyamaetal.BMCInfec73病例1男性，64歲既往史：心肌梗死2次嚴(yán)重的充血性心力衰竭，行雙側(cè)冠狀動脈旁路移植手術(shù)心臟移植（植入式心臟復(fù)律除顫器）癥狀：呼吸困難、干咳、低熱初步診斷：支氣管肺泡灌洗：無致病菌，

正常菌群（真菌和分枝桿菌）胸片：右下肺局限性密度影肺癌？SeifertH.CID,2009,48:S238-45病例1男性，64歲肺癌？SeifertH.CID,2074手術(shù)，抗菌藥物患者治愈血培養(yǎng)：初次：類白喉?xiàng)U菌（皮膚污染）第二次：馬紅球菌（免疫缺陷宿主的條件致病菌）最終診斷：細(xì)菌性肺炎治療：紅霉素，3個月，治愈微生物結(jié)果—條件致病菌感染診斷關(guān)鍵肺內(nèi)腫塊基本吸收SeifertH.CID,2009,48:S238-45手術(shù)，抗菌藥物患者治愈血培養(yǎng)：微生物結(jié)果—條件75醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）的微生物標(biāo)本采集和送檢要求病原檢驗(yàn)項(xiàng)目最優(yōu)標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)要求；送檢最佳時間銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌屬、粘質(zhì)沙雷菌、不動桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌和MRSA、流感嗜血桿菌血培養(yǎng)血培養(yǎng)已經(jīng)注入標(biāo)本的培養(yǎng)瓶室溫下盡快送抵實(shí)驗(yàn)室。革蘭染色定量或半定量需氧和厭氧細(xì)菌培養(yǎng)痰；支氣管抽吸物；支氣管肺泡灌洗液；PSB；肺組織無菌杯或管，室溫，2h肺炎鏈球菌同上尿液無菌容器，室溫，2h混合厭氧菌（吸入）革蘭染色培養(yǎng)PSB標(biāo)本肺組織無菌管；無菌容器放組織；室溫，2h曲霉菌屬真菌涂片或其他真菌染色方法支氣管抽吸物無菌杯或管，室溫，2h真菌培養(yǎng)支氣管肺泡灌洗液；PSB半乳甘露聚糖（GM）1-3β-D葡聚糖（G）血清支氣管肺泡灌洗液促凝管，室溫，立即送檢無菌杯或管，室溫，2h76醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）的微生物標(biāo)本采集和送檢要求病原檢驗(yàn)項(xiàng)老年CAP患者的病原學(xué)診斷2011年ERS/ESCMD指南建議所有住院患者均應(yīng)進(jìn)行血培養(yǎng)北美指南建議對更嚴(yán)重的患者進(jìn)行血培養(yǎng)血培養(yǎng)有助于確診潛在的肺炎病原體和根據(jù)分離病原菌對疾病進(jìn)行重新評估血培養(yǎng)染色法呼吸樣本培養(yǎng)尿抗原檢測對初始抗生素治療方案調(diào)整具有重要的影響作用但同樣的呼吸道標(biāo)本缺乏較高的預(yù)測老年患者存在功能障礙：無法獲得可評價的痰液；口咽定植的G-菌、金黃色葡萄球菌和MDR菌較多肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌的細(xì)菌抗原采用尿免疫層析技術(shù)檢測肺炎鏈球菌抗原的敏感性約大于60%，成人患者大于90%軍團(tuán)菌抗原檢測的敏感性大于90%老年CAP患者的病原學(xué)診斷方法González-CastilloJ,etal.RevEspQuimioter.2014;27(1)：69-86老年CAP患者的病原學(xué)診斷2011年ERS/ESCMD指南建7778指南中強(qiáng)調(diào)：血培養(yǎng)至少送2套

在發(fā)熱開始的24h內(nèi)進(jìn)行血培養(yǎng)。盡力保證在抗感染治療前獲得首份血培養(yǎng)標(biāo)本。同時經(jīng)2個獨(dú)立部位抽取血標(biāo)本，此結(jié)果比單一部位的血培養(yǎng)更有臨床意義。除外新生兒外，不建議只進(jìn)行單套血培養(yǎng)（Ⅱ級）。48-96h后評估治療效果，再次血培養(yǎng)不能單取1套，必須同時抽取2套標(biāo)本（Ⅱ級）。但對懷疑血管內(nèi)的感染，則應(yīng)該間隔一段時間取不同部位的靜脈穿刺抽血，有助于診斷持續(xù)性菌血癥（Ⅱ級）。CritCareMed2008Vol.36,No.4；CLSI指南；英國指南22指南中強(qiáng)調(diào)：血培養(yǎng)至少送2套

