第十二章-遺傳工程-課件

第十二章遺傳工程ppt課件第十二章遺傳工程ppt課件1第十二章-遺傳工程-課件2第十二章-遺傳工程-課件3第十二章-遺傳工程-課件4第二節(jié)基因的分離基因分離（克?。┌?個步驟：1.目標(biāo)DNA片段（基因）的分離2.目標(biāo)基因克隆到載體上3.載體導(dǎo)入宿主細胞并在其中大量復(fù)制第二節(jié)基因的分離5一、工具酶1、限制性內(nèi)切核酸酶

限制酶：作用于特定（異）核苷酸序列的磷酸二脂酶Ⅰ型酶：僅EcoB和EcoK兩種，催化限制性切割和修飾核苷酸2種功能Ⅱ型酶：遺傳工程中應(yīng)用最廣泛Ⅲ型酶：具有特異的識別位點，識別位點是非對稱的

一、工具酶6Ⅱ型限制性酶的基本特性：①有特異識別和切割的序列部位②DNA分子上兩個單鏈斷裂的部位通常不是直接相對的③斷裂所形成的DNA片段常具有堿基互補的單鏈尾巴（粘性末端）④內(nèi)切酶的切割和修飾功能由兩個不同的酶催化所完成，即內(nèi)切酶活性和甲基化作用活性是分開的

Ⅱ型限制性酶的基本特性：7限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切位點及酶切產(chǎn)物連接

回紋序列限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切位點及酶切產(chǎn)物連接回紋序列8圖12-1通過用相同的限制性內(nèi)切酶切割形成一個重組DNA分子

第十二章-遺傳工程-課件9限制性內(nèi)切酶SmaI的識別及酶切位點平齊末端限制性內(nèi)切酶SmaI的識別及酶切位點平齊末端102、DNA連接酶

DNA連接酶是重組DNA分子構(gòu)建必不可少的工具酶，能催化DNA中相鄰的3’–OH和5’–磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA連接起來2、DNA連接酶113、反轉(zhuǎn)錄酶

反轉(zhuǎn)錄酶是一類以RNA為模板來指導(dǎo)DNA合成的DNA聚合酶，故又稱依賴于RNA的DNA聚合酶通常用反轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)建cDNA文庫（cDNAlibrary）

3、反轉(zhuǎn)錄酶124、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

PCR是體外快速擴增DNA的方法,由美國的Mullis(1986)發(fā)明,1993年諾貝爾化學(xué)獎

PCR可對特定DNA片段進行擴增，且可用痕量DNA作模板，對DNA純度要求也不高,可在幾小時內(nèi)使目的基因片段擴增到數(shù)百萬個拷貝PCR反應(yīng)在一種混合液中進行，該混合液包括四種主要成分：兩個引物（一般為20bp）、模板DNA、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶，在95℃甚至更高的溫度下活性穩(wěn)定）和四種脫氧核苷酸。PCR反應(yīng)在PCR儀上自動進行4、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)13PCR反應(yīng)從啟動到結(jié)束稱為一個循環(huán)，每個循環(huán)包括三個步驟：1）變性：95℃，DNA雙鏈分離成單鏈2）退火(復(fù)性)：55℃左右，引物與單鏈的模板DNA序列互補結(jié)合3）延伸：72℃左右，Taq酶通過在引物的3’-OH端增加堿基的辦法使引物延伸PCR反應(yīng)從啟動到結(jié)束稱為一個循環(huán)，每個循環(huán)包括三個步驟：14表12-2PCR循環(huán)數(shù)與PCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)之間的關(guān)系循環(huán)數(shù)PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)12125253210210102415215327682022010485762522533554432302301073741824表12-2PCR循環(huán)數(shù)與PCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)之間的關(guān)系循環(huán)數(shù)15二、載體1、重組DNA技術(shù)重組DNA：指利用不同生物來源的DNA分子拼接的雜種DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子重組DNA技術(shù)是基因克隆的關(guān)鍵技術(shù)，其主要步驟為：1)從細胞或組織獲得DNA并純化2)用限制酶切割DNA3)將獲得的限制片段連接到載體上,形成重組DNA分子4)重組DNA導(dǎo)入宿主細胞，在宿主細胞內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生大量相同拷貝的重組DNA分子--克隆5)克隆的DNA分子可以從宿主細胞中回收，純化6)克隆的DNA可以轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)品可以被分離出來用于研究或商業(yè)開發(fā)。

