光譜分析技術(shù)課件

光譜分析技術(shù)1.光譜分析技術(shù)1.光學(xué)導(dǎo)論光譜：復(fù)色光經(jīng)色散系統(tǒng)分光后，按波長(zhǎng)（或頻率）的大小依次排列的圖像2.光學(xué)導(dǎo)論光譜：復(fù)色光經(jīng)色散系統(tǒng)分光后，按波長(zhǎng)2.光學(xué)導(dǎo)論基于測(cè)量物質(zhì)的光譜而建立起來的分析方法稱為光譜分析法吸收光譜發(fā)射光譜分子光譜原子光譜3.光學(xué)導(dǎo)論基于測(cè)量物質(zhì)的光譜而建立起來吸收光譜發(fā)射光譜分子光譜光學(xué)導(dǎo)論吸收光譜

顏色的差異——定性顏色的深淺——定量4.光學(xué)導(dǎo)論吸收光譜顏色的差異——定性4.光學(xué)導(dǎo)論發(fā)射光譜化學(xué)發(fā)光熱/電激發(fā)發(fā)光光致發(fā)光5.光學(xué)導(dǎo)論發(fā)射光譜化學(xué)發(fā)光熱/電激發(fā)發(fā)光光致發(fā)光5.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析法的準(zhǔn)確分類分子光譜

吸收（根據(jù)吸收波段不同細(xì)分）

紫外-可見

紅外

發(fā)射（根據(jù)發(fā)射原理不同細(xì)分）光致發(fā)光：熒光、磷光

化學(xué)發(fā)光6.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析法的準(zhǔn)確分類分子光譜6.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析法的準(zhǔn)確分類原子光譜

吸收

發(fā)射（根據(jù)發(fā)射原理不同細(xì)分）熱/電激發(fā)發(fā)光：發(fā)射光致發(fā)光：熒光7.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析法的準(zhǔn)確分類原子光譜7.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析≠光學(xué)分析！光學(xué)分析=光譜分析+非光譜分析

非光譜分析：基于物質(zhì)與輻射的相互作用，測(cè)量輻射的某些性質(zhì)，如折射、散射、干涉、衍射和偏振等變化的分析方法8.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析≠光學(xué)分析！光學(xué)分析=光譜分析+非光學(xué)導(dǎo)論光譜分析與非光譜分析的區(qū)別光譜分析涉及“顏色”“譜”“能量”的變化非光譜分析涉及光的傳播方向等物理性質(zhì)的變化，不涉及“譜”9.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析與非光譜分析的區(qū)別光譜分析涉及“顏色”“譜”光學(xué)導(dǎo)論光的本質(zhì)：電磁輻射、波粒二象性波波長(zhǎng)λ、頻率γ、速度υυ=γλc

(真空中的υ)=3×108m·s-1波長(zhǎng)λ：相鄰兩個(gè)波峰或波谷間的直線距離單位可以是nm、μm、cm、m頻率γ：在1秒時(shí)間內(nèi)經(jīng)過某點(diǎn)的波數(shù)（即每秒內(nèi)振動(dòng)的次數(shù)）單位Hz(s-1)周期T：頻率的倒數(shù)；波數(shù)σ：波長(zhǎng)的倒數(shù)10.光學(xué)導(dǎo)論光的本質(zhì)：電磁輻射、波粒二象性波波長(zhǎng)λ、頻率γ、速度光學(xué)導(dǎo)論射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光電磁波譜：將電磁輻射按照波長(zhǎng)或頻率的大小順序排列起來即稱為電磁波譜11.光學(xué)導(dǎo)論射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm光學(xué)導(dǎo)論波長(zhǎng)λ5×10-3～0.10.1～1010～200200～400名稱γ射線x射線遠(yuǎn)紫外光近紫外光波長(zhǎng)λ400～750750～1.0×1061.0×106～1.0×1091.0×109～1.0×1012名稱可見光紅外光微波無線電波12.光學(xué)導(dǎo)論波長(zhǎng)λ5×10-30.1～1010～200200～4光學(xué)導(dǎo)論粒光子：能量E、普朗克常數(shù)h、電子伏特eVh=6.626×10-34J·s1J=6.241×1018eVＥ=hγ=hc/λ當(dāng)物質(zhì)所吸收的電磁輻射能量能夠滿足該物質(zhì)由低能態(tài)(基態(tài))躍遷至高能態(tài)(激發(fā)態(tài))，將產(chǎn)生吸收光譜當(dāng)物質(zhì)通過電、熱或光等激發(fā)至激發(fā)態(tài)，再?gòu)募ぐl(fā)態(tài)過渡到低能態(tài)或基態(tài)時(shí)，將產(chǎn)生發(fā)射光譜13.光學(xué)導(dǎo)論粒光子：能量E、普朗克常數(shù)h、電子伏特eV當(dāng)物質(zhì)所吸吸收光譜發(fā)射光譜14.吸收光譜發(fā)射光譜14.光學(xué)導(dǎo)論某分子的外層價(jià)電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)需要20eV，請(qǐng)問該分子吸收光的波長(zhǎng)？解：1eV=1.602×10-19J根據(jù)公式Ｅ=hc/λ則λ=hc/Ｅ=（6.626×10-34×3×108）/（20×1.602×10-19）=0.62×10-7m=62nm15.光學(xué)導(dǎo)論某分子的外層價(jià)電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)解：1eV=紫外-可見分光光度法16.紫外-可見分光光度法16.什么是紫外-可見光譜遠(yuǎn)紫外光區(qū)：10~200nm近紫外光區(qū)：200~400nm

UVC：200~280nmUVB：280~320nmUVA：320~400nm可見光區(qū)：400~780nm紅外光區(qū)：780nm~1mm17.什么是紫外-可見光譜遠(yuǎn)紫外光區(qū)：10~200nm17.什么是紫外-可見分光光度法基于分子外層價(jià)電子躍遷產(chǎn)生的在紫外-可見光譜區(qū)的吸收光譜進(jìn)行分析的一種常用的光譜分析方法。ultravioletandvisible(UV-vis)spectrophotometry18.什么是紫外-可見分光光度法基于分子外層價(jià)電子躍遷產(chǎn)生的在紫外基本原理分子的三種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)對(duì)應(yīng)有一定的能級(jí)。即在分子中存在著：

