豬支原體肺炎疫苗多菌株免疫效果比較

JAASIVMADCprotocol第11頁共32頁編號：10-3-10豬支原體肺炎疫苗多菌株免疫效果比較豬支原體肺炎疫苗多菌株免疫效果比較試驗方案豬支原體肺炎疫苗多菌株免疫效果比較參考編號試驗的日期動物試驗開始日期2014--動物試驗完成日期2014--實驗室試驗開始日期2014--實驗室試驗完成日期2014--動物試驗地點實驗室試驗地點江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所試驗負責(zé)人邵國青動物試驗負責(zé)人馮志新、熊祺琰、華利忠動物試驗參與者甘源、王佳、徐飛揚、陳財實驗室試驗負責(zé)人馮志新、熊祺琰、華利忠實驗室實驗參與者：馮志新、熊祺琰、馬慶紅、陳財、王佳試驗方案起草人馮志新、熊祺琰、華利忠試驗方案討論參加者邵國青、劉茂軍、馮志新、熊祺琰試驗方案定稿人及時間2014-記錄的附件頁數(shù)

目錄豬支原體肺炎疫苗多菌株免疫效果比較 1豬支原體肺炎疫苗多菌株免疫效果比較 1目錄 2豬支原體肺炎疫苗多菌株免疫效果比較 31目的 32材料與方法 32.1材料 32.2方法 42.2.1動物分組說明 42.2.2動物分組與試驗操作概表 52.2.3免疫 62.2.4疫苗免疫后臨床癥狀觀察記錄 72.2.5疫苗免疫后血清抗體及分型檢測 72.2.6疫苗免疫后細胞免疫指標(biāo)檢測 72.2.7疫苗免疫后黏膜免疫指標(biāo)檢測 72.2.8攻毒 7附錄1攻毒保護率計算 9附錄2豬支原體肺炎發(fā)病豬臨床癥狀評判標(biāo)準(zhǔn) 10附錄3動物分組記錄表 11附錄4動物免疫記錄表 12附錄5免疫后異常臨床癥狀觀察記錄表 13附錄6抗體檢測記錄表 14附錄7淋巴細胞增殖試驗結(jié)果 16附錄8血象分析 17附錄9T淋巴細胞分類計數(shù) 18附錄10黏膜抗體檢測記錄表 19附錄11攻毒記錄單 20附錄12特殊情況記錄表 21附錄13攻毒后臨床癥狀觀察記錄表 22附錄14日增重記錄 24附錄15攻毒后肺部剖檢記錄 26附錄16攻毒后剖檢記錄 28附錄17攻毒后肺部病理損傷記錄 30附錄18攻毒后肺部豬肺炎支原體抗原定量檢測 32