在發(fā)熱開始的24h內(nèi)進(jìn)行7879“雙抽四瓶”，每瓶8-10ml

標(biāo)示“左側(cè)”、“右側(cè)”

無菌體液

如胸水等手冊宣講23“雙抽四瓶”，每瓶8-10ml手冊宣講79痰標(biāo)本在病原學(xué)診斷中面臨的困難CAP患者40%以上患者無法或及時產(chǎn)生痰痰標(biāo)本合格率較低，甚至送檢唾液培養(yǎng)：痰培養(yǎng)陽性率受多種影響因素影響且影響極大，包括標(biāo)本采集、運(yùn)輸、快速處理、合理應(yīng)用細(xì)胞學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)、前期無抗生素治療、解釋技能涂片革蘭染色：最新數(shù)據(jù)表明，通過革蘭染色辨別1669個CAP住院病人合格標(biāo)本，只有14%可以辨別出主要形態(tài)類型80AmericanThoracicSociety,InfectiousDiseasesSocietyofAmerica.GuidelinesontheManagementofCommunity-AcquiredPneumoniainAdults,2007:44(Suppl2)80痰標(biāo)本在病原學(xué)診斷中面臨的困難CAP患者40%以上患者無法或痰標(biāo)本不同外觀81唾液膿痰粘液樣痰帶血痰81痰標(biāo)本不同外觀25唾液膿痰粘液樣痰帶血痰2582標(biāo)本質(zhì)量評估－痰涂片Garbagein！唾液8226標(biāo)本質(zhì)量評估－痰涂片Garbagein！唾液26一個小調(diào)查隨機(jī)調(diào)查中國15家醫(yī)院2014年痰標(biāo)本數(shù)據(jù)8383一個小調(diào)查隨機(jī)調(diào)查中國15家醫(yī)院2014年痰標(biāo)本數(shù)據(jù)2727痰標(biāo)本判讀標(biāo)準(zhǔn)的比較8484痰標(biāo)本判讀標(biāo)準(zhǔn)的比較2828合格痰標(biāo)本：吞噬很重要85WBC內(nèi)吞噬：葡萄球菌85合格痰標(biāo)本：吞噬很重要29WBC內(nèi)吞噬：葡萄球菌29涂片項(xiàng)目報告格式86普通細(xì)菌涂片及染色86涂片項(xiàng)目報告格式30普通細(xì)菌涂片及染色30

痰培養(yǎng)標(biāo)本質(zhì)量情況

總數(shù)不合格不合格率兒科9777.78%內(nèi)科2620188371.87%急診64444168.48%血液科1501102067.95%外科39726767.25%婦產(chǎn)科231356.52%門診26715056.18%ICU121555745.84%