電子能級(jí)振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)這三種能級(jí)都是量子化的19.基本原理分子的三種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)對(duì)應(yīng)有一定的能級(jí)。即在分子中存在著分子能量的變化：

E=Ee+Ev+ErEe>Ev>Er基本原理20.分子能量的變化：基本原理20.基本原理分子吸收光（電磁波）后產(chǎn)生的能量的變化：遠(yuǎn)紅外光譜（轉(zhuǎn)動(dòng)光譜）中紅外光譜（振動(dòng)光譜）紫外-可見光譜（電子光譜）21.基本原理分子吸收光（電磁波）后產(chǎn)生的能量的變化：遠(yuǎn)紅外光譜中基本原理帶狀光譜發(fā)生電子躍遷時(shí)必然要發(fā)生振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷，這使得紫外-可見吸收光譜呈現(xiàn)帶狀典型的紫外-可見吸收光譜圖吸收峰最大吸收波長(zhǎng)(λmax)22.基本原理帶狀光譜典型的紫外-可見吸收光譜圖吸收峰最大吸收波長(zhǎng)基本原理價(jià)電子σ電子→飽和的單鍵

π電子→不飽和的雙鍵、三鍵n電子→孤對(duì)電子分子中分子軌道有成鍵軌道與反鍵軌道：它們的能級(jí)高低為：σ<π<n<π*<σ***n非鍵軌道反鍵軌道反鍵軌道成鍵軌道成鍵軌道→*n→*→*n→*>>>COHnpsH23.基本原理價(jià)電子**n非鍵軌道反鍵軌道反鍵軌道成鍵軌道

1.σ→σ*躍遷：飽和烴（C-C，C-H）能量很高，λ<150nm2.n→σ*躍遷：含雜原子飽和基團(tuán)（-OH，-NH2）能量較大，λ150~250nm3.π→π*躍遷：不飽和基團(tuán)（C=C，C≡C）能量較小，λ~200nm共軛體系，E更小，λ>200nm4.n→π*躍遷：含雜原子不飽和基團(tuán)（C≡N，C=O）能量最小，λ200~400nm基本原理24. 1.σ→σ*躍遷：基本原理24.

影響紫外-可見吸收光譜的因素1共軛效應(yīng)共軛體系越長(zhǎng)，π與π*的能量差越小，紅移效應(yīng)和增色效應(yīng)越明顯。

2立體化學(xué)效應(yīng)空間位阻、跨環(huán)效應(yīng)3溶劑的影響溶劑效應(yīng)4體系pH的影響Tips：由于溶劑對(duì)電子光譜圖影響很大，因此，在吸收光譜圖上或數(shù)據(jù)表中必須注明所用的溶劑。與已知化合物紫外光譜作對(duì)照時(shí)也應(yīng)注明所用的溶劑是否相同。在進(jìn)行紫外光譜法分析時(shí)，必須正確選擇溶劑。25. 影響紫外-可見吸收光譜的因素1共軛效應(yīng)Tips：25.朗伯-比爾定律——定量分析的基礎(chǔ)當(dāng)強(qiáng)度為I0的一定波長(zhǎng)的單色入射光束通過裝有均勻待測(cè)物的溶液介質(zhì)時(shí)，該光束將被部分吸收Ia，部分反射Ir，余下的則通過待測(cè)物的溶液It，即有：I0=Ia+It+Ir26.朗伯-比爾定律——定量分析的基礎(chǔ)當(dāng)強(qiáng)度為I0的一定波長(zhǎng)的單色朗伯-比爾定律如果吸收介質(zhì)是溶液（測(cè)定中一般是溶液），式中反射光強(qiáng)度主要與器皿的性質(zhì)及溶液的性質(zhì)有關(guān)，在相同的測(cè)定條件下，這些因素是固定不變的，并且反射光強(qiáng)度一般很小。所以可忽略不記，這樣：I0=Ia+It27.朗伯-比爾定律如果吸收介質(zhì)是溶液（測(cè)定中一般是溶液），式中反朗伯-比爾定律透光率——透光率表示透過光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值，用T來表示，計(jì)算式為：T=It/I0T常用百分比（%）表示。吸光度——透光率的倒數(shù)的對(duì)數(shù)叫吸光度。用A表示：A=-lgT=lg(I0/It)28.朗伯-比爾定律透光率——透光率表示透過光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比朗伯-比爾定律29.朗伯-比爾定律29.當(dāng)用一束強(qiáng)度為I0的單色光垂直通過厚度為b、吸光物質(zhì)濃度為c的溶液時(shí)，溶液的吸光度正比于溶液的厚度b和溶液中吸光物質(zhì)的濃度c的乘積。朗伯-比爾定律IoItbaA=lg(I0/It)

=Kbc30.當(dāng)用一束強(qiáng)度為I0的單色光垂直通過厚度為b、吸光物質(zhì)濃度為c朗伯-比爾定律吸光系數(shù)：當(dāng)溶液濃度c的單位為g/L,溶液液層厚度b的單位為cm時(shí)，K叫“吸光系數(shù)”，用a表示，其單位為L(zhǎng)·g-1·cm-1摩爾吸光系數(shù)：當(dāng)溶液濃度c的單位為mol/L，液層厚度b的單位為cm時(shí)，K叫“摩爾吸光系數(shù)”，用ε表示，其單位為L(zhǎng)·mol-1·cm-1

