總提取及免疫組化

關(guān)于總提取及免疫組化第一頁，共四十九頁，2022年，8月28日一、真核細(xì)胞的總RNA1、mRNA:1-5%

2、tRNA:10-15%3、rRNA:80-85%

大亞基60S:28S=4718nt5S=120nt5.8S=160nt

小亞基40S:18S=1874nt第二頁，共四十九頁，2022年，8月28日二、RNA提取的注意事項(xiàng)

RNA酶：廣泛存在：灰塵、人體唾液、實(shí)驗(yàn)器材表面。生物活性非常穩(wěn)定：耐熱、耐酸、耐堿。

1、盡量避免外源性RNase污染

A.操作環(huán)境空氣潔凈。帶手套、口罩。

B.用新開封的化學(xué)試劑。（試劑應(yīng)該專用）

C.

一次性塑料器材最好是新開封，

(DEPC水處理后）高壓滅菌。

D.玻璃器材、水都應(yīng)該經(jīng)過去RNase處理。對(duì)玻璃器材還應(yīng)該進(jìn)行高溫烘烤。

2、抑制內(nèi)源性RNase活性：RNase抑制劑。

RNA分離的關(guān)鍵因素：避免RNA酶的污染。第三頁，共四十九頁，2022年，8月28日1)樣品處理：

（１）培養(yǎng)細(xì)胞：收獲細(xì)胞1-5×107，移入1.5ml離心管中，加入1mlTrizol，混勻，室溫靜置10min。

（２）組織：取50-100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1mlTrizol充分勻漿，室溫靜置10min。三、RNA提取的實(shí)驗(yàn)操作

第四頁，共四十九頁，2022年，8月28日2)加入200l氯仿，震蕩混勻20-30s，室溫放置5min（此期間液體開始分層，此時(shí)不要輕易攪動(dòng)液體）。3)10000rpm，離心5min。RNA(清澈透明)DNAProtein4)將清澈透明的上層水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中。三、RNA提取的實(shí)驗(yàn)操作

第五頁，共四十九頁，2022年，8月28日5)沉淀RNA：加入0.5ml異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置10min。10000rpm，離心10min。棄上清。6)加1ml

75%乙醇洗滌管壁。(注意貼管壁在沉淀的對(duì)側(cè)緩慢加入，不要攪動(dòng)沉淀)7)7500rpm離心1min，棄上清。再離心幾秒鐘，將管壁液體（用加樣器）完全移凈。用TriZol試劑提取總RNA時(shí)，全程均在室溫進(jìn)行。當(dāng)RNA沉淀用水溶解后，應(yīng)該注意在冰上操作，操作要迅速。第六頁，共四十九頁，2022年，8月28日8)室溫干燥3－5min。（干燥的時(shí)間由RNA沉淀大小決定）（干燥后的沉淀應(yīng)該是無色膠樣透明狀，沉淀要充分干燥但避免過分干燥，此步驟非常關(guān)鍵）注意事項(xiàng)：RNA:避免放在37C孵箱中過度干燥以防無法溶解。

RNA沉淀必須絕對(duì)干燥，微量乙醇?xì)埩?，容易造成RT的失敗，但過分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因。判斷RNA沉淀是否充分干燥但又不是過分干燥是逆轉(zhuǎn)錄成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。RNApellet：透明膠樣干燥后應(yīng)該無色透明第七頁，共四十九頁，2022年，8月28日9）RNA的溶解：用加樣器吸取冰冷DEPC-H2O

20-30l，加到RNA上，反復(fù)吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA應(yīng)置冰上保存。10)吸出2-3

l溶液放到冰上備用(將用于電泳)。11)剩余溶液放到冰上備用（將用于RT－PCR）。注意：

RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加樣器反復(fù)多次吹打方可。但由于溶液體積非常小，要避免出現(xiàn)氣泡影響RNA的溶解。避免氣泡的方法：用加樣器的第一擋每次吹打都不要打出氣體判斷溶解程度：吹打時(shí)液體流動(dòng)不拐彎為止。第八頁，共四十九頁，2022年，8月28日