豬支原體肺炎疫苗多菌株免疫效果比較1目的豬支原體肺炎活疫苗AN306菌株與原168菌株的肺內(nèi)注射免疫效果比較；豬支原體肺炎疫苗（天邦、吉林正業(yè)、輝瑞）免疫效果比較；2材料與方法2.1材料2.1.1待試的疫苗產(chǎn)品與試劑2.1.1.1疫苗A.豬支原體肺炎活疫苗AN306株F321，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所研制，規(guī)格為2×107CCU/瓶（2ml凍干），批號為20140325。有效期：______。PCR鑒定:Mhp_____，Mhr_______。B.豬支原體肺炎活疫苗（168株），由南京天邦生物科技有限公司提供，規(guī)格為50頭份/瓶，批號為139078-1。有效期：______。PCR鑒定:Mhp_____，Mhr_______。C.豬支原體肺炎活疫苗（乳兔繼代株），由吉林正業(yè)生物科技有限公司提供，規(guī)格為4頭份/瓶，批號為2014002。有效期：_20150110__D.豬支原體肺炎滅活疫苗（P-5722-3株，SuvaxynRespiFendMH），由上海碩騰（輝瑞）提供，規(guī)格為50頭份/瓶，批號為1302777A。有效期：15/11/16_2.1.1.2試劑A．豬支原體肺炎活疫苗（乳兔繼代株）稀釋液,批號：2014002；有效期：20170115B．豬支原體肺炎霧化活疫苗稀釋液C．豬支原體肺炎肌注活疫苗佐劑G-1-12.1.2動物選擇豬肺炎支原體抗體、抗原均陰性的5-10日齡仔豬，54頭.飼養(yǎng)地點：江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所飼養(yǎng)員：_徐飛揚，陳才__仔豬免疫狀況：未打氣喘病疫苗。2.1.3動物飼料仔豬料:2.1.4設(shè)備氣霧免疫設(shè)備、滴鼻頭、20（10、5、2）ml注射器、耳標(biāo)、耳號鉗、冰盒、相機、解剖器械、離心管。2.1.5攻毒用強毒豬肺炎支原體強毒JS株組織強毒，來自本所，批號20130625，-20℃保存，有效期至：2014/06/25。2.2方法2.2.1動物分組說明G1:-豬支原體肺炎活疫苗168株肺內(nèi)免疫組。每頭豬肺內(nèi)注射免疫1頭份（1ml）即1×107CCU的豬支原體肺炎活疫苗168株。免疫一次，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖殺。G2:-豬支原體肺炎活疫苗AN306株肺內(nèi)免疫組。每頭豬肺內(nèi)注射免疫1ml，即1×107CCU的豬支原體肺炎活疫苗AN306株。免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖殺。G3:-豬支原體肺炎活疫苗168株氣霧免疫組。每頭豬氣霧免疫5×107CCU的豬支原體肺炎活疫苗168株。免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖殺。G4:-豬支原體肺炎活疫苗168株肌注免疫組。每頭豬肌肉注射免疫5×107CCU的豬支原體肺炎活疫苗168株。首免后兩周二免，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖殺。G5:-豬支原體肺炎滅活疫苗肌注免疫組。每頭豬肌肉注射免疫1頭份(2ml)豬支原體肺炎滅活疫苗。首后2周，加強免疫一次，首免后6周攻毒，攻毒后28天剖殺。G6:-豬支原體肺炎乳兔活疫苗胸腔免疫組。每頭豬胸腔注射免疫1頭份（5ml）豬支原體肺炎乳兔活疫苗。免疫一次，一免后6周攻毒，攻毒后28天剖殺。G7:-豬支原體肺炎乳兔活疫苗滴鼻免疫組。每頭豬滴鼻免疫？頭份豬支原體肺炎乳兔活疫苗。免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖殺。G8:-健康對照組（不免疫，不攻毒）。不接種疫苗。不攻毒，其它組攻毒后28天剖殺。G9:攻毒對照組（不免疫，只攻毒）。不免疫疫苗，只攻毒，攻毒后28天剖殺。2.2.2動物分組與試驗操作概表組號組別N疫苗劑量DPI-0DPI-7DPI-14DPI-21DPI-28DPI-35DPI-42DPI-70G1168肺內(nèi)組6天邦1×107CCU/頭（1頭份）肺內(nèi)免疫/采血/鼻拭子/稱重鼻拭子采血/鼻拭子鼻拭子采血/鼻拭子鼻拭子采血/鼻拭子/攻毒/稱重剖檢/稱重G2AN306肺內(nèi)組6ADC1×107CCU/頭G3168氣霧組6天邦5×107CCU/頭氣霧免疫/采血/鼻拭子/稱重G4168肌注組6天邦5×107CCU/頭肌注免疫/采血/鼻拭子/稱重肌注免疫/鼻拭子采血/鼻拭子G5滅活苗組6輝瑞2ml/1頭份G6乳兔苗胸腔組6吉林正業(yè)5ml/1頭份胸腔免疫/采血/鼻拭子/稱重采血/采血/鼻拭子鼻拭子G7乳兔苗滴鼻組6吉林正業(yè)1頭份滴鼻免疫/采血/鼻拭子/稱重G8健康對照組6--采血/鼻拭子/稱重G9攻毒對照組6--稱重攻毒/稱重總計542.2.3免疫G1—豬支原體肺炎活疫苗168株肺內(nèi)免疫組用滅菌生理鹽水50ml溶解168活疫苗凍干粉1瓶，使活疫苗終濃度為1×107CCU/ml，1頭份/ml。