植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)

第六章

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)

1983年，日本三井石油化學(xué)工業(yè)公司在世界上首次成功地采用紫草細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)紫草寧。1植物次生代謝產(chǎn)物概述2細(xì)胞的初代培養(yǎng)3高產(chǎn)細(xì)胞系的篩選4植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法5植物次生代謝物質(zhì)生產(chǎn)

1.1植物代謝產(chǎn)物（1）初生代謝：為維持植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育所必須的代謝。初生代謝過(guò)程中形成的各種產(chǎn)物為初生代謝產(chǎn)物。初生代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定，在體內(nèi)容易發(fā)生轉(zhuǎn)化。（2）次生代謝：建立在初生代謝基礎(chǔ)上，對(duì)于植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育非必需的代謝，其代謝產(chǎn)物為次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物是末端代謝產(chǎn)物，比較穩(wěn)定，可以在體內(nèi)積累。

類別次生代謝產(chǎn)物用途

黃酮銀杏黃酮，大豆黃酮治療心血管疾病醌紫草寧抗菌、抗炎、抗病毒、止血簡(jiǎn)單酚類香豆素香料，抗菌消炎萜類紫杉醇抗癌青蒿素抗瘧疾生物堿長(zhǎng)春新堿抗癌奎寧抗瘧疾酚類化合物長(zhǎng)春堿：＄2million/kg長(zhǎng)春新堿：＄15million/kg李時(shí)珍在《本草綱目》中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25％的法定藥品來(lái)自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。天然的次生代謝產(chǎn)物已經(jīng)超過(guò)2萬(wàn)種。次生代謝產(chǎn)物的應(yīng)用：色素、香料、藥物、添加劑、工業(yè)原料等。紫杉醇：二二萜類化合合物最早由太平平洋紅豆杉杉Taxusbrevifolia的樹皮中分分離廣泛用于治治療卵巢癌癌、乳腺癌癌、非小細(xì)細(xì)胞肺癌等等十幾種癌癌癥目前主要來(lái)來(lái)源于紅豆豆杉屬植物物紫杉醇簡(jiǎn)介介市場(chǎng)需求抗癌一線用用藥銷售額年增長(zhǎng)率5億美元理論需求量量2g/人人,500萬(wàn)人/年1000kg/年實(shí)際銷量350kg/年紫杉醇供需需相差十分分懸殊圖1：國(guó)際際紫杉醇原原料藥需求求走勢(shì)圖（（單位：公公斤）圖2：國(guó)際際紫杉醇銷銷售額（億億美元）藥源問題紅豆杉主要原料植植物國(guó)家一級(jí)保保護(hù)野生植植物，全球球十大瀕危危物種之一一生長(zhǎng)緩慢分分布有限限Taxol含量量低樹皮中Taxol含含量:0.00001-0.069%3000棵棵樹=10噸樹皮=1kgTaxol=500病人700歲的的紅豆杉慘慘遭剝皮人工栽培采用種子繁繁殖、扦插插等無(wú)性繁繁殖方法快快速、大面面積人工繁繁育紅豆杉杉幼苗尋找紅豆衫衫的替代物物從紅豆杉非非樹皮部位位提取產(chǎn)紫杉醇的的非紅豆杉杉植物藥源問題解解決辦法（（一）藥源問題解解決辦法（（二）化學(xué)合成全合成1994年年獲得成功功現(xiàn)有六種途途徑半合成以10-DABⅢ和和BaccatinⅢ作為為半合成原原料獲得紫紫杉醇藥源問題解解