植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)及有用物質(zhì)生產(chǎn)

植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)及有用物質(zhì)生產(chǎn)

（一）、概述（二）、植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立（三）、利用細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)植物次生代謝產(chǎn)物：植物中一大類并非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物，其產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝。（一）、概述

植物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為：

酚類化合物：黃酮類；醌類（苯醌、萘醌、蒽醌）萜類化合物：三萜皂甙；甾體皂甙；單萜、倍半萜、二萜含氮化合物：生物堿；胺類（伯、仲、叔、季胺）非蛋白氨基酸生氰甙多炔類、有機酸

植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。李時珍在《本草綱目》中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25％的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可以用于殺蟲、殺菌，而對環(huán)境和人畜無害是理想的環(huán)保產(chǎn)品。

自然植物和細胞培養(yǎng)的紫草寧含量比較生產(chǎn)方式生產(chǎn)周期紫草寧含量（％干重）完整植物2～3年1～2植物細胞培養(yǎng)3周14植物次生代謝產(chǎn)品的市場潛能產(chǎn)品成分用途年銷售額（億美元）長春花堿治療白血病18～20（美國）奎寧治療瘧疾5～10（美國）致熱素殺蟲劑20（全世界）毛地黃心臟病藥20～55（美國）

植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求：

從工程的角度講必須要進一步研究和開發(fā)適宜于植物細胞生長和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的生物反應(yīng)器，建立最佳的控制和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。從細胞生長與培養(yǎng)技術(shù)方面講必須滿足以下3個條件：1、培養(yǎng)的細胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。2、細胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。3、代謝產(chǎn)物要在細胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。（二）、植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立1、種子細胞的選擇

（1）準確選擇能產(chǎn)生目的化合物的植物種類；（2）盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織器官為外植體；