每頭豬肺內(nèi)免疫1ml，即1×107CCU/頭。G2—豬支原體肺炎活疫苗AN306株肺內(nèi)免疫組用滅菌生理鹽水溶解AN306活疫苗凍干粉，使活疫苗終濃度為1×107CCU/ml。每頭豬肺內(nèi)免疫1ml，即1×107CCU/頭。G3:-豬支原體肺炎活疫苗168株氣霧免疫組。將1瓶168株活疫苗用5ml無菌豬支原體肺炎霧化活疫苗稀釋液溶解稀釋成1×108CCU/ml濃度，取5ml疫苗溶液倒入噴霧器，對保溫箱中的6頭仔豬進行氣霧免疫（0.2MPa，約10min）。G4:-豬支原體肺炎活疫苗168株肌注免疫組。將1瓶168株活疫苗用25ml佐劑G-1-1溶液稀釋成2×107CCU/ml濃度，每頭仔豬頸部肌肉注射免疫2.5ml，注射時分左右側(cè)肌肉共2個注射點。首免后14天二免，方法同上。G5:-豬支原體肺炎滅活疫苗肌注免疫組。按豬支原體肺炎滅活疫苗說明書，每頭豬肌肉注射免疫1頭份豬支原體肺炎滅活疫苗。G6:-豬支原體肺炎乳兔活疫苗胸腔免疫組。按豬支原體肺炎乳兔活疫苗說明書，每頭豬胸腔免疫1頭份豬支原體肺炎活疫苗。G7:-豬支原體肺炎乳兔活疫苗滴鼻免疫組。每頭豬滴鼻免疫？頭份豬支原體肺炎乳兔活疫苗。免疫一次，6周后攻毒，攻毒后28天剖殺。G8—健康對照不免疫G9—攻毒對照不免疫2.2.4疫苗免疫后臨床癥狀觀察記錄免疫后觀察并記錄可能出現(xiàn)的臨床癥狀，填寫附錄3。尤其要記錄如下重要的癥狀：咳嗽、呼吸困難、俯臥、嘔吐、食欲不振、震顫、死亡等2.2.5疫苗免疫后血清抗體及分型檢測除攻毒對照組外，其余各組于免疫前、免疫后2、4、6周取3頭豬各采血1ml（兩次免疫組于首免前、首免后3、4、6周采血），分離血清，用自制P46-ELISA試劑盒檢測IgG抗體。對于陽性者繼續(xù)用分型試劑盒檢測IgG亞類。2.2.6疫苗免疫后細胞免疫指標(biāo)檢測除攻毒對照組外，其余各組于首免后2、4、6周取3頭豬各采集抗凝血5ml（兩次免疫組于免疫后3、4、6周采血），其中1ml用于血液生化檢測；1ml用流式細胞儀檢測CD4+T細胞、CD8+T細胞含量、CD4+CD8+雙陽性細胞、CD4+/CD8+比率；另外3ml用于淋巴細胞增殖試驗和IFN-γ檢測2.2.7疫苗免疫后黏膜免疫指標(biāo)檢測除攻毒對照組外，其余各組于免疫前、首免后7、14、21、28、35、42天采集鼻拭子樣品，檢測吸呼道特異性sIgA抗體。2.2.8攻毒將每瓶豬肺炎支原體組織強毒用50ml生理鹽水稀釋，氣管途徑接種試驗組試驗豬，每頭5ml。2.2.9攻毒后臨床癥狀觀察所有豬在攻毒后按附錄2要求觀察臨床癥狀2.2.10日增重計算各組分別選定3頭豬，不采集血樣，分別于首免當(dāng)天、攻毒當(dāng)天和剖殺當(dāng)天稱重，計算日增重。2.2.11攻毒后肉眼病變剖檢所有仔豬在攻毒后的第28天進行宰殺，記錄肺病變，用28分法統(tǒng)計確定肺病變程度，并記算攻毒保護率（見附錄1）。2.2.12攻毒后病理損傷觀察剖殺后，采集所有豬左尖葉，福爾馬列林溶液固定后，切片觀察病理損傷。2.2.13攻毒后肺部豬肺炎支原體抗原定量檢測剖殺后，每頭豬用50ml生理鹽水采集肺泡灌洗液，用定量PCR方法檢測豬肺炎支原體抗原。附錄1攻毒保護率計算攻毒保護率的統(tǒng)計與評判：試驗豬撲殺后，分別記錄左尖葉、左心葉、左膈葉、右尖葉、右心葉、右膈葉、副葉病變百分比率，將0～25%記為1；26～50%記為2；51～75%記為3；76～100%記為4，統(tǒng)計每個試驗豬病肺病變指數(shù)（最高為28）。試驗豬病變指數(shù)大于10判為發(fā)病，小于4為健康（排除豬肺炎支原體感染），根據(jù)肺病變指數(shù)，按以下公式計算試驗豬攻毒保護指數(shù)。試驗豬攻毒保護指數(shù)＝（攻毒不免疫對照組肺病變指數(shù)平均值－試驗豬肺病變指數(shù)）/（攻毒不免疫對照組肺病變指數(shù)平均值－不攻毒不免疫對照組肺病變指數(shù)平均值）％試驗豬攻毒保護指數(shù)小于60％為無保護，大于或等于60％為有保護，再按以下公式計算試驗豬攻毒保護率。試驗豬攻毒保護率＝有保護試驗豬數(shù)/試驗豬數(shù)試驗在陽性對照組全部發(fā)病、陰性對照組至少全部健康時有效。附錄2豬支原體肺炎發(fā)病豬臨床癥狀評判標(biāo)準(zhǔn)評判參數(shù)01210最高分咳嗽無有嚴(yán)重2呼吸困難無有嚴(yán)重2嘔吐無有嚴(yán)重2俯臥無有嚴(yán)重(躺臥)2食欲不振無有1震顫無有1死亡無有10注射后第1日(D1)直腸溫度高出范圍1.0℃以下1.0℃～1.5℃1.5℃以上2注射后第2日(D2)直腸溫度高出范圍1.0℃以下1.0℃～1.5℃1.5℃以上2注射后第3日直腸溫度較對照組高出范圍0.5℃以下0.5～1.0℃1.0℃以上2累計總分28豬安檢試驗中，每頭試驗豬癥狀全部累計，總分不大于2判為安全，累計總分大于5判為不安全，累計總分2～5，可重檢1次，重檢累計總分不大于2安全。