二、載體16圖12-5重組DNA技術(shù)流程圖12-5重組DNA技術(shù)流程172、載體

載體：將外源基因送入受體細胞的工具載體類型：細菌質(zhì)粒、噬菌體或病毒、細菌/酵母菌人工染色體BAC、YAC等載體特點：①在宿主細胞中能獨立復(fù)制，即本身為復(fù)制子，有獨立的復(fù)制起始位點②有限制酶切位點，允許外源基因插入且插入后隨載體DNA分子一同進行復(fù)制或擴增③有選擇標(biāo)記，便于選擇含重組DNA分子的寄主細胞④分子量小，多拷貝，易于操作⑤具有安全性等2、載體18

（1）細菌質(zhì)粒：廣泛應(yīng)用于基因工程圖12-6質(zhì)粒PUC18的結(jié)構(gòu)及多克隆位點

（1）細菌質(zhì)粒：廣泛應(yīng)用于基因工程圖12-6質(zhì)粒PUC119Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒包括五個區(qū)域，1.LB與RB之間的T-DNA，這段序列整合到植物基因組中；2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(PT)；3.冠癭堿代謝區(qū)；4.復(fù)制原點；5.毒性區(qū)。

Ti質(zhì)粒及其衍生載體20→T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將細菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到這個區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組?！鶹ir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉(zhuǎn)移。→T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無關(guān)，所以將致瘤基因全部缺21Ti質(zhì)粒是約150-200kb的環(huán)狀DNA分子，很難直接使用，故需對其加以改造，構(gòu)建出Ti質(zhì)粒的衍生載體系統(tǒng)，廣泛用作植物基因工程中的載體：（1）雙元載體(binaryvectors）如pBin19載體，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作為細菌選擇標(biāo)記，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作為植物的選擇標(biāo)記，pUC19的多克隆位點及α-互補顯色標(biāo)記（2）共整合載體(integratedvectors)

Ti質(zhì)粒是約150-200kb的環(huán)狀DNA分子，很難直接使用22（2）噬菌體載體1、噬菌體；

2、噬菌體DNA；

3、噬菌體DNA中間基因簇；4、將連接物體外包裝后感染細菌，制備基因庫（用于基因庫構(gòu)建）（2）噬菌體載體23（3）克隆大片段DNA的載體

粘粒載體克隆外源片段的長度在15~45kb之間（3）克隆大片段DNA的載體24細菌人工染色體(BAC)上述的幾種載體都不能攜帶大于50kb的外源DNA片段，而很多真核生物基因長度在50kb以上。細菌人工染色體載體就是為克隆更大的外源DNA片段而設(shè)計構(gòu)建的圖12-9細菌人工染色體載體pBAC108L及其多克隆位點?？刹迦脒_300kb左右的DNA片段細菌人工染色體(BAC)圖12-9細菌人工染色體載體pBA25酵母人工染色體（YAC）YAC載體可以插入大片段的DNA（1-2Mb），成為人類基因組計劃（HGP）的一種重要工具

酵母人工染色體（YAC）26三、基因分離方法一個基因就是編碼一條多肽鏈的一個DNA片段，包括啟動子、終止子及內(nèi)含子。利用DNA重組技術(shù)，可從一個含有10萬個基因的大基因組中，準(zhǔn)確地分離出特異的單個目的基因。分離與鑒定基因是DNA重組中的關(guān)鍵步驟之一。

三、基因分離方法271、基于文庫的基因分離方法基因文庫(library)：是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因庫中分離基因，首先要構(gòu)建基因文庫（1）構(gòu)建基因文庫

基因組文庫：使用與切割質(zhì)粒相同的限制性內(nèi)切酶，將供體生物體的基因組DNA切成許多片段，然后將其連接到載體上構(gòu)成的一個重組DNA群體cDNA文庫：以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，合成cDNA，將其與適當(dāng)載體連接并轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)進行擴增構(gòu)建成的基因庫?？寺√囟ɑ?/p>