決辦法（（三）生物方法組織和細(xì)胞胞培養(yǎng)微生物發(fā)酵酵生物合成研究階段紅豆杉生物物合成途徑徑基本明確確10種相關(guān)關(guān)酶基因被被克隆表達(dá)達(dá)利用基因工工程手段改改造紅豆杉杉提高紫杉杉醇產(chǎn)量1.2獲獲得植物次次生代謝產(chǎn)產(chǎn)物的方法法從植物中提取化學(xué)合成植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物植物細(xì)胞具具有形態(tài)全能性性，化學(xué)全全能性（在離體的的條件下可可以合成整整株植物能能合成的物物質(zhì)）自然植物和和細(xì)胞培養(yǎng)養(yǎng)的紫草寧寧含量比較較生產(chǎn)方式生生產(chǎn)產(chǎn)周期紫紫草草寧含量（（％干重））完整植物2～3年年1～2植物細(xì)胞培培養(yǎng)3周周14細(xì)胞培養(yǎng)是是生產(chǎn)次生生代謝產(chǎn)物物的理想途途徑：①縮短周期期，提高生生產(chǎn)效率植物細(xì)胞培培養(yǎng)生產(chǎn)周周期為15-30d；而完整整植株生長(zhǎng)長(zhǎng)短則幾個(gè)個(gè)月，長(zhǎng)則則數(shù)年，如如木瓜8個(gè)個(gè)月，而紫紫草為5年年②易于管理理，減輕勞勞動(dòng)強(qiáng)度③培養(yǎng)在無(wú)無(wú)菌條件下下進(jìn)行，可可排除病蟲蟲害干擾④可探索新新的合成路路線，獲得得新的有用用物質(zhì)1.3植植物細(xì)胞懸懸浮培養(yǎng)：：即是將植物物細(xì)胞或小小的細(xì)胞團(tuán)團(tuán)在液體培培養(yǎng)基中進(jìn)進(jìn)行大規(guī)模模培養(yǎng)的技技術(shù)。成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足3個(gè)條件：分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30～50個(gè)細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。細(xì)胞分裂快，均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。有效成分含量高。次生產(chǎn)物的的產(chǎn)量=細(xì)細(xì)胞量*細(xì)細(xì)胞次生代代謝產(chǎn)物的的產(chǎn)率可控遺傳因素決決定植物細(xì)胞培培養(yǎng)具有周期長(zhǎng)、細(xì)細(xì)胞抗剪切切能力弱、、易聚團(tuán)等特點(diǎn)。植物細(xì)胞培培養(yǎng)反應(yīng)器器的設(shè)計(jì)不不僅要考慮慮有利于細(xì)細(xì)胞生長(zhǎng)，，還要考慮慮有利于產(chǎn)物的積累累和分離。適合植物細(xì)細(xì)胞培養(yǎng)的的反應(yīng)器應(yīng)應(yīng)具有適宜的氧傳傳遞、良好好的流動(dòng)性性和較低的的剪切力。2細(xì)胞的的初始培養(yǎng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中獲得得適宜于懸懸浮培養(yǎng)的的細(xì)胞系的的過(guò)程稱為為細(xì)胞的初初始培養(yǎng)。。2.1建立立懸浮系獲取懸浮培培養(yǎng)的細(xì)胞胞細(xì)胞的振蕩蕩培養(yǎng)酶解法愈傷組織培培養(yǎng)法使細(xì)胞團(tuán)分分散促進(jìn)氣體交交換攪拌培養(yǎng)；；旋旋轉(zhuǎn)振蕩培培養(yǎng)；旋旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)培養(yǎng)培養(yǎng)方式：：2.2建建立良好的的懸浮系的的關(guān)鍵環(huán)節(jié)節(jié)1.