ε=aM

(M為吸光物質(zhì)的分子量)31.朗伯-比爾定律吸光系數(shù)：31.紫外-可見分光光度計(jì)島津UV-245032.紫外-可見分光光度計(jì)島津UV-245032.工作原理基儀器結(jié)構(gòu)框圖光源碘鎢燈氘燈單色器測(cè)量池參比池樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理和儀器控制光源樣品池單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制紫外-可見分光光度計(jì)33.工作原理基儀器結(jié)構(gòu)框圖光源碘鎢燈氘燈單色器測(cè)量池參比池樣品池紫外-可見分光光度計(jì)單光束分光光度計(jì)34.紫外-可見分光光度計(jì)單光束分光光度計(jì)34.雙光束分光光度計(jì)紫外-可見分光光度計(jì)35.雙光束分光光度計(jì)紫外-可見分光光度計(jì)35.吸收池的材料玻璃360nm2.25mm紫外-可見分光光度計(jì)36.吸收池的材料玻璃360nm2.25mm紫外-可見分光光度石英200nm2.5mm紫外-可見分光光度計(jì)37.石英200nm2.5mm紫外-可見分光光度計(jì)37.吸收池的形狀可拆卸圓形測(cè)量池兩面透光圓形測(cè)量池兩面透光1cm長(zhǎng)方形測(cè)量池兩面透光氣體測(cè)量池兩面透光微量測(cè)量池兩面透光流動(dòng)測(cè)量池兩面透光紫外-可見分光光度計(jì)38.吸收池的形狀可拆卸圓形測(cè)量池圓形測(cè)量池1cm長(zhǎng)方形測(cè)量池氣思考題為什么紫外可見分光光度計(jì)的最大吸收值只能到3或者5，超過該值便會(huì)造成數(shù)據(jù)溢出？39.思考題為什么紫外可見分光光度計(jì)的最大吸收值只能到3或者5，超

生物分子的紫外-可見吸收光譜糖紫外可見光譜在糖的分析中,主要作定量檢測(cè)。最大吸收波長(zhǎng)為218nm,多糖最大吸收波長(zhǎng)為206nm?！?0. 生物分子的紫外-可見吸收光譜糖紫外可見光譜在糖的分析中,

生物分子的紫外-可見吸收光譜脂脂肪○○230~240nm,于有機(jī)溶劑中（如乙醇、正己烷等）41. 生物分子的紫外-可見吸收光譜脂脂○○230~240nm,類脂維生素A326nm于乙醇番茄紅素番茄紅素在溶劑正己烷中的譜圖番茄紅素在溶劑石油醚中的譜圖生物分子的紫外-可見吸收光譜42.類維生素A326nm于乙醇番茄紅素番茄紅素在溶劑正己烷中的

生物分子的紫外-可見吸收光譜蛋白質(zhì)Proteinsinsolutionabsorbultravioletlightwithabsorbancemaximaat280and200nm.Aminoacidswitharomaticringsaretheprimaryreasonfortheabsorbancepeakat280nm.Peptidebondsareprimarilyresponsibleforthepeakat200nm.酪氨酸

色氨酸

苯丙氨酸43.生物分子的紫外-可見吸收光譜蛋白質(zhì)Prot生物分子的紫外-可見吸收光譜核酸嘌呤和嘧啶在250～280nm有強(qiáng)的吸收作用，綜合起來在260nm吸收值最大。Tips：1.吸收強(qiáng)度：?jiǎn)魏塑账?gt;單鏈DNA>雙鏈DNA（增色效應(yīng)、減色效應(yīng)）2.A260/A280＝1.8～2.0，DNA較純A260/A280

<1.8，DNA樣品中含有蛋白質(zhì)A260/A280>2.0，DNA樣品中含有RNA44.生物分子的紫外-可見吸收光譜核酸嘌呤和嘧啶在250～280微生物的紫外-可見吸收光譜600nm測(cè)細(xì)菌等微生物的濁度，用于估計(jì)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。比如，得到的OD600的數(shù)值如果在0.6-0.8之間，表明細(xì)菌處于旺盛生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600>3表明細(xì)菌已經(jīng)飽和等。45.微生物的紫外-可見吸收光譜600nm測(cè)細(xì)菌等微生物的濁度，核酸蛋白測(cè)定儀EppendorfBioPhotometerplus

46.核酸蛋白測(cè)定儀EppendorfBioPhotometerELISA原理圖YY

①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）

②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）酶標(biāo)儀47.ELISA原理圖YY②酶標(biāo)記的抗原或抗酶標(biāo)儀TecanInfinite?200Pro多功能酶標(biāo)儀ELISA酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色360,450

42048.酶標(biāo)儀TecanInfinite?200Pro多功能酶分子熒光光譜49.分子熒光光譜49.什么是熒光光譜某些物質(zhì)經(jīng)紫外-可見光照射后，能立即放出能量較低（亦即波長(zhǎng)較長(zhǎng)）的光——光致發(fā)光。當(dāng)照射停止后，如化合物的發(fā)射在10-9秒鐘內(nèi)停止，則稱熒光(fluorescence);超過此限度即稱為磷光(phosphorescence)。50.什么是熒光光譜某些物質(zhì)經(jīng)紫外-可見光照射后，能立即放出能量較什么是熒光光譜51.什么是熒光光譜51.基本原理Ee0Ev0Ev1Ev2Ev3Ev4Ee1Ee2熒光發(fā)射：當(dāng)分子處于單重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層時(shí)，去活化的一種形式是以10-9~10-7s左右的短時(shí)間內(nèi)發(fā)射光子返回基態(tài)，這一過程稱為熒光發(fā)射。52.基本原理Ee0Ev0Ev1Ev2Ev3Ev4Ee1Ee2熒光激發(fā)光譜激發(fā)光譜固定熒光發(fā)射波長(zhǎng)，掃描激發(fā)波長(zhǎng)熒光激發(fā)光譜與紫外-可見吸收光譜類似，Why？橫坐標(biāo)是入射光（激發(fā)光）的波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)是發(fā)射光（熒光）的強(qiáng)度53.激發(fā)光譜激發(fā)光譜固定熒光發(fā)射波長(zhǎng)，掃描激發(fā)波長(zhǎng)熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng)，掃描發(fā)射波長(zhǎng)橫坐標(biāo)是發(fā)射光（熒光）的波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)是發(fā)射光（熒光）的強(qiáng)度發(fā)射光譜(熒光光譜)54.發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng)，掃描發(fā)射波長(zhǎng)橫坐標(biāo)是發(fā)射光（熒光）的55.55.2.三維熒光光譜IF