1、基于文庫的基因分離方法28（2）篩選基因庫大多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫如：篩選λ噬菌體構(gòu)建的庫常利用菌落雜交法：將經(jīng)重組噬菌體(來自基因庫)感染的宿主細菌細胞與培養(yǎng)基混合后，倒在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜，形成噬菌斑

（2）篩選基因庫29

圖12-11菌落雜交技術(shù)

圖12-11菌落雜交技術(shù)30（3）陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一步分析、鑒定，才能得到目的基因生物信息分析功能預(yù)測、功能鑒定（3）陽性克隆的分析與鑒定312、T-DNA標(biāo)簽克隆基因

利用T-DNA插入突變創(chuàng)造突變體，獲取目標(biāo)基因或克隆T-DNA載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物（T1，T-DNA雜合子)收獲T2種子篩選T2，獲突變子，應(yīng)為3:1分離確定T-DNA與突變型共分離的個體

產(chǎn)生純合后代克隆T-DNA兩側(cè)的植物DNA利用側(cè)翼DNA序列作探針從cDNA文庫中釣取基因

基因功能的驗證（遺傳互補測驗，分離的野生基因轉(zhuǎn)化突變體，回復(fù)功能）圖12-12T-DNA標(biāo)簽克隆基因的基本原理

2、T-DNA標(biāo)簽克隆基因T-DNA載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物（T323、基于PCR的基因克隆

PCR可在數(shù)小時內(nèi)使目的基因片段擴增到數(shù)百萬個拷貝，可代替一些經(jīng)載體克隆基因的方法。其原理是根據(jù)待擴增基因的序列合成引物，使兩個引物序列之間的基因序列獲得大量擴增，產(chǎn)生大量的基因拷貝用于研究

4、基因的人工合成

對于已知核苷酸序列、分子量較小的基因可以通過化學(xué)合成法制備基因。一般先一段一段地合成，然后將這些小片段連接起來。人工合成基因可以由DNA自動合成儀來完成3、基于PCR的基因克隆33四、重組DNA分子四、重組DNA分子34第三節(jié)外源基因的導(dǎo)入一、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化1、根癌農(nóng)桿菌(Ti質(zhì)粒)

第三節(jié)外源基因的導(dǎo)入352、發(fā)根農(nóng)桿菌(Ri質(zhì)粒)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物細胞產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根(發(fā)狀根)Ri質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)很相似，可以分為T區(qū)、vir區(qū)、ori區(qū)和其它區(qū)域等幾個部分。T區(qū)與Ti質(zhì)粒的T-DNA十分相似，包括①T區(qū)的左右邊界序列;②TL-DNA區(qū);③TR-DNA區(qū)。

2、發(fā)根農(nóng)桿菌(Ri質(zhì)粒)36圖12-15棉花轉(zhuǎn)基因植株生產(chǎn)過程F1.共培養(yǎng)2.在選擇培養(yǎng)基上篩選3.篩選獲得的抗性愈傷5.胚萌發(fā)成苗6.轉(zhuǎn)基因植株移栽大田4.抗性愈傷分化成胚狀體圖12-15棉花轉(zhuǎn)基因植株生產(chǎn)過程F1.共培養(yǎng)2.在選37二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

基因槍法\生物彈法\微粒槍法\微粒轟擊法依賴高速的金屬微粒將外源基因?qū)牖罴毎囊环N轉(zhuǎn)化技術(shù)?；驑尫ㄊ抢^農(nóng)桿菌介導(dǎo)法之后又一應(yīng)用較廣的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。其優(yōu)點是該方法無宿主限制，可以對任何基因型材料進行轉(zhuǎn)化研究

二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化基因槍法\生物彈法\微粒槍法\微38第四節(jié)轉(zhuǎn)基因生物的檢測與鑒定

PCRSouthernblotNorthernblotWesternblot性狀（表型）鑒定第四節(jié)轉(zhuǎn)基因生物的檢測與鑒定39第十二章-遺傳工程-課件40M12

