研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性課件

Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備及其在作物中的應(yīng)用研究生:陳相輝導(dǎo)師:王忠教授專業(yè):植物學(xué)Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備及其在作物中的1一、研究目的和意義一、研究目的和意義2

Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶，ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase）是光合碳代謝中的關(guān)鍵酶，處于光合碳還原和光合碳氧化這兩個(gè)方向相反但又相互連鎖的循環(huán)的交叉點(diǎn)上，調(diào)節(jié)著光合作用和光呼吸的代謝比例，其活性大小對(duì)光合速率起著決定性作用。本課題擬以小麥為實(shí)驗(yàn)材料，采用ELISA測(cè)試技術(shù)，研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性，這些結(jié)果將有助于進(jìn)一步闡明Rubisco及Rubisco活化酶的作用機(jī)制，為最終提高作物的光合產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶，3二、選題依據(jù)二、選題依據(jù)4Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合作用研究的熱點(diǎn)問題，如何提高作物中這兩種酶的含量和活性也一直是個(gè)懸而未解決的難題。目前，國(guó)內(nèi)外多以煙草、菠菜作為研究Rubisco和Rubisco活化酶的材料，涉及小麥和水稻等作物方面的內(nèi)容較少，尤其有關(guān)小麥Rubisco活化酶的研究仍然是國(guó)內(nèi)外研究中的空白。Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合5創(chuàng)新之處本實(shí)驗(yàn)利用免疫化學(xué)技術(shù)提供一個(gè)快速、準(zhǔn)確而簡(jiǎn)易的定量測(cè)定Rubisco和Rubisco活化酶的方法，從而可以預(yù)測(cè)光合潛力和估計(jì)由于礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、水分供給、光照、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素和基因調(diào)控發(fā)生變化而引起光合作用和產(chǎn)量的變化。進(jìn)一步對(duì)Rubisco和Rubisco活化酶做深入的研究。創(chuàng)新之處本實(shí)驗(yàn)利用免疫化學(xué)技術(shù)提供一個(gè)快速、準(zhǔn)確6三、研究?jī)?nèi)容三、研究?jī)?nèi)容7Rubisco和Rubisco活化酶的提取和純化Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備Rubisco和Rubisco活化酶ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比較及其與光合作用的關(guān)系光暗處理對(duì)小麥光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶的影響施氮處理對(duì)小麥光合速率和Rubisco、Rubisco活化酶的影響Rubisco和Rubisco活化酶單克隆抗體制備初探Rubisco和Rubisco活化酶的提取和純化8試驗(yàn)設(shè)計(jì)流程Rubisco和Rubisco活化酶的分離提純Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備抗體的分離與純化利用抗體定量測(cè)定不同處理下Rubisco及Rubisco活化酶的含量

試驗(yàn)設(shè)計(jì)流程Rubisco和Rubisco活化酶的分離提純9四、材料、儀器和方法四、材料、儀器和方法101、材料與儀器1.1材料

植物材料

揚(yáng)麥5號(hào)動(dòng)物材料新西蘭大白兔1.2試劑與儀器

高速冷凍離心機(jī)液相層析收集系統(tǒng)垂直板電泳系統(tǒng)BeckmanLS-9800液體閃爍儀酶聯(lián)免疫測(cè)定儀……1、材料與儀器1.1材料112、酶的提取和純化2、酶的提取和純化123.1免疫過程:以皮內(nèi)多位點(diǎn)分?jǐn)?shù)次注射法進(jìn)行免疫首次免疫加強(qiáng)免疫二次免疫0.5ml抗原+0.5ml佐劑,皮內(nèi)注射于兔子背部多個(gè)部位三周后，0.5ml抗原+0.5ml佐劑,皮下注射于兔子背部多個(gè)部位三周后，靜脈注射0.5ml抗原檢測(cè)效價(jià)一周后，耳緣靜脈采血，檢測(cè)抗體效價(jià)3、Rubisco及Rubisco活化酶抗體的制備3.1免疫過程:首次免疫加強(qiáng)免疫二次免疫0.5ml抗原+0133.2采血

用心臟取血的方法采血

3.3分離血清4℃下離心30min，除去紅細(xì)胞，獲得血清；或者將血液收聚在培養(yǎng)皿中，37℃放置6h，用吸管吸取析出的血清。將血清分裝于滅菌瓶，儲(chǔ)存于零下20℃，或加0.1%NaN3或0.01%硫柳汞后，儲(chǔ)存于4℃冰箱中。3.2采血