∝f(λex、λem)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長(zhǎng)、掃描激發(fā)波長(zhǎng)56.2.三維熒光光譜IF∝f(λex、λem)蒽的激發(fā)IF

∝f(λex、λem)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長(zhǎng)、掃描發(fā)射波長(zhǎng)57.IF∝f(λex、λem)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長(zhǎng)、蒽的三維等高線光譜圖58.蒽的三維等高線光譜圖58.蒽的三維等熒光強(qiáng)度光譜59.蒽的三維等熒光強(qiáng)度光譜59.熒光量子產(chǎn)率（熒光效率）化合物F0.10.290.460.600.52kF為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，取決于熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)；Ki為其他過程（如振動(dòng)弛豫等）的速率常數(shù)總和，主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。60.熒光量子產(chǎn)率（熒光效率）化合物F0.10.290.460.熒光與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)1.π*→π是有機(jī)化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。2.產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，熒光越容易產(chǎn)生。產(chǎn)生熒光的條件61.熒光與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)1.π*→π是有機(jī)化合物產(chǎn)生熒熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加，有利于熒光發(fā)射。3.剛性平面結(jié)構(gòu)熒光與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)62.熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加，3.剛性平面結(jié)構(gòu)熒光與有機(jī)化合熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系63.熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系63.熒光的淬滅熒光淬滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象。熒光淬滅劑：這些溶劑分子或其它溶質(zhì)分子稱為熒光淬滅劑（如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基/羰基/羧基化合物等）。64.熒光的淬滅熒光淬滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）FluorescenceResonanceEnergyTransfer相互作用的研究65.熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）相互作用熒光分光光度計(jì)光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器問題：熒光分光光度計(jì)與紫外-可見分光光度計(jì)有何異同點(diǎn)？66.熒光分光光度計(jì)光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理光源紫外-可見分光光度計(jì):光源樣品池單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制熒光(磷光)分光光度計(jì):光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器熒光分光光度計(jì)67.紫外-可見分光光度計(jì):光源樣品池單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理熒光(磷熒光分光光度計(jì)HitachiF-700068.熒光分光光度計(jì)HitachiF-700068.樣品池1.樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池一樣2.吸收池的形狀：紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池兩面透光熒光分光光度計(jì)的樣品池四面透光問題：紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池與熒光分光光度計(jì)的樣品池有什么區(qū)別？熒光分光光度計(jì)69.樣品池1.樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池一樣2紫外-可見分光光度計(jì)

測(cè)量池(吸收池)熒光分光光度計(jì)樣品池I0ItI0ItIF,p熒光分光光度計(jì)70.紫外-可見分光光度計(jì)

測(cè)量池(吸收池)熒光分光光度計(jì)I0It熒光光譜的應(yīng)用芳香族化合物存在共軛的不飽和體系，是有機(jī)化合物熒光測(cè)定的主要類型。1.有機(jī)化合物的鑒定待測(cè)物試劑λexmaxλemmax測(cè)定范圍ppm丙三醇苯胺紫外藍(lán)色0.1~2糠醛蒽酮4655051.5~15氨基酸氧化酶3154250.01~50維生素A無水乙醇3454900~20蛋白質(zhì)曙紅丫紫外5400.06~6腎上腺素乙二胺4205250.001~0.02青霉素α-甲氧基-６-氯-９-(β-氨乙基)-氨基氮雜蒽4205000.0625~0.625玻璃酸梅3-乙酰氧基吲哚3954700.001~0.033胍基丁胺鄰苯二醛3654700.05~5四氧嘧啶苯二胺36548510-471.熒光光譜的應(yīng)用芳香族化合物存在共軛的不飽和體系，是有機(jī)化合物熒光光譜的應(yīng)用2.分子標(biāo)記與追蹤在生物學(xué)研究中，科學(xué)家們利用能發(fā)光的熒光分子對(duì)生物體進(jìn)行標(biāo)記。將熒光分子通過化學(xué)方法“掛在”其他“不可見”的分子上，原來不可見的部分就變得可見了。生物學(xué)家利用這種標(biāo)記方法，把原本透明的細(xì)胞、細(xì)胞器或生物分子從黑暗的顯微鏡視場(chǎng)中“揪出來”。