3456

789PCRSouthernblotM1234567841第十二章-遺傳工程-課件42第五節(jié)基因工程的應(yīng)用一、基因工程的應(yīng)用1、轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑、抗蟲、抗病、抗逆的優(yōu)良品系或品種，很多已經(jīng)大面積種植推廣。2002年5000萬公頃：大豆、玉米、棉花、水稻、馬鈴薯、番茄、小麥等第五節(jié)基因工程的應(yīng)用432、轉(zhuǎn)基因動物：羊、牛2、轉(zhuǎn)基因動物：羊、牛44

3、基因工程工業(yè)

生產(chǎn)胰島素等

在細菌中產(chǎn)生胰島素的方法在細菌中產(chǎn)生胰島素的方法454、遺傳疾病診斷RFLP法（鐮刀性貧血?。?/p>

4、遺傳疾病診斷465、基因治療

利用基因工程技術(shù)，將特異基因?qū)氩⒄系骄哂羞z傳缺陷的患者的基因組中，以治療遺傳疾病基因治療的載體和重組DNA分子

5、基因治療基因治療的載體和重組DNA分子476、DNA芯片

DNA芯片(DNAchips)是將核酸分子雜交的原理和方法,與半導(dǎo)體技術(shù)結(jié)合而發(fā)展形成的一門新技術(shù)6、DNA芯片48二、安全問題

1、轉(zhuǎn)基因植物成為雜草2、導(dǎo)致新的病蟲害，威脅生物多樣性3、食品安全性二、安全問題49第十二章遺傳工程ppt課件第十二章遺傳工程ppt課件50第十二章-遺傳工程-課件51第十二章-遺傳工程-課件52第十二章-遺傳工程-課件53第二節(jié)基因的分離基因分離（克隆）包括3個步驟：1.目標(biāo)DNA片段（基因）的分離2.目標(biāo)基因克隆到載體上3.載體導(dǎo)入宿主細胞并在其中大量復(fù)制第二節(jié)基因的分離54一、工具酶1、限制性內(nèi)切核酸酶

限制酶：作用于特定（異）核苷酸序列的磷酸二脂酶Ⅰ型酶：僅EcoB和EcoK兩種，催化限制性切割和修飾核苷酸2種功能Ⅱ型酶：遺傳工程中應(yīng)用最廣泛Ⅲ型酶：具有特異的識別位點，識別位點是非對稱的

一、工具酶55Ⅱ型限制性酶的基本特性：①有特異識別和切割的序列部位②DNA分子上兩個單鏈斷裂的部位通常不是直接相對的③斷裂所形成的DNA片段常具有堿基互補的單鏈尾巴（粘性末端）④內(nèi)切酶的切割和修飾功能由兩個不同的酶催化所完成，即內(nèi)切酶活性和甲基化作用活性是分開的

Ⅱ型限制性酶的基本特性：56限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切位點及酶切產(chǎn)物連接

回紋序列限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切位點及酶切產(chǎn)物連接回紋序列57圖12-1通過用相同的限制性內(nèi)切酶切割形成一個重組DNA分子

第十二章-遺傳工程-課件58限制性內(nèi)切酶SmaI的識別及酶切位點平齊末端限制性內(nèi)切酶SmaI的識別及酶切位點平齊末端592、DNA連接酶

DNA連接酶是重組DNA分子構(gòu)建必不可少的工具酶，能催化DNA中相鄰的3’–OH和5’–磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA連接起來2、DNA連接酶603、反轉(zhuǎn)錄酶

反轉(zhuǎn)錄酶是一類以RNA為模板來指導(dǎo)DNA合成的DNA聚合酶，故又稱依賴于RNA的DNA聚合酶通常用反轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)建cDNA文庫（cDNAlibrary）