將

RNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳

9lRNA樣品

2~3l

上樣液輕輕混勻，上樣電泳:120伏，10～20分鐘注意:電泳槽的清潔及新的電泳液！瓊脂糖凝膠要新鮮配制！紫外透射儀觀察電泳結(jié)果第九頁，共四十九頁，2022年，8月28日RNA電泳結(jié)果rRNA可以作為內(nèi)部Marker分子，通過觀察rRNA的兩條帶（28S和18S）的比例，可以判斷所提取mRNA是否存在降解。

RNA電泳并不能判斷mRNA是否提取成功，也不作為鑒定RNA提取質(zhì)量的常規(guī)方法，因?yàn)樵陔娪具^程中RNA可能發(fā)生降解。第十頁，共四十九頁，2022年，8月28日RNA純度的判斷

280、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、鹽濃度和蛋白等有機(jī)物的值

A260/A2801.8—2.0

＜1.8表明有蛋白質(zhì)、苯酚的污染＞2.2表明RNA已經(jīng)水解成單核酸

A260/A230>2.0

＜2.0表明酚鹽離子，硫氰酸鹽或其他有機(jī)化合物污染第十一頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化的原理及流程介紹2015-07-21第十二頁，共四十九頁，2022年，8月28日主要內(nèi)容免疫組化原理及流程介紹一.免疫組化的原理二.免疫組化的基本流程三.免疫組化的結(jié)果分析第十三頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化的原理應(yīng)用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行原位定位、定性及定量檢測(cè)的技術(shù)。免疫組化原理及流程介紹第十四頁，共四十九頁，2022年，8月28日直接法TissueAntigenLabeledAntibody將熒光、酶直接標(biāo)記在一抗上優(yōu)點(diǎn)：簡單方便缺點(diǎn)：靈敏度低每種一抗都需要進(jìn)行標(biāo)記免疫組化原理及流程介紹直接法第十五頁，共四十九頁，2022年，8月28日間接法TissueAntigenPrimaryAntibodySecondaryAntibody將熒光、酶等標(biāo)記在二抗上優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高只需要少數(shù)標(biāo)記的二抗可以和相應(yīng)的一抗反應(yīng)

免疫組化原理及流程介紹間接法第十六頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化—SP法SP法--鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法

（streptavidin-peroxidase）一抗生物素標(biāo)記的二抗Streptavidin-HRP（HRP標(biāo)記的鏈霉親和素）簡化實(shí)驗(yàn)步驟減少非特異性背景免疫組化原理及流程介紹免疫組化—SP法第十七頁，共四十九頁，2022年，8月28日ABC法

(AvidinBiotin-peroxidaseComplex)一抗生物素標(biāo)記的二抗Avidin-Biotin-HRPComplex（親和素-HRP標(biāo)記的生物素）親和素與HRP標(biāo)記的生物素混合，放置30分鐘。一個(gè)親和素分子具有可與生物素結(jié)合的四個(gè)部位。大大增加了結(jié)合到生物素上的過氧化物酶，提高了顯色反應(yīng)的靈敏度。免疫組化—ABC法免疫組化原理及流程介紹免疫組化—ABC法第十八頁，共四十九頁，2022年，8月28日三免疫組化的基本流程免疫組化原理及流程介紹1.脫蠟與水化2.細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶3.抗原修復(fù)、暴露抗原決定簇4.封閉非特異性蛋白5.一抗孵育

6.二抗孵育

7.SP反應(yīng)

8.顯色9.復(fù)染、脫水、透明、封片

2.細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶第十九頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹1.脫蠟與水化脫蠟與水化的目的是確保抗體等其他試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。

第二十頁，共四十九頁，2022年，8月28日

60℃×20min→Xylene：2×10minutes；100%absoluteethanol：2×5minutes；95%ethanol2minutes；80%ethanol2minutes；70%ethanol2minutes；distilledwater:5min；PBS洗3×3min。具體操作第二十一頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹2.細(xì)胞通透與封閉內(nèi)源性過氧化酶目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用TritonX-100、蛋白酶k等通透液。(1)細(xì)胞通透第二十二頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹(2)封閉內(nèi)源性過氧化酶其主要目的是降低內(nèi)源性過氧化物酶的活性。在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易受到內(nèi)源性過氧化物酶的干擾，必須用過氧化氫等進(jìn)行滅活。第二十三頁，共四十九頁，2022年，8月28日1)用封閉通透液浸潤切片30min（RT避光）。其配法是用預(yù)熱40mlPBS加120ulTritonX-100加熱幾分鐘，在臨用前加400ul的30％H2O2。2)PBS溶液洗3次×3min。免疫組化原理及流程介紹具體操作:第二十四頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹3.抗原修復(fù)暴露抗原決定簇