量子點(diǎn)（無機(jī)納米粒子）熒光染料（有機(jī)小分子）熒光蛋白（蛋白質(zhì)）72.熒光光譜的應(yīng)用2.分子標(biāo)記與追蹤在生物學(xué)研究中，科學(xué)家們熒光光譜的應(yīng)用2.1熒光在核酸研究中的應(yīng)用——電泳MidoriGreenEthidiumbromide73.熒光光譜的應(yīng)用2.1熒光在核酸研究中的應(yīng)用——電泳Midor熒光光譜的應(yīng)用SYBRGreenI2.2熒光在核酸研究中的應(yīng)用實(shí)時(shí)定量熒光PCR（RT-qPCR）74.熒光光譜的應(yīng)用SYBRGreenI2.2熒光在核酸研究中2.3熒光在核酸研究中的應(yīng)用—分子信標(biāo)熒光光譜的應(yīng)用Taq-Man75.2.3熒光在核酸研究中的應(yīng)用—分子信標(biāo)熒光光譜的應(yīng)用Taq-熒光光譜的應(yīng)用2.4熒光在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用幾種含苯基側(cè)鏈的氨基酸可以發(fā)出熒光，且受微環(huán)境變化的影響，因此可用于作為內(nèi)源熒光探針來研究蛋白質(zhì)構(gòu)象。76.熒光光譜的應(yīng)用2.4熒光在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用幾種含苯基側(cè)鏈的熒光光譜的應(yīng)用2.5ELISA中的“熒光”77.熒光光譜的應(yīng)用2.5ELISA中的“熒光”77.熒光光譜的應(yīng)用下村修等人于1962年在一種學(xué)名為Aequoreavictoria的水母中發(fā)現(xiàn)能發(fā)光的蛋白——綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）。分子質(zhì)量為26kDa，由238個(gè)氨基酸構(gòu)成。2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了下村修以及另外兩位科學(xué)家（美國(guó)科學(xué)家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學(xué)家錢永?。员碚盟麄儼l(fā)現(xiàn)和發(fā)展了綠色熒光蛋白質(zhì)技術(shù)。78.熒光光譜的應(yīng)用下村修等人于1962年在一種學(xué)名為Aequor細(xì)胞標(biāo)記熒光光譜的應(yīng)用79.細(xì)熒光光譜的應(yīng)用79.活體標(biāo)記熒光光譜的應(yīng)用80.活熒光光譜的應(yīng)用80.1.傳統(tǒng)的熒光分子在發(fā)光的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生具有毒性的氧自由基，導(dǎo)致被觀察的細(xì)胞死亡，這叫做“光毒性”，因此，在綠色熒光蛋白發(fā)現(xiàn)以前，科學(xué)家們只能通過熒光標(biāo)記來研究死亡細(xì)胞靜態(tài)結(jié)構(gòu)，而綠色熒光蛋白的光毒性非常弱，非常適合用于標(biāo)記活細(xì)胞，在GFP出現(xiàn)之前這完全不可想象。2.熒光蛋白與靶蛋白的連接可直接通過二者表達(dá)基因的融合，轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中翻譯表達(dá)出靶蛋白與熒光蛋白的復(fù)合體。綠色熒光蛋白熒光光譜的應(yīng)用81.1.傳統(tǒng)的熒光分子在發(fā)光的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生具有毒性的氧自由基，導(dǎo)可以發(fā)出各種顏色熒光的熒光蛋白熒光光譜的應(yīng)用82.可以發(fā)出各種顏色熒光的熒光蛋白熒光光譜的應(yīng)用82.熒光光譜的應(yīng)用量子點(diǎn)(quatumdots)Cd/Pb/Zn---S/Se/Te83.熒光光譜的應(yīng)用量子點(diǎn)(quatumdots)83.1.量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度比常用的有機(jī)熒光材料高幾十倍。2.高穩(wěn)定性，有機(jī)熒光材料會(huì)遭遇光漂白，長(zhǎng)時(shí)間激發(fā)后造成熒光效率的不斷降低；量子點(diǎn)則可承受長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度的激發(fā)。3.量子點(diǎn)的激發(fā)光范圍廣，而發(fā)射光范圍窄。

（這意味著什么？）量子點(diǎn)熒光光譜的應(yīng)用當(dāng)需要同時(shí)熒光標(biāo)記幾個(gè)不同靶標(biāo)時(shí)，量子點(diǎn)較廣的激發(fā)范圍意味著可以在同一激發(fā)光波長(zhǎng)下同時(shí)激發(fā)不同的量子點(diǎn)。而窄范圍的發(fā)射光范圍則使得不同量子點(diǎn)發(fā)出的不同顏色的熒光更易鑒別和測(cè)量，減少了干擾。84.1.量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度比常用的有機(jī)熒光材料高幾十倍。量子點(diǎn)熒光個(gè)人觀點(diǎn)供參考，歡迎討論！個(gè)人觀點(diǎn)供參考，歡迎討論！光譜分析技術(shù)86.光譜分析技術(shù)1.光學(xué)導(dǎo)論光譜：復(fù)色光經(jīng)色散系統(tǒng)分光后，按波長(zhǎng)（或頻率）的大小依次排列的圖像87.光學(xué)導(dǎo)論光譜：復(fù)色光經(jīng)色散系統(tǒng)分光后，按波長(zhǎng)2.光學(xué)導(dǎo)論基于測(cè)量物質(zhì)的光譜而建立起來的分析方法稱為光譜分析法吸收光譜發(fā)射光譜分子光譜原子光譜88.光學(xué)導(dǎo)論基于測(cè)量物質(zhì)的光譜而建立起來吸收光譜發(fā)射光譜分子光譜光學(xué)導(dǎo)論吸收光譜

顏色的差異——定性顏色的深淺——定量89.光學(xué)導(dǎo)論吸收光譜顏色的差異——定性4.光學(xué)導(dǎo)論發(fā)射光譜化學(xué)發(fā)光熱/電激發(fā)發(fā)光光致發(fā)光90.光學(xué)導(dǎo)論發(fā)射光譜化學(xué)發(fā)光熱/電激發(fā)發(fā)光光致發(fā)光5.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析法的準(zhǔn)確分類分子光譜

吸收（根據(jù)吸收波段不同細(xì)分）

紫外-可見

紅外

發(fā)射（根據(jù)發(fā)射原理不同細(xì)分）光致發(fā)光：熒光、磷光

化學(xué)發(fā)光91.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析法的準(zhǔn)確分類分子光譜6.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析法的準(zhǔn)確分類原子光譜

吸收

發(fā)射（根據(jù)發(fā)射原理不同細(xì)分）熱/電激發(fā)發(fā)光：發(fā)射光致發(fā)光：熒光92.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析法的準(zhǔn)確分類原子光譜7.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析≠光學(xué)分析！光學(xué)分析=光譜分析+非光譜分析

非光譜分析：基于物質(zhì)與輻射的相互作用，測(cè)量輻射的某些性質(zhì)，如折射、散射、干涉、衍射和偏振等變化的分析方法93.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析≠光學(xué)分析！光學(xué)分析=光譜分析+非光學(xué)導(dǎo)論光譜分析與非光譜分析的區(qū)別光譜分析涉及“顏色”“譜”“能量”的變化非光譜分析涉及光的傳播方向等物理性質(zhì)的變化，不涉及“譜”94.光學(xué)導(dǎo)論光譜分析與非光譜分析的區(qū)別光譜分析涉及“顏色”“譜”光學(xué)導(dǎo)論光的本質(zhì)：電磁輻射、波粒二象性波波長(zhǎng)λ、頻率γ、速度υυ=γλc