3、反轉(zhuǎn)錄酶614、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

PCR是體外快速擴增DNA的方法,由美國的Mullis(1986)發(fā)明,1993年諾貝爾化學(xué)獎

PCR可對特定DNA片段進行擴增，且可用痕量DNA作模板，對DNA純度要求也不高,可在幾小時內(nèi)使目的基因片段擴增到數(shù)百萬個拷貝PCR反應(yīng)在一種混合液中進行，該混合液包括四種主要成分：兩個引物（一般為20bp）、模板DNA、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶，在95℃甚至更高的溫度下活性穩(wěn)定）和四種脫氧核苷酸。PCR反應(yīng)在PCR儀上自動進行4、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)62PCR反應(yīng)從啟動到結(jié)束稱為一個循環(huán)，每個循環(huán)包括三個步驟：1）變性：95℃，DNA雙鏈分離成單鏈2）退火(復(fù)性)：55℃左右，引物與單鏈的模板DNA序列互補結(jié)合3）延伸：72℃左右，Taq酶通過在引物的3’-OH端增加堿基的辦法使引物延伸PCR反應(yīng)從啟動到結(jié)束稱為一個循環(huán)，每個循環(huán)包括三個步驟：63表12-2PCR循環(huán)數(shù)與PCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)之間的關(guān)系循環(huán)數(shù)PCR產(chǎn)物拷貝數(shù)12125253210210102415215327682022010485762522533554432302301073741824表12-2PCR循環(huán)數(shù)與PCR產(chǎn)物的拷貝數(shù)之間的關(guān)系循環(huán)數(shù)64二、載體1、重組DNA技術(shù)重組DNA：指利用不同生物來源的DNA分子拼接的雜種DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子重組DNA技術(shù)是基因克隆的關(guān)鍵技術(shù)，其主要步驟為：1)從細胞或組織獲得DNA并純化2)用限制酶切割DNA3)將獲得的限制片段連接到載體上,形成重組DNA分子4)重組DNA導(dǎo)入宿主細胞，在宿主細胞內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生大量相同拷貝的重組DNA分子--克隆5)克隆的DNA分子可以從宿主細胞中回收，純化6)克隆的DNA可以轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)品可以被分離出來用于研究或商業(yè)開發(fā)。

二、載體65圖12-5重組DNA技術(shù)流程圖12-5重組DNA技術(shù)流程662、載體

載體：將外源基因送入受體細胞的工具載體類型：細菌質(zhì)粒、噬菌體或病毒、細菌/酵母菌人工染色體BAC、YAC等載體特點：①在宿主細胞中能獨立復(fù)制，即本身為復(fù)制子，有獨立的復(fù)制起始位點②有限制酶切位點，允許外源基因插入且插入后隨載體DNA分子一同進行復(fù)制或擴增③有選擇標(biāo)記，便于選擇含重組DNA分子的寄主細胞④分子量小，多拷貝，易于操作⑤具有安全性等2、載體67

（1）細菌質(zhì)粒：廣泛應(yīng)用于基因工程圖12-6質(zhì)粒PUC18的結(jié)構(gòu)及多克隆位點

（1）細菌質(zhì)粒：廣泛應(yīng)用于基因工程圖12-6質(zhì)粒PUC168Ti質(zhì)粒及其衍生載體Ti質(zhì)粒包括五個區(qū)域，1.LB與RB之間的T-DNA，這段序列整合到植物基因組中；2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(PT)；3.冠癭堿代謝區(qū)；4.復(fù)制原點；5.毒性區(qū)。

Ti質(zhì)粒及其衍生載體69→T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無關(guān)，所以將致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，將細菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到這個區(qū)域，形成的T-DNA仍可將RB至LB內(nèi)的序列轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組?！鶹ir區(qū)的毒性基因是T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的，毒性基因可以順式及反式兩種方式控制T-DNA轉(zhuǎn)移。→T-DNA區(qū)域內(nèi)的所有基因與轉(zhuǎn)移無關(guān)，所以將致瘤基因全部缺70Ti質(zhì)粒是約150-200kb的環(huán)狀DNA分子，很難直接使用，故需對其加以改造，構(gòu)建出Ti質(zhì)粒的衍生載體系統(tǒng)，廣泛用作植物基因工程中的載體：（1）雙元載體(binaryvectors）如pBin19載體，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作為細菌選擇標(biāo)記，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作為植物的選擇標(biāo)記，pUC19的多克隆位點及α-互補顯色標(biāo)記（2）共整合載體(integratedvectors)