(3)高產(chǎn)種子細胞克隆的方法：單細胞培養(yǎng)后，將單細胞擴增形成的愈傷組織分2份，1份成分含量分析，另1份保留培養(yǎng)。2、種子細胞系的增殖與放大培養(yǎng)種子細胞增殖初期一般采用搖瓶培養(yǎng)，搖瓶體積從幾百毫升到幾升逐級放大。當細胞數(shù)量增加到一定值后，應(yīng)轉(zhuǎn)移至體積較小的生物反應(yīng)器培養(yǎng)。3、大規(guī)模模培養(yǎng)體系系的建立（1）成批批培養(yǎng)：在一個培養(yǎng)養(yǎng)體積中接接種細胞或添加培養(yǎng)養(yǎng)基后，中中途不添加加也不更換換培養(yǎng)基的方式式。（2）連續(xù)續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過程程中，不斷斷向反應(yīng)器中以一定定流量添加加新培養(yǎng)基基，同時以以一定流量從從系統(tǒng)中取取出培養(yǎng)基基的方式。。(3)半連連續(xù)培養(yǎng)：：在完成成批批培養(yǎng)的一一個周期后，從反應(yīng)應(yīng)器中取出出大部分細細胞懸液，，只保留小部分分細胞懸液液作為下一一培養(yǎng)周期期的種子細胞，，然后加入入新鮮培養(yǎng)養(yǎng)基進行培培養(yǎng)的方式。(三)生物物反應(yīng)器類類型及特點點大規(guī)模培養(yǎng)養(yǎng)系統(tǒng)基本本原理方法法與上述實實驗室懸浮浮培養(yǎng)一致致，但大規(guī)規(guī)模培養(yǎng)所所采用的設(shè)設(shè)備及控制制技術(shù)比實實驗室小規(guī)規(guī)模培養(yǎng)要要復(fù)雜的多多。植物細胞培培養(yǎng)具有周周期長、細細胞抗剪切切能力弱、、易團聚等等特點。同同時，植物物細胞規(guī)模模培養(yǎng)的目目的是生產(chǎn)產(chǎn)天然產(chǎn)物物，所以，，植物細胞胞培養(yǎng)反應(yīng)應(yīng)器的設(shè)計計不僅要考考慮有利于于細胞生長長，還要考考慮有利于于產(chǎn)物的積積累和分離離?？傮w上，適適合植物細細胞培養(yǎng)的的反應(yīng)器應(yīng)應(yīng)具有適宜宜的氧傳遞遞、良好的的流動性和和較低的剪剪切力。機械攪拌式式培養(yǎng)系統(tǒng)統(tǒng)機械攪拌式式生物反應(yīng)應(yīng)器通常是是在微生物物發(fā)酵罐的的基礎(chǔ)上改改進設(shè)計的的，根據(jù)植植物細胞的的特性，其其設(shè)備要求求在微生物物發(fā)酵罐的的基礎(chǔ)上作作如下改進進：攪拌裝裝置要減少少剪切，一一般改葉輪輪式為螺旋旋式；因為為植物細胞胞生長周期期長，需要要隨時補充充水分和營營養(yǎng)，因此此必須設(shè)計計加液裝置置；由于植植物細胞的的生理活動動需要新鮮鮮空氣，且且細胞代謝謝也可能產(chǎn)產(chǎn)生有害氣氣體，所以以必須設(shè)計計通氣裝置置；為便便于取樣觀觀察，一般般還設(shè)計有有取樣口。。生物反應(yīng)器器StirredTankBioreactorsAnexternalmotorisusedtoagitatethegrowthmediumwithimpellers.Sterileairorcombinationsofgasescanbeintroduced(sparkling)氣壓攪拌式式培養(yǎng)系統(tǒng)統(tǒng)考慮到機械械攪拌式反反應(yīng)器的剪剪切作用難難以避免，，同時攪拌拌器轉(zhuǎn)動的的中軸往往往是容易使使培養(yǎng)物污污染的部位位，因此，，發(fā)展出空空氣提升式式生物反應(yīng)應(yīng)器，但其其缺點是攪攪拌不均勻勻。