13家醫(yī)院，痰標(biāo)本合格率不足50%87痰培養(yǎng)標(biāo)本質(zhì)量情況總數(shù)不合格不合格率兒科9777.粒缺患者肺炎的致病菌CurrOpinPulmMed2015,21:260–27188粒缺患者肺炎的致病菌CurrOpinPulmMed2對于確診IA：GM的診斷效能CurrOpinPulmMed2015,21:260–27189對于確診IA：GM的診斷效能CurrOpinPulmM粒缺腫瘤肺炎：微生物學(xué)評價BAL是很好的診斷工具CurrOpinPulmMed2015,21:260–27190粒缺腫瘤肺炎：微生物學(xué)評價BAL是很好的診斷工具CurrO惡性粒細(xì)胞減少患者的肺炎診斷臨床評估+微生物學(xué)評估+分子微生物學(xué)評估：①最可靠：從無菌部位分離or呼吸道分泌物中非共生菌②BAL是首選下呼吸道標(biāo)本，越早采集越好，尤其使用抗生素之前，但不能延誤治療③支氣管活檢（TBBX）可揭示侵入血流感染，但培養(yǎng)不優(yōu)于BAL，且因?yàn)閻盒粤＜?xì)胞減少繼發(fā)血小板減少使得并發(fā)癥風(fēng)險高④分子方法：半乳甘露聚糖分子試驗(yàn)測試侵襲性曲霉?。‵DA已經(jīng)批準(zhǔn)）ScottE.EvansandDavidE.Ost,Pneumoniaintheneutropeniccancerpatient,Infectiousdiseases,2015,21(3):261-27191惡性粒細(xì)胞減少患者的肺炎診斷臨床評估+微生物學(xué)評估+分子Sc日均痰標(biāo)本與BAL送檢對比9292日均痰標(biāo)本與BAL送檢對比3636BAL標(biāo)本量要求生理鹽水總灌入量不少于100ml，分3-5份進(jìn)行（標(biāo)準(zhǔn)為200-240ml，分4等份進(jìn)行）好的BAL標(biāo)本，至少30%灌入液回收<30%回收率的被視作不合格，需要重新采集（尤其是<10%回收率的標(biāo)本）MeyerKC,AnofficialAmericanThoracicSocietyclinicalpracticeguideline:theclinicalutilityofbronchoalveolarlavagecellularanalysisininterstitiallungdisease,AmJRespirCritCareMed.2012May1;185(9):1004-14BAL標(biāo)本量要求生理鹽水總灌入量不少于100ml，分3-5份93肺泡灌洗液標(biāo)本的優(yōu)點(diǎn)BALF標(biāo)本培養(yǎng)的陽性率高，合格率高BALF的采集不需要患者的配合【1】BALF能避免上呼吸道的定植菌的污染，減少對培養(yǎng)結(jié)果判斷的干擾。941.AmericanThoracicSociety,InfectiousDiseasesSocietyofAmerica.GuidelinesontheManagementofCommunity-AcquiredPneumoniainAdults,2007:44(Suppl2)94肺泡灌洗液標(biāo)本的優(yōu)點(diǎn)BALF標(biāo)本培養(yǎng)的陽性率高，合格率高3肺泡灌洗液標(biāo)本的處理95將所有標(biāo)本裝入50ml離心管內(nèi)漩渦震蕩30-60s每個平板定量涂10μLUsepipette.用吸管吸取0.1ml至1mlTSB（1：10稀釋）生長出>10個菌落培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)：相同形態(tài)菌落數(shù)×103CFU/mL

制作涂片（細(xì)胞離心)血平皿巧克力平皿麥康凱平皿若用接種環(huán)密涂平板，生長的菌落數(shù)量會低于實(shí)際數(shù)量。但用L棒涂布平板計(jì)數(shù)，定量培養(yǎng)結(jié)果更準(zhǔn)確95肺泡灌洗液標(biāo)本的處理39將所有標(biāo)本裝入50ml離心管內(nèi)漩渦震肺泡灌洗液的涂片革蘭染色適量BALF標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞離心，經(jīng)自然干燥、甲醇固定或火焰快速固定3次，革蘭染色標(biāo)本質(zhì)量判斷以扁平鱗狀上皮細(xì)胞占全部細(xì)胞比例<1%為合格標(biāo)本敏感度為104個細(xì)胞/mL，若每個油鏡視野可見1個或多個細(xì)菌，報告革蘭染色形態(tài)及白細(xì)胞結(jié)果，提示此菌與活動性肺炎相關(guān)。96PatrickRM.Manualofclinicalmicrobiology.9thed.US:ASMPress,2007:307-308中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——下呼吸道感染細(xì)菌培養(yǎng)操作規(guī)范[S].96肺泡灌洗液的涂片革蘭染色適量BALF標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞離心，經(jīng)自然肺泡灌洗液定量培養(yǎng)的意義細(xì)菌性感染，濃度閾值104CFU/mL，低于閾值濃度時，定植可能性大;高于閾值時，感染可能性大。真菌性感染，目前沒有BAL的診斷性閾值。絲狀真菌也沒有閾值。但絲狀真菌在呼吸道分泌物中的價值遠(yuǎn)大于酵母菌屬。該類菌在EORTC/MSG指南中有“臨床診斷(probablediagnosis)”價值971.AGuidetoUtilizationoftheMicrobiologyLaboratoryforDiagnosisofInfectiousDiseases:2