用心臟取血的方法采血3.3分離血清144、ELISA法測(cè)定酶含量4、ELISA法測(cè)定酶含量15Rubisco和Rubisco活化酶的定量測(cè)定

用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原（Rubisco和Rubisco活化酶）與制備的Rubisco和Rubisco活化酶的抗體反應(yīng)，制成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將待測(cè)樣品與之相比較，求得樣品中抗原的含量Rubisco含量（mg·g-1FW）=[提取液（mL）+鮮葉重（g）]×稀釋倍數(shù)×由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的Rubisco濃度/葉片鮮重Rubisco和Rubisco活化酶的定量測(cè)定165、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定依Folin-酚試劑法（薛應(yīng)龍，1985）測(cè)定，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線6、光合速率和葉綠素含量的測(cè)定光合速率用便攜式光合速率測(cè)定儀測(cè)定葉綠素含量用分光光度計(jì)測(cè)定5、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定依Folin-酚試劑法（薛應(yīng)龍，19817五、實(shí)驗(yàn)進(jìn)展五、實(shí)驗(yàn)進(jìn)展181、Rubisco的提純和純度鑒定1、Rubisco的提純和純度鑒定19Rubisco的電泳圖譜A為Rubisco的ND圖譜B為Rubisco的SDS圖譜5500014800Rubisco的電泳圖譜5500014800202、小麥Rubisco活化酶的的提純和純度鑒定2、小麥Rubisco活化酶的的提純和純度鑒定21Rubisco活化酶的SDS圖譜A為Rubisco活化酶;B為標(biāo)準(zhǔn)蛋白4500041000Rubisco活化酶的SDS圖譜450004122六、研究計(jì)劃1、Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備2、Rubisco和Rubisco活化酶ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定3、C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比較及其與光合作用的關(guān)系4、光暗處理對(duì)小麥光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶的影響5、不同施氮水平對(duì)小麥光合速率和Rubisco、Rubisco活化酶的影響6、Rubisco和Rubisco活化酶單克隆抗體制備初探六、研究計(jì)劃1、Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制23謝謝！謝謝！謝謝！謝謝！24Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備及其在作物中的應(yīng)用研究生:陳相輝導(dǎo)師:王忠教授專業(yè):植物學(xué)Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備及其在作物中的25一、研究目的和意義一、研究目的和意義26

Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶，ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase）是光合碳代謝中的關(guān)鍵酶，處于光合碳還原和光合碳氧化這兩個(gè)方向相反但又相互連鎖的循環(huán)的交叉點(diǎn)上，調(diào)節(jié)著光合作用和光呼吸的代謝比例，其活性大小對(duì)光合速率起著決定性作用。本課題擬以小麥為實(shí)驗(yàn)材料，采用ELISA測(cè)試技術(shù)，研究Rubisco和Rubisco活化酶的特性，這些結(jié)果將有助于進(jìn)一步闡明Rubisco及Rubisco活化酶的作用機(jī)制，為最終提高作物的光合產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶，27二、選題依據(jù)二、選題依據(jù)28Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合作用研究的熱點(diǎn)問題，如何提高作物中這兩種酶的含量和活性也一直是個(gè)懸而未解決的難題。目前，國(guó)內(nèi)外多以煙草、菠菜作為研究Rubisco和Rubisco活化酶的材料，涉及小麥和水稻等作物方面的內(nèi)容較少，尤其有關(guān)小麥Rubisco活化酶的研究仍然是國(guó)內(nèi)外研究中的空白。Rubisco和Rubisco活化酶的特性一直是光合29創(chuàng)新之處本實(shí)驗(yàn)利用免疫化學(xué)技術(shù)提供一個(gè)快速、準(zhǔn)確而簡(jiǎn)易的定量測(cè)定Rubisco和Rubisco活化酶的方法，從而可以預(yù)測(cè)光合潛力和估計(jì)由于礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、水分供給、光照、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素和基因調(diào)控發(fā)生變化而引起光合作用和產(chǎn)量的變化。進(jìn)一步對(duì)Rubisco和Rubisco活化酶做深入的研究。創(chuàng)新之處本實(shí)驗(yàn)利用免疫化學(xué)技術(shù)提供一個(gè)快速、準(zhǔn)確30三、研究?jī)?nèi)容三、研究?jī)?nèi)容31Rubisco和Rubisco活化酶的提取和純化Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備Rubisco和Rubisco活化酶ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定C3、C4植物中Rubisco和Rubisco活化酶含量比較及其與光合作用的關(guān)系光暗處理對(duì)小麥光合作用及Rubisco、Rubisco活化酶的影響施氮處理對(duì)小麥光合速率和Rubisco、Rubisco活化酶的影響Rubisco和Rubisco活化酶單克隆抗體制備初探Rubisco和Rubisco活化酶的提取和純化32試驗(yàn)設(shè)計(jì)流程Rubisco和Rubisco活化酶的分離提純Rubisco和Rubisco活化酶抗體的制備抗體的分離與純化利用抗體定量測(cè)定不同處理下Rubisco及Rubisco活化酶的含量