附錄3動物分組記錄表豬場：農(nóng)科院組別頭數(shù)標(biāo)記耳號G1168肺內(nèi)組G2AN306肺內(nèi)組G3168氣霧組G4168肌注組G5滅活苗組G6乳兔苗肺內(nèi)組G7乳兔苗滴鼻組G8健康對照G9攻毒對照J(rèn)AASIVMADCprotocol第32頁共32頁編號：10-3-10豬氣喘病疫苗的免疫效力研究附錄4動物免疫記錄表動物免疫日期:組標(biāo)記疫苗免疫途徑劑量豬（頭數(shù)）G1168肺內(nèi)組G2AN306肺內(nèi)組G3168氣霧組G4168肌注組G5滅活苗組G6乳兔苗肺內(nèi)組G7乳兔苗滴鼻組操作人:復(fù)核人：

附錄5免疫后異常臨床癥狀觀察記錄表組： 豬數(shù)：日期： 標(biāo)記：豬號觀察日期第幾日附錄6抗體檢測記錄表組別耳標(biāo)DPI14/21DPI28DPI42IgG亞類IgG亞類IgG亞類G1G2G3G4G5耳標(biāo)DPI14/21DPI28DPI42IgG亞類IgG亞類IgG亞類G6G7G8G9

附錄7淋巴細胞增殖試驗結(jié)果

附錄8血象分析

附錄9T淋巴細胞分類計數(shù)

附錄10黏膜抗體檢測記錄表

附錄11攻毒記錄單攻毒株:批號：來源：稀釋液：