(真空中的υ)=3×108m·s-1波長(zhǎng)λ：相鄰兩個(gè)波峰或波谷間的直線距離單位可以是nm、μm、cm、m頻率γ：在1秒時(shí)間內(nèi)經(jīng)過某點(diǎn)的波數(shù)（即每秒內(nèi)振動(dòng)的次數(shù)）單位Hz(s-1)周期T：頻率的倒數(shù)；波數(shù)σ：波長(zhǎng)的倒數(shù)95.光學(xué)導(dǎo)論光的本質(zhì)：電磁輻射、波粒二象性波波長(zhǎng)λ、頻率γ、速度光學(xué)導(dǎo)論射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光電磁波譜：將電磁輻射按照波長(zhǎng)或頻率的大小順序排列起來即稱為電磁波譜96.光學(xué)導(dǎo)論射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm光學(xué)導(dǎo)論波長(zhǎng)λ5×10-3～0.10.1～1010～200200～400名稱γ射線x射線遠(yuǎn)紫外光近紫外光波長(zhǎng)λ400～750750～1.0×1061.0×106～1.0×1091.0×109～1.0×1012名稱可見光紅外光微波無線電波97.光學(xué)導(dǎo)論波長(zhǎng)λ5×10-30.1～1010～200200～4光學(xué)導(dǎo)論粒光子：能量E、普朗克常數(shù)h、電子伏特eVh=6.626×10-34J·s1J=6.241×1018eVＥ=hγ=hc/λ當(dāng)物質(zhì)所吸收的電磁輻射能量能夠滿足該物質(zhì)由低能態(tài)(基態(tài))躍遷至高能態(tài)(激發(fā)態(tài))，將產(chǎn)生吸收光譜當(dāng)物質(zhì)通過電、熱或光等激發(fā)至激發(fā)態(tài)，再?gòu)募ぐl(fā)態(tài)過渡到低能態(tài)或基態(tài)時(shí)，將產(chǎn)生發(fā)射光譜98.光學(xué)導(dǎo)論粒光子：能量E、普朗克常數(shù)h、電子伏特eV當(dāng)物質(zhì)所吸吸收光譜發(fā)射光譜99.吸收光譜發(fā)射光譜14.光學(xué)導(dǎo)論某分子的外層價(jià)電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)需要20eV，請(qǐng)問該分子吸收光的波長(zhǎng)？解：1eV=1.602×10-19J根據(jù)公式Ｅ=hc/λ則λ=hc/Ｅ=（6.626×10-34×3×108）/（20×1.602×10-19）=0.62×10-7m=62nm100.光學(xué)導(dǎo)論某分子的外層價(jià)電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)解：1eV=紫外-可見分光光度法101.紫外-可見分光光度法16.什么是紫外-可見光譜遠(yuǎn)紫外光區(qū)：10~200nm近紫外光區(qū)：200~400nm

UVC：200~280nmUVB：280~320nmUVA：320~400nm可見光區(qū)：400~780nm紅外光區(qū)：780nm~1mm102.什么是紫外-可見光譜遠(yuǎn)紫外光區(qū)：10~200nm17.什么是紫外-可見分光光度法基于分子外層價(jià)電子躍遷產(chǎn)生的在紫外-可見光譜區(qū)的吸收光譜進(jìn)行分析的一種常用的光譜分析方法。ultravioletandvisible(UV-vis)spectrophotometry103.什么是紫外-可見分光光度法基于分子外層價(jià)電子躍遷產(chǎn)生的在紫外基本原理分子的三種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)對(duì)應(yīng)有一定的能級(jí)。即在分子中存在著：

電子能級(jí)振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)這三種能級(jí)都是量子化的104.基本原理分子的三種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)對(duì)應(yīng)有一定的能級(jí)。即在分子中存在著分子能量的變化：

E=Ee+Ev+ErEe>Ev>Er基本原理105.分子能量的變化：基本原理20.基本原理分子吸收光（電磁波）后產(chǎn)生的能量的變化：遠(yuǎn)紅外光譜（轉(zhuǎn)動(dòng)光譜）中紅外光譜（振動(dòng)光譜）紫外-可見光譜（電子光譜）106.基本原理分子吸收光（電磁波）后產(chǎn)生的能量的變化：遠(yuǎn)紅外光譜中基本原理帶狀光譜發(fā)生電子躍遷時(shí)必然要發(fā)生振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷，這使得紫外-可見吸收光譜呈現(xiàn)帶狀典型的紫外-可見吸收光譜圖吸收峰最大吸收波長(zhǎng)(λmax)107.基本原理帶狀光譜典型的紫外-可見吸收光譜圖吸收峰最大吸收波長(zhǎng)基本原理價(jià)電子σ電子→飽和的單鍵

π電子→不飽和的雙鍵、三鍵n電子→孤對(duì)電子分子中分子軌道有成鍵軌道與反鍵軌道：它們的能級(jí)高低為：σ<π<n<π*<σ***n非鍵軌道反鍵軌道反鍵軌道成鍵軌道成鍵軌道→*n→*→*n→*>>>COHnpsH108.基本原理價(jià)電子**n非鍵軌道反鍵軌道反鍵軌道成鍵軌道

1.σ→σ*躍遷：飽和烴（C-C，C-H）能量很高，λ<150nm2.n→σ*躍遷：含雜原子飽和基團(tuán)（-OH，-NH2）能量較大，λ150~250nm3.π→π*躍遷：不飽和基團(tuán)（C=C，C≡C）能量較小，λ~200nm共軛體系，E更小，λ>200nm4.n→π*躍遷：含雜原子不飽和基團(tuán)（C≡N，C=O）能量最小，λ200~400nm基本原理109. 1.σ→σ*躍遷：基本原理24.