選擇擇適宜的外外植體雙子葉植物物：幼胚、成熟胚、、下胚軸、、葉片單子葉植物物：幼胚、成熟胚、、幼穗、花花藥等2.誘誘導(dǎo)導(dǎo)疏疏松松愈愈傷傷組組織織；；培養(yǎng)養(yǎng)基基愈傷傷組組織織的的異異質(zhì)質(zhì)性性；；繼代代培培養(yǎng)養(yǎng)3.選選擇擇適適宜宜的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基；；基本本培培養(yǎng)養(yǎng)基基+CTK/AUX+天天然然復(fù)復(fù)合合物物eg:SH+NAA3.0+BA1.0+CM/YE培養(yǎng)養(yǎng)基基的的PH李忠忠光光，，龔龔明明.2006.74.懸懸浮浮培培養(yǎng)養(yǎng)初初期期的的控控制制轉(zhuǎn)速速，，光光，，溫溫度度5.懸懸浮浮細(xì)細(xì)胞胞的的繼繼代代與與選選擇擇繼代代中中收收集集小小的的細(xì)細(xì)胞胞團(tuán)團(tuán)條件件培培養(yǎng)養(yǎng)基基：：新新鮮鮮培培養(yǎng)養(yǎng)基基3高高產(chǎn)產(chǎn)細(xì)細(xì)胞胞系系的的篩篩選選(P113)3.1高高產(chǎn)產(chǎn)細(xì)細(xì)胞胞系系篩選選的的整整體體思思路路外植植體體愈傷傷組組織織的的誘誘導(dǎo)導(dǎo)篩篩選選懸浮浮培培養(yǎng)養(yǎng)細(xì)細(xì)胞胞高產(chǎn)產(chǎn)細(xì)細(xì)胞胞系系篩篩選選高產(chǎn)產(chǎn)細(xì)細(xì)胞胞系系的的建建立立高產(chǎn)產(chǎn)細(xì)細(xì)胞胞株株系系的的特特點(diǎn)點(diǎn)培養(yǎng)養(yǎng)細(xì)細(xì)胞胞在在遺傳傳上上應(yīng)應(yīng)是是穩(wěn)穩(wěn)定定的，，以以得得到到產(chǎn)產(chǎn)量量恒恒定定的的產(chǎn)產(chǎn)物物細(xì)胞胞生生長(zhǎng)長(zhǎng)及及產(chǎn)產(chǎn)物物合合成成的的速度度快快，在在較較短短的的時(shí)時(shí)間間內(nèi)內(nèi)能能得得到到較較高高產(chǎn)產(chǎn)量量的的終終產(chǎn)產(chǎn)物物代謝謝產(chǎn)產(chǎn)物物要要在在細(xì)細(xì)胞胞中中積積累累，，而而不不被被迅迅速速分分解解，，最最好好能能將將其其釋放放到到培培養(yǎng)養(yǎng)基基中高產(chǎn)產(chǎn)細(xì)細(xì)胞胞系系的的篩篩選選過(guò)過(guò)程程⑴選選定定特特定定起起始始材材料料①準(zhǔn)準(zhǔn)確確選選擇擇能能夠夠產(chǎn)產(chǎn)生生目目的的代代謝謝產(chǎn)產(chǎn)物物的的植植物物種種類類、、品品種種或或單單株株②應(yīng)應(yīng)盡盡量量選選擇擇自自然然狀狀態(tài)態(tài)下下產(chǎn)產(chǎn)生生天天然然產(chǎn)產(chǎn)物物的的組組織織或或器器官官為為外外植植體體⑵誘誘導(dǎo)導(dǎo)愈愈傷傷組組織織，，并并獲獲得得單單細(xì)細(xì)胞胞懸懸浮浮液液⑶誘誘變變處處理理細(xì)細(xì)胞胞懸懸浮浮液液，，篩篩選選目目的的突突變變細(xì)細(xì)胞胞⑷通通過(guò)過(guò)單單細(xì)細(xì)胞胞培培養(yǎng)養(yǎng)突突變變細(xì)細(xì)胞胞，，獲獲得得突突變變細(xì)細(xì)胞胞無(wú)無(wú)性性系系（即即突突變變細(xì)細(xì)胞胞愈愈傷傷組組織織獲獲得得））高產(chǎn)產(chǎn)細(xì)細(xì)胞胞系系的的篩篩選選方方法法⑴目目測(cè)測(cè)法法注意意：：真真正正的的變變異異體體or生生理理狀狀態(tài)態(tài)不不同同的的細(xì)細(xì)胞胞克克隆隆⑵根根據(jù)據(jù)單單細(xì)細(xì)胞胞克克隆隆次次生生代代謝謝產(chǎn)產(chǎn)物物含含量量進(jìn)進(jìn)行行篩篩選選⑶抗抗性性篩篩選選如：：添添加加抗抗性性抑抑制制劑劑庚庚二二酸酸------生生物物素素⑷誘誘變變篩篩選選3.2高高產(chǎn)產(chǎn)系系的的穩(wěn)穩(wěn)定定性性及及保保存存方方法法盡量量減減少少繼繼代代次次數(shù)數(shù)，，用用礦礦物物油油包包埋埋法法，，低低溫溫保保存存法法（（0-4℃℃）），，超超低低溫溫保保存存法法（（-196℃℃））保保存存。。