由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。第二十五頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)?？乖迯?fù)的主要方法:酶消化方法一般用于細(xì)胞內(nèi)抗原應(yīng)用高頻電磁波打開蛋白質(zhì)間的交聯(lián)鍵第二十六頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹將切片放入0.01M檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火4min至沸騰后，取出，冷卻至室溫，再加熱，約4次，每次間隔補(bǔ)足液體，防止干片。2)PBS溶液洗3次×3min。具體操作（微波修復(fù)）：1)第二十七頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹4.封閉特異性蛋白組織切片上有些剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性。封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中有一些動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合。

第二十八頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹將切片取出,周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈,在圓圈內(nèi)組織滴入5%羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中,室溫(約30℃)下10～30min。具體操作：大一點(diǎn)第二十九頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹5.一抗孵育一抗:可以特異結(jié)合底物，就是識(shí)別出我們想要檢測(cè)的東西。一抗和底物結(jié)合與否用肉眼是看不出來的。第三十頁，共四十九頁，2022年，8月28日一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，然后4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。免疫組化原理及流程介紹1.防止脫片；2.使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。第三十一頁，共四十九頁，2022年，8月28日甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（1：250、500、1000）后，放入濕盒中室溫1小時(shí)，然后4度過夜，冰箱中取出后需37℃復(fù)溫45min。

免疫組化原理及流程介紹具體做法：第三十二頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹6.二抗孵育二抗:可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測(cè)出的標(biāo)記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），作用是檢測(cè)一抗。第三十三頁，共四十九頁，2022年，8月28日二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。免疫組化原理及流程介紹第三十四頁，共四十九頁，2022年，8月28日1)將一抗倒掉并用PBS洗5min×5次；2)用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入37℃恒溫烤箱中30min。3)用PBS洗5次×5min免疫組化原理及流程介紹具體操作：第三十五頁，共四十九頁，2022年，8月28日7.SP反應(yīng)SP染色法即鏈霉素抗生物素蛋白生物素過氧化酶連接法。該法是ABC法基礎(chǔ)上的進(jìn)一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結(jié)合，而后再結(jié)合PO基。第三十六頁，共四十九頁，2022年，8月28日

免疫組化原理及流程介紹1）加入SP復(fù)合液后放入37度烤箱中30min。2）用PBS洗5次×5min。具體操作：SP染色法的特點(diǎn):靈敏特異性低，成本低。第三十七頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹8.顯色

在免疫組化中，由于抗原抗體所形成的復(fù)合物本身沒有顏色，不能直接觀察，只能借助于其他某些化學(xué)基團(tuán)的顯色作用，是復(fù)合物顯色，有利于顯微鏡下觀察。第三十八頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹通常在過氧化物酶（HRP）法中，顯色劑為DAB。DAB(3,3-二氨基聯(lián)苯胺顯色液)配法:DAB50mg0.05MTB100ml30%H2O230-40ulABC法SP法PAP法第三十九頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹9、復(fù)染、脫水、透明、封片復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用的試劑為蘇木素。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動(dòng)作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返藍(lán)即可。第四十頁，共四十九頁，2022年，8月28日1)用PBS3次×3min后，用雙蒸水洗5min；加一大滴蘇木素染液，（胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染20s），自來水沖洗，雙蒸水洗5min，再用PBS返藍(lán)5min。2)脫水：50%ethanol(1-2)min;70%ethanol(1-2)min;95%ethanol（1-2）min；95%ethanol（1-2）min；100%absoluteethanol:(1-2)min；100%absoluteethanol:(1-2)min。3)透明：Xylene1×(1-2)min→Xylene2×(1-2)min4)封片：中性樹膠。免疫組化原理及流程介紹第四十一頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹四免疫組化結(jié)果分析免疫組化結(jié)果的判斷原則：1.必須設(shè)對(duì)照。2.抗原表達(dá)必須在特定部位。3.陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。第四十二頁，共四十九頁，2022年，8月28日免疫組化原理及流程介紹1．陽性染色特點(diǎn)①Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。（非特異性染色細(xì)胞與組織無區(qū)別）②染色強(qiáng)度不同：顏色深淺不一（非特異性