BubbleColumnBioreactor(AirliftReactor)IntroductionofsterileairorpuregasesisusedbothforagitationandoxygenationInternalLoopAirliftBioreactorTubeplacedinsidethereactorcreatesinternalcirculationloopExternalLoopAirliftBioreactorCirculationthroughanexternalloop旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)養(yǎng)系統(tǒng)一般用于產(chǎn)產(chǎn)品中試或或某些必需需裂解細胞胞才能獲得得目的產(chǎn)物物的培養(yǎng)，，其優(yōu)點是是控制精確確，處理靈靈活，缺點點是培養(yǎng)體體積較小。。②固定化培養(yǎng)養(yǎng)系統(tǒng)這一技術(shù)的的優(yōu)點在于于：可以較容易易地控制培培養(yǎng)系統(tǒng)的的理化環(huán)境境，從而可可以研究特特定的代謝謝途徑，并并便于調(diào)節(jié)節(jié)；細胞位置的的固定使其其所處的環(huán)環(huán)境類似于于在植物體體中所處的的狀態(tài)，相相互間接觸觸密切，可可以形成一一定的理化化梯度，有有利于次生生產(chǎn)物的合合成；由于細胞固固定在支持持物上，培培養(yǎng)基可以以不斷更換換，可以從從培養(yǎng)基中中提取產(chǎn)物物，免除了了培養(yǎng)基中中因含有過過多的初生生產(chǎn)物對細細胞代謝的的反饋抑制制，也由于于細胞留在在反應(yīng)器中中，新的培培養(yǎng)基可以以再次利用用這些細胞胞生產(chǎn)初生生產(chǎn)物，從從而節(jié)省了了生產(chǎn)細胞胞所付出的的時間和費費用；正是由于細細胞固定在在一定的介介質(zhì)中，并并可以從培培養(yǎng)基中不不斷提取產(chǎn)產(chǎn)物，因此此，它可以以進行連續(xù)續(xù)生產(chǎn)。細胞固定化化培養(yǎng)技術(shù)術(shù)按照其支支持物不同同可以分為為兩大類：：包埋式固定定化培養(yǎng)系系統(tǒng)：支持持物多采用用瓊脂、瓊瓊脂糖、藻藻酸鹽、聚聚丙烯酰胺胺等；附著式固定定化培養(yǎng)系系統(tǒng)：支持持物采用尼尼龍網(wǎng)、聚聚氨酯泡沫沫、中空纖纖維等材料料。1、利用細細胞培養(yǎng)生生產(chǎn)有用物物質(zhì)的一般般程序（1）選材材應(yīng)注意以下下條件：①藥效肯定定；②對其有效效成分有充充分的了解解；③有測定有有效成分和和藥理的可可靠方法；；④市場短缺缺或價格昂昂貴；⑤取有藥效效成分的部部位，且該該部位較易形成愈傷傷組織。（四）、利用細胞培養(yǎng)生生產(chǎn)有用物物質(zhì)（2）細胞胞株系建立立將誘導(dǎo)產(chǎn)生生的愈傷組組織進行分分離，建立立懸浮細胞胞繁殖體系系（液體培培養(yǎng)）。在工廠化生生產(chǎn)中，為為了提高有有用物質(zhì)產(chǎn)產(chǎn)品的產(chǎn)量量和質(zhì)量，，對細胞培培養(yǎng)的選擇擇有兩個基基本要求：：①有用物質(zhì)的的合成積累累能力強②生長速度快快（3）大量量培養(yǎng)將選出的優(yōu)優(yōu)良細胞株株擴大繁殖殖后，可作作為細胞工工廠化培養(yǎng)養(yǎng)的生產(chǎn)““種子”，，進行大量量培養(yǎng)。（4）產(chǎn)品品提取與純純化從植物細胞胞培養(yǎng)物中中提取和純純化有的產(chǎn)產(chǎn)品。