酶工程 SOD的作用及應(yīng)用

SOD的作用及應(yīng)用摘要：SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，它能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對(duì)人體不斷地補(bǔ)充SOD具有抗衰老的特殊效果。SOD在生活中有很高的商業(yè)價(jià)值，可以廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、化妝品等行業(yè)。本文從SOD的作用及應(yīng)用進(jìn)行綜述。關(guān)鍵詞：SOD超氧化歧化酶應(yīng)用Abstract:SODistheactivesubstanceinlifebodyofasource,itcaneliminatetheharmfulsubstancesgeneratedintheprocessoforganismthenewsupersedestheold.Theanti-agingspecialeffectsonthehumanbodycontinuallyreplenishSOD.SODhasaveryhighcommercialvalueinlife,canbewidelyusedinmedicine,food,cosmeticsandotherindustries.ThispaperreviewsfromthefunctionandapplicationofSOD.Keywards:SODresearchapplication超氧化物歧化酶Orgotein(SuperoxideDismutase,SOD),別名肝蛋白、奧谷蛋白，簡(jiǎn)稱：SOD。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對(duì)人體不斷地補(bǔ)充SOD具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,EC,SOD)是1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到超氧化物歧化酶開始算起，人們對(duì)SOD的研究己有七十多年的歷史。1969年McCord等重新發(fā)現(xiàn)這種蛋白，并且發(fā)現(xiàn)了它們的生物活性，弄清了它催化過氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì)，所以正式將其命名為超氧化物歧化酶。超氧物歧化酶(SuperoxideDismutase簡(jiǎn)稱SOD)是一種新型酶制劑。是廣泛存在于各種生物體內(nèi)中，人們發(fā)現(xiàn)靠氧呼吸的所有生物中都存在SOD，如微生物、植物和動(dòng)物體［1］。其含量隨生物體的不同而不同，即使同一種生物的不同組織或同一組織的不同部位其SOD的種類和含量也有很大差別。SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶、人體內(nèi)的垃圾清道夫°SOD是氧自由基的自然天敵，是機(jī)體內(nèi)氧自由基的頭號(hào)殺手，是生命健康之本。1.SOD的來源、結(jié)構(gòu)SOD是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物的生物酶，國(guó)外要用SOD系從血中提取，國(guó)內(nèi)已開發(fā)的品種一超過20種，證明我國(guó)對(duì)SOD的研究和應(yīng)用已進(jìn)入新時(shí)期。我國(guó)從牛、馬、豬、雞、狗等動(dòng)物血中提取SOD來源豐富，成本低，提取和純化方便。SOD分子結(jié)構(gòu)圖SOD分子結(jié)構(gòu)圖超氧化物歧化酶按其所含金屬輔基不同可分為三種，第一種是含銅（Cu）鋅（Zn）金屬輔基的稱（Cu.Zn—SOD），它的分子有兩個(gè)形同的亞基通過非共價(jià)鍵締合成一個(gè)“口袋”狀二聚體，每個(gè)亞基有一個(gè)二價(jià)銅離子和一個(gè)二價(jià)鋅離子子，由半膀胱氨酸cys55和cys144的巰基構(gòu)成的二巰基對(duì)亞基締合其重要作用。其中二價(jià)銅離子為CuZn-SOD活性必需的，而二價(jià)鋅離子與酶的穩(wěn)定性有關(guān)。最為常見的一種酶，呈綠色，主要存在于機(jī)體細(xì)胞漿中；第二種是是含錳（Mn）金屬輔基的稱（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞內(nèi)；由203個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的四面體，每個(gè)亞基只有一個(gè)金屬離子。第三種是含鐵（Fe）金屬輔基的稱（Fe—SOD），呈黃褐色，存在于原核細(xì)胞中。革蘭氏陽性菌中常含有Mn-SOD，革蘭氏陰性菌中常含有Fe-SOD和Mn-SOD。真核微生物的SOD含量一般高于原核生物，其中真菌里一般含有Cu/Zn-SOD和Mn-SOD[13]。2.SOD的性質(zhì)與作用機(jī)理SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，它通過上述反應(yīng)可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫。盡管過氧化氫仍是對(duì)機(jī)體有害的活性氧，但體內(nèi)的過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）會(huì)立即將其分解為完全無害的水。