同時(shí)時(shí)從從高高產(chǎn)產(chǎn)系系中中不不斷斷克克隆隆形形成成新新的的高高產(chǎn)產(chǎn)細(xì)細(xì)胞胞系系。。4植物細(xì)胞胞懸浮培養(yǎng)的的方法懸浮培養(yǎng)：將游離的細(xì)細(xì)胞或者細(xì)胞胞團(tuán)按一定密密度，懸浮在在液體培養(yǎng)基基中，不斷攪攪拌或者振蕩蕩培養(yǎng)，使細(xì)細(xì)胞快速、大大量增殖。技術(shù)難點(diǎn)：通氣、剪切力力的適應(yīng)性；；細(xì)胞同步化化控制。①培養(yǎng)：培養(yǎng)養(yǎng)基：基本培培養(yǎng)基+CTK/AUX培養(yǎng)條件：溫溫度、氧氣、、PH、轉(zhuǎn)速速②同步化控制制③細(xì)胞增殖的的監(jiān)測(cè)，適時(shí)時(shí)測(cè)定細(xì)胞的的數(shù)量，掌握握放罐時(shí)機(jī)。。4.1細(xì)胞胞懸浮培養(yǎng)的的方法(P117)分批培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)法半連續(xù)培養(yǎng)法法細(xì)胞固定化培培養(yǎng)分批培養(yǎng)：把細(xì)胞分散散在一定溶積積的培養(yǎng)基中中進(jìn)行培養(yǎng)。。注：中途不添添加也不更換換培養(yǎng)基設(shè)備簡(jiǎn)單，操操作方便，重重復(fù)性好。適合與突變體體篩選和遺傳傳轉(zhuǎn)化的研究究。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞胞增殖曲線時(shí)間（d）細(xì)胞數(shù)量123451——滯后期、2——對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期3——直線生長(zhǎng)期、4——減緩期5——靜止期（1）細(xì)胞擴(kuò)擴(kuò)增生長(zhǎng)成S形曲線（2）繼代培培養(yǎng)：要求縮短滯后后期滯后期的長(zhǎng)短短：a繼代細(xì)胞胞所處的生長(zhǎng)長(zhǎng)時(shí)期；對(duì)數(shù)數(shù)期b繼代的細(xì)細(xì)胞密度104-105個(gè)/ml連續(xù)培養(yǎng)：在培養(yǎng)過(guò)程中中，不斷向反反應(yīng)器中以一定流流量添加新培培養(yǎng)基，同時(shí)時(shí)以一定流量從系系統(tǒng)中取出培培養(yǎng)基及培養(yǎng)養(yǎng)物的方式。。加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物半連續(xù)培養(yǎng)：在完成分批批培養(yǎng)的一個(gè)個(gè)周期后，從反應(yīng)器器中取出大部部分細(xì)胞懸液液，只保留小部分細(xì)細(xì)胞懸液作為為下一培養(yǎng)周周期的種子細(xì)胞，然然后加入新鮮鮮培養(yǎng)基進(jìn)行行培養(yǎng)的方式。細(xì)胞固定化培培養(yǎng)：將細(xì)胞固定定在固相基質(zhì)質(zhì)上，放入培培養(yǎng)液進(jìn)行培培養(yǎng)的方式。。