影響紫外-可見吸收光譜的因素1共軛效應(yīng)共軛體系越長(zhǎng)，π與π*的能量差越小，紅移效應(yīng)和增色效應(yīng)越明顯。

2立體化學(xué)效應(yīng)空間位阻、跨環(huán)效應(yīng)3溶劑的影響溶劑效應(yīng)4體系pH的影響Tips：由于溶劑對(duì)電子光譜圖影響很大，因此，在吸收光譜圖上或數(shù)據(jù)表中必須注明所用的溶劑。與已知化合物紫外光譜作對(duì)照時(shí)也應(yīng)注明所用的溶劑是否相同。在進(jìn)行紫外光譜法分析時(shí)，必須正確選擇溶劑。110. 影響紫外-可見吸收光譜的因素1共軛效應(yīng)Tips：25.朗伯-比爾定律——定量分析的基礎(chǔ)當(dāng)強(qiáng)度為I0的一定波長(zhǎng)的單色入射光束通過裝有均勻待測(cè)物的溶液介質(zhì)時(shí)，該光束將被部分吸收Ia，部分反射Ir，余下的則通過待測(cè)物的溶液It，即有：I0=Ia+It+Ir111.朗伯-比爾定律——定量分析的基礎(chǔ)當(dāng)強(qiáng)度為I0的一定波長(zhǎng)的單色朗伯-比爾定律如果吸收介質(zhì)是溶液（測(cè)定中一般是溶液），式中反射光強(qiáng)度主要與器皿的性質(zhì)及溶液的性質(zhì)有關(guān)，在相同的測(cè)定條件下，這些因素是固定不變的，并且反射光強(qiáng)度一般很小。所以可忽略不記，這樣：I0=Ia+It112.朗伯-比爾定律如果吸收介質(zhì)是溶液（測(cè)定中一般是溶液），式中反朗伯-比爾定律透光率——透光率表示透過光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比值，用T來表示，計(jì)算式為：T=It/I0T常用百分比（%）表示。吸光度——透光率的倒數(shù)的對(duì)數(shù)叫吸光度。用A表示：A=-lgT=lg(I0/It)113.朗伯-比爾定律透光率——透光率表示透過光強(qiáng)度與入射光強(qiáng)度的比朗伯-比爾定律114.朗伯-比爾定律29.當(dāng)用一束強(qiáng)度為I0的單色光垂直通過厚度為b、吸光物質(zhì)濃度為c的溶液時(shí)，溶液的吸光度正比于溶液的厚度b和溶液中吸光物質(zhì)的濃度c的乘積。朗伯-比爾定律IoItbaA=lg(I0/It)

=Kbc115.當(dāng)用一束強(qiáng)度為I0的單色光垂直通過厚度為b、吸光物質(zhì)濃度為c朗伯-比爾定律吸光系數(shù)：當(dāng)溶液濃度c的單位為g/L,溶液液層厚度b的單位為cm時(shí)，K叫“吸光系數(shù)”，用a表示，其單位為L(zhǎng)·g-1·cm-1摩爾吸光系數(shù)：當(dāng)溶液濃度c的單位為mol/L，液層厚度b的單位為cm時(shí)，K叫“摩爾吸光系數(shù)”，用ε表示，其單位為L(zhǎng)·mol-1·cm-1

ε=aM

(M為吸光物質(zhì)的分子量)116.朗伯-比爾定律吸光系數(shù)：31.紫外-可見分光光度計(jì)島津UV-2450117.紫外-可見分光光度計(jì)島津UV-245032.工作原理基儀器結(jié)構(gòu)框圖光源碘鎢燈氘燈單色器測(cè)量池參比池樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理和儀器控制光源樣品池單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制紫外-可見分光光度計(jì)118.工作原理基儀器結(jié)構(gòu)框圖光源碘鎢燈氘燈單色器測(cè)量池參比池樣品池紫外-可見分光光度計(jì)單光束分光光度計(jì)119.紫外-可見分光光度計(jì)單光束分光光度計(jì)34.雙光束分光光度計(jì)紫外-可見分光光度計(jì)120.雙光束分光光度計(jì)紫外-可見分光光度計(jì)35.吸收池的材料玻璃360nm2.25mm紫外-可見分光光度計(jì)121.吸收池的材料玻璃360nm2.25mm紫外-可見分光光度石英200nm2.5mm紫外-可見分光光度計(jì)122.石英200nm2.5mm紫外-可見分光光度計(jì)37.吸收池的形狀可拆卸圓形測(cè)量池兩面透光圓形測(cè)量池兩面透光1cm長(zhǎng)方形測(cè)量池兩面透光氣體測(cè)量池兩面透光微量測(cè)量池兩面透光流動(dòng)測(cè)量池兩面透光紫外-可見分光光度計(jì)123.吸收池的形狀可拆卸圓形測(cè)量池圓形測(cè)量池1cm長(zhǎng)方形測(cè)量池氣思考題為什么紫外可見分光光度計(jì)的最大吸收值只能到3或者5，超過該值便會(huì)造成數(shù)據(jù)溢出？124.思考題為什么紫外可見分光光度計(jì)的最大吸收值只能到3或者5，超

生物分子的紫外-可見吸收光譜糖紫外可見光譜在糖的分析中,主要作定量檢測(cè)。最大吸收波長(zhǎng)為218nm,多糖最大吸收波長(zhǎng)為206nm?！?25. 生物分子的紫外-可見吸收光譜糖紫外可見光譜在糖的分析中,

生物分子的紫外-可見吸收光譜脂脂肪○○230~240nm,于有機(jī)溶劑中（如乙醇、正己烷等）126. 生物分子的紫外-可見吸收光譜脂脂○○230~240nm,類脂維生素A326nm于乙醇番茄紅素番茄紅素在溶劑正己烷中的譜圖番茄紅素在溶劑石油醚中的譜圖生物分子的紫外-可見吸收光譜127.類維生素A326nm于乙醇番茄紅素番茄紅素在溶劑正己烷中的

生物分子的紫外-可見吸收光譜蛋白質(zhì)Proteinsinsolutionabsorbultravioletlightwithabsorbancemaximaat280and200nm.Aminoacidswitharomaticringsaretheprimaryreasonfortheabsorbancepeakat280nm.Peptidebondsareprimarilyresponsibleforthepeakat200nm.酪氨酸

色氨酸

苯丙氨酸128.生物分子的紫外-可見吸收光譜蛋白質(zhì)Prot生物分子的紫外-可見吸收光譜核酸嘌呤和嘧啶在250～280nm有強(qiáng)的吸收作用，綜合起來在260nm吸收值最大。Tips：1.吸收強(qiáng)度：?jiǎn)魏塑账?gt;單鏈DNA>雙鏈DNA（增色效應(yīng)、減色效應(yīng)）2.A260/A280＝1.8～2.0，DNA較純A260/A280