2、提高有用物物質(zhì)生產(chǎn)效效率的技術(shù)術(shù)因素①篩選高產(chǎn)產(chǎn)細胞系從實驗材料料中篩選高高產(chǎn)的細胞胞株系是提提高生產(chǎn)率率、降低生生產(chǎn)成本的的重要因素素。特異的的次生代謝謝產(chǎn)物往往往是特異的的器官中形形成的。因因此，用特特異器官為為材料，建建立特異功功能的細胞胞系，并從從中反復(fù)多多代培養(yǎng)選選擇有效的的、高產(chǎn)的的細胞株。。篩選出的高高效、高產(chǎn)產(chǎn)細胞株系系，有的植植物細胞系系其高效、、高產(chǎn)性能能穩(wěn)定多年年，但有的的植物細胞胞系不穩(wěn)定定，因此，，還需要定定期檢測，，更新細胞胞株系。第一步：解解決生物量量生產(chǎn)（促促進細胞裂裂）；第二步：促促進次生代代謝物合成成，即在細細胞指數(shù)生生長停止期期前后才更更換培養(yǎng)基基，有利于于次生物質(zhì)質(zhì)的積累。。②、二步培培養(yǎng)法③、培養(yǎng)基基中添加前前體前體：有用用次生代謝謝物的前驅(qū)驅(qū)物。煙草愈傷組組織培養(yǎng)中中，將前體體物質(zhì)—煙煙堿酸加入入，會增加加煙堿的生生成量。④、培養(yǎng)基基中生長調(diào)調(diào)節(jié)劑的作作用植物生長調(diào)調(diào)節(jié)劑不僅僅影響植物物的脫分化化與再分化化，而且能能影響次生生代謝物質(zhì)質(zhì)的產(chǎn)生。。如煙草愈愈傷組織培培養(yǎng)中，培培養(yǎng)基中添添加IAA，能合成成煙堿，而而在含有2,4-D的培養(yǎng)基基上，煙堿堿合成受阻阻。⑤、培養(yǎng)條條件的影響響光照、溫度度等影響次次生代謝。。在胡蘿卜卜愈傷組織織培養(yǎng)中，，光照條件件使紫紅色色愈傷組織織能夠生成成大量的花花箐苷，并并且低溫條條件下，生生成量高。。⑥、采用固固相細胞培培養(yǎng)系統(tǒng)細胞生長分分裂旺盛時時，次生代代謝物產(chǎn)量量低。采用用固相培養(yǎng)養(yǎng)，將細胞胞培養(yǎng)在惰惰性基質(zhì)中中，細胞生生長緩慢，，可提高次次生代謝物物質(zhì)的產(chǎn)量量。思考題1．一個好好的懸浮細細胞系有哪哪些特征？？用于建立懸懸浮細胞系系的愈傷組組織有何要求？2．建立懸懸浮細胞系系的關(guān)鍵技技術(shù)有哪些些？3．懸浮細細胞系在繼繼代培養(yǎng)中中其群體生生長規(guī)律？4．細胞大大規(guī)模培養(yǎng)養(yǎng)有哪些培培養(yǎng)系統(tǒng)？？紫杉醇：二二萜類化合合物最早由太平平洋紅豆杉杉Taxusbrevifolia的樹樹皮皮中中分分離離廣泛泛用用于于治治療療卵卵巢巢癌癌、、乳乳腺腺癌癌、、非非小小細細胞胞肺肺癌癌等等十十幾幾種種癌癌癥癥目前前主主要要來來源源于于紅紅豆豆杉杉屬屬植植物物紫杉杉醇醇簡簡介介理化化性性質(zhì)質(zhì)英文文名名：：Paclitaxel,Taxol??orTM分子子式式：：C47H51NO4水溶溶性性：：0.7mg／／ml穩(wěn)定定性性：：pH4～～8穩(wěn)定定；；pH<4較穩(wěn)穩(wěn)定定；pH>8易分分解解；；在特特定定條條件件下下紫紫杉杉醇醇可可被被氧氧化化，，但但極極難難還還原原；；紫杉杉醇醇研研發(fā)發(fā)過過程程年代進展1958NCI開始大規(guī)模植物藥研發(fā)篩選1967發(fā)現(xiàn)紫杉醇抗癌活性1968從紅豆杉中分離出紫杉醇1971完成結(jié)構(gòu)鑒定1979發(fā)表作用機制1983臨床Ⅰ試驗1985臨床II期1991臨床III期1992