這樣，三種酶便組成了一個(gè)完整的防氧化鏈條。SOD在生命體中的作用機(jī)理目前，人們認(rèn)為自由基（也稱游離基）與絕大部分疾病以及人體的衰老有關(guān)。所謂的自由基就是當(dāng)機(jī)體進(jìn)行代謝時(shí)，能奪去氧的一個(gè)電子，這樣這個(gè)氧原子就變成自由基。自由基很不穩(wěn)定，它要在身體組織細(xì)胞的分子中再奪取電子來使自己配對(duì)，當(dāng)細(xì)胞分子推陳出新一個(gè)電子后，它也變成自由基，又要去搶奪細(xì)胞膜或細(xì)胞核分子中的電子，這樣又稱會(huì)產(chǎn)生新的自由基。如，超氧化物陰離子自由基、羥自由基、氫自由基和甲基自由基，等等。在細(xì)胞由于自由基非常活潑，化學(xué)反應(yīng)性極強(qiáng)，參與一系列的連鎖反應(yīng)，能引起細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)過氧化，破壞了膜的結(jié)構(gòu)和功能。它能引起蛋白質(zhì)變性和交聯(lián)，使體內(nèi)的許多酶及激素失去生物活性，機(jī)體的免疫能力、神經(jīng)反射能力、運(yùn)動(dòng)能力等系統(tǒng)活力降低，同時(shí)還能破壞核酸結(jié)構(gòu)和導(dǎo)致整個(gè)機(jī)體代謝失常等，最終使機(jī)體發(fā)生病變。因此，自由基作為人體垃圾，能夠促使某些疾病的發(fā)生和機(jī)體的衰老。雖然自由基會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生諸多危害，但是在一般的條件下人體細(xì)胞內(nèi)也存在著清除自由基、抑制自由基反應(yīng)的體系，它們有的屬于抗氧化酶類，有的屬于抗氧化劑。像SOD就是一種主要的抗氧

化酶，能清除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及預(yù)防衰老等方面起著重要作用。SOD能專一地清除體內(nèi)有害的自由基，以解除自由基氧化體內(nèi)的某些組成成分而造成的機(jī)體損害。如氧中毒、急性炎癥、水腫、自身免疫性疾病、輻射病等疾病都與活性氧的毒性有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明：SOD能夠清除自由基，因此可消除上述疾病的病因。此解毒反應(yīng)過程是兩步：第一步是：作為有害物質(zhì)的超氧陰離子在SOD的作用下和氫離子反應(yīng)，生成另一種物質(zhì)——過氧化氫；第二步是，過氧化氫又在過氧化氫酶的作用下和氫離反應(yīng)，最終生成了一種對(duì)人體無害的物質(zhì)——水。3.SOD的提取植物源SOD具有安全性高的特點(diǎn)。在研究植物源SOD時(shí)，沉淀分離純化和層析分離純化的聯(lián)合使用是常用的SOD純化方法，此方法步驟較多，需要的層析柱類型較多，因而成本較（2-5），由于資源及生產(chǎn)方式的限制，投產(chǎn)應(yīng)用的很少。選擇豐富合理的SOD來源，如何減少純化步驟，降低成本，獲得高比活力的SOD是生產(chǎn)SOD的關(guān)鍵問題。鑒于上述這些問題，提取SOD技術(shù)還不夠成熟，需要進(jìn)一步在提高產(chǎn)率、比活力和安全性，簡(jiǎn)化步驟等方面進(jìn)行研究，再與生產(chǎn)結(jié)合，才能生產(chǎn)出更好的產(chǎn)品。3超氧化物歧化酶活力測(cè)定測(cè)定超氧化物歧化酶活性的方法繁多，目前應(yīng)用的有：黃嘌吟氧化酶-細(xì)胞色素c法、黃嘌吟氧化酶-NBT還原法、腎上腺素自氧化法、鄰苯三酚自氧化法、化學(xué)發(fā)光法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法等［6-8］。SOD分離純化關(guān)鍵技術(shù)原料預(yù)處理（原料選擇、提取、離心分離）一粗酶（分級(jí)沉淀、調(diào)溶解度、超濾等）一精制（層析技術(shù)、超濾技術(shù)）一成品（冷凍干燥）［14-17］由于測(cè)定方法不同，活性的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)也不同，通常測(cè)定的結(jié)果差別很大。目前國(guó)際上對(duì)活力的測(cè)定尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。4超氧化物歧化酶的化學(xué)修飾由于天然SOD的半衰期短，穩(wěn)定性差，影響了其的應(yīng)用，因此對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾，從而達(dá)到延長(zhǎng)半衰期，提高酶的穩(wěn)定性，降低抗原性等的目的。酶的化學(xué)修飾是在分子水平上對(duì)酶進(jìn)行改造，即在體外，將酶的側(cè)鏈基團(tuán)通過人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的大分子進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的酶學(xué)性質(zhì)的技術(shù)。近些年對(duì)超氧化物歧化酶的修飾方法有很多，如低分子肝素法，。-環(huán)糊精法，聚乙二醇法，牛血清白蛋白法等［10］。4.1低分子肝素修飾法低分子肝素（LMWH）是一種抗凝血藥和溶血栓藥。目前植物中提取SOD采用的方法主要包括磷酸緩沖液提