<1.8，DNA樣品中含有蛋白質(zhì)A260/A280>2.0，DNA樣品中含有RNA129.生物分子的紫外-可見吸收光譜核酸嘌呤和嘧啶在250～280微生物的紫外-可見吸收光譜600nm測(cè)細(xì)菌等微生物的濁度，用于估計(jì)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。比如，得到的OD600的數(shù)值如果在0.6-0.8之間，表明細(xì)菌處于旺盛生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600>3表明細(xì)菌已經(jīng)飽和等。130.微生物的紫外-可見吸收光譜600nm測(cè)細(xì)菌等微生物的濁度，核酸蛋白測(cè)定儀EppendorfBioPhotometerplus

131.核酸蛋白測(cè)定儀EppendorfBioPhotometerELISA原理圖YY

①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）

②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）酶標(biāo)儀132.ELISA原理圖YY②酶標(biāo)記的抗原或抗酶標(biāo)儀TecanInfinite?200Pro多功能酶標(biāo)儀ELISA酶底物顯色反應(yīng)

測(cè)定波長(zhǎng)

辣根過氧化物酶鄰苯二胺

四甲替聯(lián)苯胺

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色

藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色360,450

420133.酶標(biāo)儀TecanInfinite?200Pro多功能酶分子熒光光譜134.分子熒光光譜49.什么是熒光光譜某些物質(zhì)經(jīng)紫外-可見光照射后，能立即放出能量較低（亦即波長(zhǎng)較長(zhǎng)）的光——光致發(fā)光。當(dāng)照射停止后，如化合物的發(fā)射在10-9秒鐘內(nèi)停止，則稱熒光(fluorescence);超過此限度即稱為磷光(phosphorescence)。135.什么是熒光光譜某些物質(zhì)經(jīng)紫外-可見光照射后，能立即放出能量較什么是熒光光譜136.什么是熒光光譜51.基本原理Ee0Ev0Ev1Ev2Ev3Ev4Ee1Ee2熒光發(fā)射：當(dāng)分子處于單重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層時(shí)，去活化的一種形式是以10-9~10-7s左右的短時(shí)間內(nèi)發(fā)射光子返回基態(tài)，這一過程稱為熒光發(fā)射。137.基本原理Ee0Ev0Ev1Ev2Ev3Ev4Ee1Ee2熒光激發(fā)光譜激發(fā)光譜固定熒光發(fā)射波長(zhǎng)，掃描激發(fā)波長(zhǎng)熒光激發(fā)光譜與紫外-可見吸收光譜類似，Why？橫坐標(biāo)是入射光（激發(fā)光）的波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)是發(fā)射光（熒光）的強(qiáng)度138.激發(fā)光譜激發(fā)光譜固定熒光發(fā)射波長(zhǎng)，掃描激發(fā)波長(zhǎng)熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng)，掃描發(fā)射波長(zhǎng)橫坐標(biāo)是發(fā)射光（熒光）的波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)是發(fā)射光（熒光）的強(qiáng)度發(fā)射光譜(熒光光譜)139.發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長(zhǎng)，掃描發(fā)射波長(zhǎng)橫坐標(biāo)是發(fā)射光（熒光）的140.55.2.三維熒光光譜IF

∝f(λex、λem)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長(zhǎng)、掃描激發(fā)波長(zhǎng)141.2.三維熒光光譜IF∝f(λex、λem)蒽的激發(fā)IF

∝f(λex、λem)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長(zhǎng)、掃描發(fā)射波長(zhǎng)142.IF∝f(λex、λem)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長(zhǎng)、蒽的三維等高線光譜圖143.蒽的三維等高線光譜圖58.蒽的三維等熒光強(qiáng)度光譜144.蒽的三維等熒光強(qiáng)度光譜59.熒光量子產(chǎn)率（熒光效率）化合物F0.10.290.460.600.52kF為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，取決于熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)；Ki為其他過程（如振動(dòng)弛豫等）的速率常數(shù)總和，主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。145.熒光量子產(chǎn)率（熒光效率）化合物F0.10.290.460.熒光與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)1.π*→π是有機(jī)化合物產(chǎn)生熒光的主要躍遷類型。2.產(chǎn)生熒光的有機(jī)物質(zhì)，都含有共軛雙鍵體系，共軛體系越大，熒光越容易產(chǎn)生。產(chǎn)生熒光的條件146.熒光與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)1.π*→π是有機(jī)化合物產(chǎn)生熒熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加，有利于熒光發(fā)射。3.剛性平面結(jié)構(gòu)熒光與有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)147.熒光物質(zhì)的剛性和平面性增加，3.剛性平面結(jié)構(gòu)熒光與有機(jī)化合熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系148.熒光強(qiáng)度與濃度的關(guān)系63.熒光的淬滅熒光淬滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低或消失的現(xiàn)象。熒光淬滅劑：這些溶劑分子或其它溶質(zhì)分子稱為熒光淬滅劑（如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基/羰基/羧基化合物等）。149.熒光的淬滅熒光淬滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）FluorescenceResonanceEnergyTransfer相互作用的研究150.熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）相互作用熒光分光光度計(jì)光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器問題：熒光分光光度計(jì)與紫外-可見分光光度計(jì)有何異同點(diǎn)？151.熒光分光光度計(jì)光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理光源紫外-可見分光光度計(jì):光源樣品池單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制熒光(磷光)分光光度計(jì):光源樣品池激發(fā)單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器熒光分光光度計(jì)152.紫外-可見分光光度計(jì):光源樣品池單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理熒光(磷熒光分光光度計(jì)HitachiF-7000153.熒光分光光度計(jì)HitachiF-700068.樣品池1.樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池一樣2.吸收池的形狀：紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池兩面透光熒光分光光度計(jì)的樣品池四面透光問題：紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池與熒光分光光度計(jì)的樣品池有什么區(qū)