FDA批準上市NCI稱稱其其為為過過去去15年年中中開開發(fā)發(fā)的的最最好好的的抗抗癌癌藥藥物物20世世紀紀90年年代代抗抗腫腫瘤瘤藥藥的的三三大大成成就就之之一一湯姆姆森森科科技技桂桂冠冠獎獎RameshPanchagnula,InternationalJournalofPharmaceutics.1998(172)1-15.市場場需需求求抗癌癌一一線線用用藥藥銷售售額額年增增長長率率5億億美美元元理論論需需求求量量2g/人人,500萬萬人人/年年1000kg/年年實際際銷銷量量350kg/年年紫杉杉醇醇供供需需相相差差十十分分懸懸殊殊圖1：：國國際際紫紫杉杉醇醇原原料料藥藥需需求求走走勢勢圖圖（（單單位位：：公公斤斤））圖2：：國國際際紫紫杉杉醇醇銷銷售售額額（（億億美美元元））紫杉杉醇醇開開發(fā)發(fā)的的關(guān)關(guān)鍵鍵問問題題上游游產(chǎn)產(chǎn)業(yè)業(yè)————藥藥源源問問題題下游游制制劑劑產(chǎn)產(chǎn)業(yè)業(yè)藥效效（（活活性性、、水水溶溶性性））安全全性性生物物相相容容性性藥源源問問題題紅豆豆杉杉主要要原原料料植植物物國家家一一級級保保護護野野生生植植物物，，全全球球十十大大瀕瀕危危物物種種之之一一生長長緩緩慢慢分分布布有有限限Taxol含含量量低低樹皮皮中中Taxol含含量量:0.00001-0.069%3000棵棵樹樹=10噸噸樹樹皮皮=1kgTaxol=500病病人人人工工栽栽培培采用用種種子子繁繁殖殖、、扦扦插插等等無無性性繁繁殖殖方方法法快快速速、、大大面面積積人人工工繁繁育育紅紅豆豆杉杉幼幼苗苗尋找找紅紅豆豆衫衫的的替替代代物物從紅紅豆豆杉杉非非樹樹皮皮部部位位提提取取產(chǎn)紫紫杉杉醇醇的的非非紅紅豆豆杉杉植植物物優(yōu)點點：：生生長長周周期期縮縮短短簡便便、、直直接接缺點點：：1、、紫紫杉杉醇醇含含量量低低生長長緩緩慢慢2、、提提取取工工藝藝復(fù)復(fù)雜雜藥源源問問題題解解決決辦辦法法（（一一））藥源源問問題題解解決決辦辦法法（（二二））化學(xué)學(xué)合合成成全合合成成1994年年獲獲得得成成功功現(xiàn)有有六六種種途途徑徑半合成以10-DABⅢ和BaccatinⅢⅢ作為半半合成原原料獲得得紫杉醇醇新方法用用10-DAT缺點：1、合成成過程煩煩瑣復(fù)雜雜，幾十十步2、費用用高，化化學(xué)試劑劑昂貴3、總收收率太低低（2%）優(yōu)點：1、原料料枝葉含含量豐富富、提提取相對容易，，充分利利用再生生資源2、產(chǎn)率率高3、最具具實用價價值可以以工業(yè)化化生產(chǎn)4、獲取取紫杉醇醇構(gòu)效關(guān)關(guān)系信息息，進行行結(jié)構(gòu)改改造缺點：合合成過程程相對復(fù)復(fù)雜（11步步化學(xué)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化和7步分離離）藥源問題題解決辦辦法（三三）生物方法法組織和細細胞培養(yǎng)養(yǎng)微生物發(fā)發(fā)酵生物合成成研究階段段紅豆杉生生物合成成途徑基基本明確確10種相相關(guān)酶基基因被克克隆表達達利用基因因工程手手段改造造紅豆杉杉提高紫紫杉醇產(chǎn)產(chǎn)量優(yōu)點：1、擺脫脫自然因因素，可可長期穩(wěn)穩(wěn)定生長2、適應(yīng)應(yīng)市場、、方便調(diào)調(diào)節(jié)3、成分分簡單，，有利于于分離純純化4、成本本低、生生長周期期短5、為半半合成提提供原料料6、有望望工業(yè)化化生產(chǎn)缺點：1、產(chǎn)量量低、不不穩(wěn)定2、工業(yè)業(yè)化放大大研究紫杉醇水水溶性很很差0.77mM/L使用增溶溶劑：聚聚氧乙乙烯蓖麻麻油和無無水乙醇醇存在問題題穩(wěn)定性和和水溶性性較差（（7mm/L））過敏反應(yīng)應(yīng)產(chǎn)生沉淀淀缺點：1、產(chǎn)量量低、不不穩(wěn)定2、工業(yè)業(yè)化放大大研究藥效問題題一、植物物來源藥藥物的特特點全世界有有40%的藥物物來源于于植物。。我國是是中草藥藥資源最最豐富的的國家，，有詳細細記載的的近5000種種。中草草藥治療療疾病的的歷史上上千年，，中醫(yī)藥藥已形成成完整的的科學(xué)體體系。對對于植物物藥效成成分的研研究已形形成“天天然藥物物化學(xué)””研究的的新領(lǐng)域域。藥用植物物中具有有藥物功功能的物物質(zhì)種類類繁多，，結(jié)構(gòu)復(fù)復(fù)雜。除除小分子子的天然然有機化化合物以以外，還還有多種種生物大大分子活活性物質(zhì)質(zhì)。對不同組組方的藥藥用成分分和功能能的研究究是一項項巨大的的工程，，相當于于基因組組和蛋白白質(zhì)組工工程。中中藥復(fù)方方復(fù)雜系系統(tǒng)研究究（北京京大學(xué)韓韓啟德院院士）二、植物物來源藥藥物的種種類1、天然然有機化化合物（1）糖糖和糖苷苷類（2）苯苯丙素類類：苯丙丙烯、苯苯丙酸、、香豆素素等（3）醌醌類：輔輔酶Q10、紫紫草素（4））黃酮酮類：：黃酮酮醇、、花色色素（5））鞣質(zhì)質(zhì)：奎奎寧酸酸、槲槲皮醇醇。（6））萜類類：青青蒿素素、齊齊墩果果酸（7））甾體體：：烏沙沙苷元元、毛毛第黃黃毒苷苷元（8））生物物堿：：咖啡啡因、、喜樹樹堿2、植植物蛋蛋白質(zhì)質(zhì)、多多肽、、酶類類生理理活性性物質(zhì)質(zhì)表表2-163、植植物糖糖類藥藥物包包括單單糖、、聚糖糖和糖糖衍生生物。。表表2-174、植植物脂脂類藥藥物（1））脂肪肪和脂脂肪酸酸類：：亞油油酸、、亞麻麻酸、、花生生四烯烯酸（2））磷脂脂類：：大豆豆磷脂脂（3））固醇醇類：：豆固固醇、、β-谷固醇醇。三、植植物來來源藥藥物的的植被被實例例1、植植物SOD2、植植酸鈣鈣鎂與與肌醇醇3、植物不不飽和脂肪肪酸四、植物藥藥物來源的的研究前景景1、植物細細胞培養(yǎng)2、植物組組織培養(yǎng)3、有效成成分的分離離、純化，，結(jié)構(gòu)和功功能測定。。3、若干有有用物質(zhì)的的生產(chǎn)①、生物堿堿許多生物堿堿已經(jīng)用作作醫(yī)學(xué)上的的藥物。如如嗎啡等生生物堿通常常從鴉片中中提取，用用作神經(jīng)麻麻醉劑，利利用罌粟種種子的愈傷傷組織培養(yǎng)養(yǎng)，可提取取嗎啡堿及及其它生物物堿。②、苷類物物質(zhì)利用人參愈愈傷組