Ti質(zhì)粒是約150-200kb的環(huán)狀DNA分子，很難直接使用71（2）噬菌體載體1、噬菌體；

2、噬菌體DNA；

3、噬菌體DNA中間基因簇；4、將連接物體外包裝后感染細菌，制備基因庫（用于基因庫構(gòu)建）（2）噬菌體載體72（3）克隆大片段DNA的載體

粘粒載體克隆外源片段的長度在15~45kb之間（3）克隆大片段DNA的載體73細菌人工染色體(BAC)上述的幾種載體都不能攜帶大于50kb的外源DNA片段，而很多真核生物基因長度在50kb以上。細菌人工染色體載體就是為克隆更大的外源DNA片段而設(shè)計構(gòu)建的圖12-9細菌人工染色體載體pBAC108L及其多克隆位點。可插入達300kb左右的DNA片段細菌人工染色體(BAC)圖12-9細菌人工染色體載體pBA74酵母人工染色體（YAC）YAC載體可以插入大片段的DNA（1-2Mb），成為人類基因組計劃（HGP）的一種重要工具

酵母人工染色體（YAC）75三、基因分離方法一個基因就是編碼一條多肽鏈的一個DNA片段，包括啟動子、終止子及內(nèi)含子。利用DNA重組技術(shù)，可從一個含有10萬個基因的大基因組中，準(zhǔn)確地分離出特異的單個目的基因。分離與鑒定基因是DNA重組中的關(guān)鍵步驟之一。

三、基因分離方法761、基于文庫的基因分離方法基因文庫(library)：是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。從基因庫中分離基因，首先要構(gòu)建基因文庫（1）構(gòu)建基因文庫

基因組文庫：使用與切割質(zhì)粒相同的限制性內(nèi)切酶，將供體生物體的基因組DNA切成許多片段，然后將其連接到載體上構(gòu)成的一個重組DNA群體cDNA文庫：以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，合成cDNA，將其與適當(dāng)載體連接并轉(zhuǎn)化到宿主細胞內(nèi)進行擴增構(gòu)建成的基因庫。克隆特定基因

1、基于文庫的基因分離方法77（2）篩選基因庫大多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探針(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針，也可用抗體作探針，篩選基因庫如：篩選λ噬菌體構(gòu)建的庫常利用菌落雜交法：將經(jīng)重組噬菌體(來自基因庫)感染的宿主細菌細胞與培養(yǎng)基混合后，倒在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜，形成噬菌斑

（2）篩選基因庫78

圖12-11菌落雜交技術(shù)

圖12-11菌落雜交技術(shù)79（3）陽性克隆的分析與鑒定

從基因庫中篩選出的陽性克隆，還需進一步分析、鑒定，才能得到目的基因生物信息分析功能預(yù)測、功能鑒定（3）陽性克隆的分析與鑒定802、T-DNA標(biāo)簽克隆基因

利用T-DNA插入突變創(chuàng)造突變體，獲取目標(biāo)基因或克隆T-DNA載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物（T1，T-DNA雜合子)收獲T2種子篩選T2，獲突變子，應(yīng)為3:1分離確定T-DNA與突變型共分離的個體

產(chǎn)生純合后代克隆T-DNA兩側(cè)的植物DNA利用側(cè)翼DNA序列作探針從cDNA文庫中釣取基因

基因功能的驗證（遺傳互補測驗，分離的野生基因轉(zhuǎn)化突變體，回復(fù)功能）圖12-12T-DNA標(biāo)簽克隆基因的基本原理

2、T-DNA標(biāo)簽克隆基因T-DNA載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物（T813、基于PCR的基因克隆

PCR可在數(shù)小時內(nèi)使目的基因片段擴增到數(shù)百萬個拷貝，可代替一些經(jīng)載體克隆基因的方法。其原理是根據(jù)待擴增基因的序列合成引物，使兩個引物序列之間的基因序列獲得大量擴增，產(chǎn)生大量的基因拷貝用于研究

4、基因的人工合成

對于已知核苷酸序列、分子量較小的基因可以通過化學(xué)合成法制備基因。一般先一段一段地合成，然后將這些小片段連接起來。人工合成基因可以由DNA自動合成儀來完成3、基于PCR的基因克隆82四、重組DNA分子四、重組DNA分子83第三節(jié)外源基因的導(dǎo)入一、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化1、根癌農(nóng)桿菌(Ti質(zhì)粒)

第三節(jié)外源基因的導(dǎo)入842、發(fā)根農(nóng)桿菌(Ri質(zhì)粒)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后植物細胞產(chǎn)生許多不定根，這種不定根生長迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根(