取法、Tris-HCl和熱變性法，磷酸緩沖液法用的較多。熱變性法不引入其他雜質(zhì)對(duì)提取工藝非常有利［9］。由于SOD是一種熱穩(wěn)定性較好的酶并且大部分雜蛋白在55°C時(shí)就可變性［10］。因此本實(shí)驗(yàn)利用SOD和雜蛋白變性溫度的差異來加強(qiáng)初步分離的效果。粗取得到的SOD粗酶液必須進(jìn)一步的純化，離子交換柱層析方法是純化蛋白質(zhì)中比較常用的方法，它是依據(jù)化合物與離子交換劑的結(jié)合力的不同而進(jìn)行分離純化的。離子交換柱層析的固定相是離子交換劑，也液體為流動(dòng)相。離子交換劑是一種不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)，通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價(jià)結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成。酶活力（enzymeactivity）也稱為酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示，酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。測(cè)定酶活力實(shí)際就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速度。酶促反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。利用紫外分光光度計(jì)在325nm波長(zhǎng)下測(cè)定鄰苯三酚自氧化速率（Ao），然后以每ml反應(yīng)液中每min抑制連苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（mol/s表示），以此來測(cè)定酶的活力。植物中SOD制備純化的主要步驟如下：（1）原材料的預(yù)處理；（2）粗酶液的制備；（3）SOD的純化與精制。4.SOD的作用SOD的抗氧化作用1969年發(fā)現(xiàn)SOD能催化清除超氧陰離子自由基的反應(yīng)。自由基是具有不配對(duì)價(jià)電子的原子或原子團(tuán)，分子或離子構(gòu)成。在正常生理狀況下，生物體內(nèi)不斷地產(chǎn)生自由基，自由基的產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)。但在某些病理情況下，自由基產(chǎn)生量多時(shí)，就會(huì)對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子造成損傷，導(dǎo)致機(jī)體疾病的產(chǎn)生。由于自由基具有高度的化學(xué)活性，是人體生命活動(dòng)中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，自由基攻擊生物大分子導(dǎo)致組織損傷是許多疾病發(fā)生發(fā)展的根源。因而SOD在防御生物體免受超氧陰離子自由基損傷，抗輻射，抗腫瘤及延緩機(jī)體衰老等方面具有重要的作用［5］4.2清除機(jī)體代謝產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基延緩由于自由基侵害而出現(xiàn)的衰老現(xiàn)象，即延緩皮膚衰老和脂褐素沉淀的出現(xiàn)。衰老自由基學(xué)說認(rèn)為衰老是來自機(jī)體正常代謝過程中所產(chǎn)生的自由基隨機(jī)附帶破壞性的作用結(jié)果，自由基引起機(jī)體衰老的主要機(jī)制可概括為以下三方面。（1）減少生物大分子的交聯(lián)聚合和脂褐素的堆積；（2）減緩器官組織細(xì)胞的損傷與減少；（3）防止免疫能力的降低。4.3提高人體對(duì)自由基損傷而誘發(fā)的疾病抗力自由基損傷而誘發(fā)疾病的抵抗力主要包括腫瘤、炎癥、肺氣腫、白內(nèi)障和自身免疫疾病等當(dāng)SOD作為功能性食品基料加入食品中時(shí)，可有效抑制許多疾病的發(fā)生、發(fā)展，對(duì)人體健康有極大作用。4.4提高人體對(duì)自由基外界誘發(fā)因子的抵抗力如煙霧、輻射、有毒化學(xué)品和有毒藥品等增強(qiáng)機(jī)體對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)能力。電離輻射引起生物體內(nèi)生成O2-、?OH等自由基。?OH對(duì)機(jī)體損傷作用大且其產(chǎn)生部位常為其作用部位，故遠(yuǎn)離-OH產(chǎn)生部位的生物大分子受損的機(jī)會(huì)小。O2-的損傷作用雖遠(yuǎn)小于?OH，但可從產(chǎn)生部位擴(kuò)散到其他部位，并在鐵離子鰲合劑存在下與H反應(yīng)生成-OH,從而造成DNA、生物膜等損傷。煙霧、有毒化學(xué)品和藥品也產(chǎn)生過量的O2-損傷機(jī)體，SOD同樣可以減少這些損傷5.SOD的應(yīng)用SOD在抗衰老中的作用人體隨著年齡的增加，皮膚會(huì)變得粗糙、發(fā)皺、變黑和形成老年斑，其中老年斑是皮膚衰老的典型現(xiàn)象，即在老年人的面部、手部皮膚上出現(xiàn)黑褐色斑塊或斑點(diǎn)。老年斑主要由黑色素組成，而自由基在黑色素形成、反應(yīng)和組成中起重要作用。在有空氣存在時(shí),光照黑色素可使其耗氧增加，產(chǎn)生O-2和羥自由基。