試驗(yàn)設(shè)計(jì)流程Rubisco和Rubisco活化酶的分離提純33四、材料、儀器和方法四、材料、儀器和方法341、材料與儀器1.1材料

植物材料

揚(yáng)麥5號(hào)動(dòng)物材料新西蘭大白兔1.2試劑與儀器

高速冷凍離心機(jī)液相層析收集系統(tǒng)垂直板電泳系統(tǒng)BeckmanLS-9800液體閃爍儀酶聯(lián)免疫測(cè)定儀……1、材料與儀器1.1材料352、酶的提取和純化2、酶的提取和純化363.1免疫過程:以皮內(nèi)多位點(diǎn)分?jǐn)?shù)次注射法進(jìn)行免疫首次免疫加強(qiáng)免疫二次免疫0.5ml抗原+0.5ml佐劑,皮內(nèi)注射于兔子背部多個(gè)部位三周后，0.5ml抗原+0.5ml佐劑,皮下注射于兔子背部多個(gè)部位三周后，靜脈注射0.5ml抗原檢測(cè)效價(jià)一周后，耳緣靜脈采血，檢測(cè)抗體效價(jià)3、Rubisco及Rubisco活化酶抗體的制備3.1免疫過程:首次免疫加強(qiáng)免疫二次免疫0.5ml抗原+0373.2采血

用心臟取血的方法采血

3.3分離血清4℃下離心30min，除去紅細(xì)胞，獲得血清；或者將血液收聚在培養(yǎng)皿中，37℃放置6h，用吸管吸取析出的血清。將血清分裝于滅菌瓶，儲(chǔ)存于零下20℃，或加0.1%NaN3或0.01%硫柳汞后，儲(chǔ)存于4℃冰箱中。3.2采血

用心臟取血的方法采血3.3分離血清384、ELISA法測(cè)定酶含量4、ELISA法測(cè)定酶含量39Rubisco和Rubisco活化酶的定量測(cè)定

用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原（Rubisco和Rubisco活化酶）與制備的Rubisco和Rubisco活化酶的抗體反應(yīng)，制成一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將待測(cè)樣品與之相比較，求得樣品中抗原的含量Rubisco含量（mg·g-1FW）=[提取液（mL）+鮮葉重（g）]×稀釋倍數(shù)×由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的Rubisco濃度/葉片鮮重Rubisco和Rubisco活化酶的定量測(cè)定405、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定依Folin-酚試劑法（薛應(yīng)龍，1985）測(cè)定，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線6、光合速率和葉綠素含量的測(cè)定光合速率用便攜式光合速率測(cè)定儀測(cè)定葉綠素含量用分光光度計(jì)測(cè)定5、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定依Folin-酚試劑法（薛應(yīng)龍，19841五、實(shí)驗(yàn)進(jìn)展五、實(shí)驗(yàn)進(jìn)展421、Rubisco的提純和純度鑒定1、Rubisco的提純和純度鑒定43Rubisco的電泳圖譜A為Rubisco的ND圖譜B為Rubisco的SDS圖譜5500014800Rubisco的電泳圖譜5500014800442、小麥Rubisco活化酶的的提純和純度鑒定2、小麥Rubisco活化酶的的提純和純度鑒定45Rubisco活化酶的SDS圖譜A為Rubisco活化酶;B為標(biāo)準(zhǔn)蛋白4500041000Rubisco活化