在衰老的皮膚和腦中存在的另兩類色素是脂褐素和蠟樣質(zhì)，也可使皮膚變黑和粗糙。這兩種物質(zhì)均由自由基引起。脂褐素和蠟樣質(zhì)本身也含大量自由基，可以通過多種途徑產(chǎn)生O-2。自由基雖是造成人體衰老的重要原因，但機(jī)體并不是易衰老的,機(jī)體內(nèi)也存在著抗衰老的物質(zhì)。機(jī)體內(nèi)存在著一系列的自由基清除劑（如:SOD、CAT、GSH-PX）和一些抗氧化物（如:維生素A、維生素E、維生素C等）。其中，SOD是非常重要的，它可以不斷地清除由光照黑色素耗氧過多而產(chǎn)生的O-2，防止過多的黑色素的形成。它不斷地清除由脂褐素和蠟樣質(zhì)產(chǎn)生的O-2，避免過多的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，而減少脂褐素和蠟樣質(zhì)的形成，防止衰老。SOD在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用SOD在轉(zhuǎn)基因植物中的過量表達(dá)能不同程度地提高植物對(duì)逆境的抵抗能力,MnSOD基因的過量表達(dá)在一定程度上可以提高植物轉(zhuǎn)基因植物對(duì)氧脅迫的耐受性。通過基因工程手段，增加植物內(nèi)的SOD的表達(dá)，可以大大增強(qiáng)植物的抗逆性。如［3］將存在于線粒體中的Mn-SOD導(dǎo)入煙草、苜蓿的葉綠體后，其轉(zhuǎn)基因植株可以增加對(duì)臭氧及干旱脅迫的抗性。擬蘭芥［11］的Fe-SOD基因轉(zhuǎn)化煙草葉綠體,Fe-SOD的過量表達(dá)能夠增強(qiáng)葉綠體質(zhì)膜和光合系統(tǒng)II對(duì)MV（甲基紫精）和高鹽過氧化脅迫的抗性SOD在化妝品中的應(yīng)用研究證明［12］,SOD添加于化妝品中可起到4方面的作用:一是有明顯的防曬效果，光照使皮膚變黑的主要原因是氧自由基損害，SOD可有效防止皮膚受電離輻射（特別是紫外線）的損傷，從而起到防曬效果;二是SOD為抗氧酶，能有效防止皮膚衰老、祛斑、抗皺;三是有明顯的抗炎效果,對(duì)防治皮膚病有一定sio.l，1996,12:1703-1714.效果;四是SOD具有一定的防治斑痕形成的作用。SOD在化妝品中妝品應(yīng)用廣泛，SOD也被用于化妝品中,如我國(guó)的大寶SOD蜜，用于防止皮膚衰老，另一些含SOD量高的藥物如人參、三七、黃芪等也受到重視。參考文獻(xiàn)鄒國(guó)林，裘名宜，朱彤.超氧化物歧化酶研究的歷史、現(xiàn)狀及應(yīng)用前景《氨基酸和生物資源》，1991,03金紹黑.植物超氧化物歧化酶的提取修飾制備工藝及其應(yīng)用研究[J].成都航空職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,(1):44-47.高大響，賈君.大蒜SOD提取及在SOD型酸奶中的應(yīng)用研究[J].食品科技,2010,35(1):220-222.VyasD,KumarS.PurificationandpartialcharacterizationofalowtemperatureresponsiveMn-SODfromtea(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)[J].BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2005,(329):831-838.陳莉，申小蓉，趙紅洋.佛甲草中SOD提取條件的優(yōu)化[J].草原與草坪，2009,(1):1-6董長(zhǎng)穎，張巧.三種蘆薈超氧化物歧化酶的活性測(cè)定[J].北方園藝，2009,(5):97-99.顧含真，陸領(lǐng)倩，袁勤生.超氧化物歧化酶兩種測(cè)活方法的比較[J].藥物生物技術(shù)，2006,13(5):377-379.[21]LiocheySI,FridovichI.LucigeninluminescenceasameasureofintracellularsuperoxidedismutaseactivityinEscherichiacoil.[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,94:2891-2896周志剛.超氧化物歧化酶的化學(xué)修飾進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥,2010,14(6):623-626.[23]ZhangHW,WangFS,ShaoW,etal.CharacterizationandstabilityInvestigationofCu-Zn-superoxidedismutasecovalentlymodifiedbylowmolecularweightheparin[J].Biochemistry(Moscow),2006,71(l):96-10詹嘉紅.自由基，超氧化物歧化酶與癌[J].韓山師范學(xué)院學(xué)報(bào)，1997,(2):56-68池玉杰，王明麗，孫艷紅.SOD對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)保健作用[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2000,(8):71VanCampW,CapianK,WanMontaguM,etal.Enhancementofoxidativestresstoleranceintransgen