懸浮培養(yǎng)反應(yīng)應(yīng)器的類型：：機(jī)械攪拌式反反應(yīng)器氣動(dòng)式反應(yīng)器器內(nèi)循環(huán)氣升式式外循環(huán)氣升式式機(jī)械攪拌式內(nèi)循環(huán)氣升式式外循環(huán)氣升式式4.2培養(yǎng)養(yǎng)基：與培養(yǎng)養(yǎng)的細(xì)胞密度度相關(guān)（1）高密度度懸浮系（>5*104個(gè)/ml）a用B5，，ER等專用用培養(yǎng)基b對(duì)傳統(tǒng)培培養(yǎng)基做出改改良如：加大2,4-D用量量；改良MS，加入VB、CH等天天然復(fù)合物（2）低密度度懸浮系（<5*104個(gè)/ml）a條件培養(yǎng)養(yǎng)基b向培養(yǎng)基基中添加多種種成分，盡可可能滿足細(xì)胞胞生長(zhǎng)的需要要細(xì)胞同步化：：同一懸浮培養(yǎng)養(yǎng)體系的大多多數(shù)細(xì)胞都同同時(shí)通過(guò)細(xì)胞胞周期的某一一特定時(shí)期。。細(xì)胞培養(yǎng)的同同步化方法：：饑餓法：限制制必需物質(zhì)的的供應(yīng)抑制法：化學(xué)學(xué)抑制，物理理抑制分級(jí)培養(yǎng)：細(xì)細(xì)胞分級(jí)儀4.3懸浮浮細(xì)胞培養(yǎng)的的同步化(P121)4.4懸浮浮細(xì)胞的生長(zhǎng)長(zhǎng)量和活力分分析(P122)（1）測(cè)定懸懸浮細(xì)胞數(shù)量量的方法：①細(xì)胞計(jì)數(shù)-血球計(jì)數(shù)板板②鮮重重、干重的測(cè)測(cè)定③細(xì)胞密實(shí)體體積(PVC)（2）細(xì)胞活活力測(cè)定①二乙酸熒光光素法（FDA）-活細(xì)胞內(nèi)有有熒光產(chǎn)生②伊凡蘭染色色法-染色受受損細(xì)胞核---死細(xì)胞胞③相差顯微鏡鏡法-胞質(zhì)環(huán)環(huán)流是否存在在5植物細(xì)胞胞大規(guī)模培養(yǎng)養(yǎng)生產(chǎn)次生代代謝物質(zhì)植物細(xì)胞大規(guī)規(guī)模培養(yǎng)的技技術(shù)要求：從工程的角度度講必須要進(jìn)進(jìn)一步研究和和開發(fā)適宜于于植物細(xì)胞生生長(zhǎng)和次生代代謝產(chǎn)物生產(chǎn)產(chǎn)的生物反應(yīng)應(yīng)器，建立最最佳的控制和和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。。從細(xì)胞生長(zhǎng)與與培養(yǎng)技術(shù)方方面講必須滿滿足以下3個(gè)個(gè)條件：1、培養(yǎng)的細(xì)細(xì)胞在遺傳上上應(yīng)是穩(wěn)定的的，以得到產(chǎn)產(chǎn)量恒定的產(chǎn)產(chǎn)物。2、細(xì)胞生長(zhǎng)長(zhǎng)及生物合成成的速度快，，在較短的時(shí)時(shí)間內(nèi)能得到到較高產(chǎn)量的的終產(chǎn)物。3、代謝產(chǎn)物物要在細(xì)胞中中積累而不被被迅速分解，，最好能將其其釋放到培養(yǎng)養(yǎng)基中。5.1技術(shù)術(shù)路線(1)選擇擇適宜的外植植體；誘導(dǎo)疏疏松愈傷組織織；(2)通過(guò)過(guò)含量分析，，選擇高產(chǎn)細(xì)細(xì)胞系(3)研究究培養(yǎng)條件（（達(dá)到高產(chǎn)、、穩(wěn)產(chǎn)）；(4)建立立懸浮細(xì)胞培培養(yǎng)、優(yōu)化培培養(yǎng)條件（達(dá)到高產(chǎn)、、穩(wěn)產(chǎn)）；(5)小試試、中試、優(yōu)優(yōu)化培養(yǎng)條件件；(6)大規(guī)規(guī)模培養(yǎng)；(7)工業(yè)業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)產(chǎn)品分離，純純化。5.2提高高次生代謝產(chǎn)產(chǎn)物產(chǎn)量的方方法（1）篩選高高產(chǎn)細(xì)胞系不同植物種類類，不同植株株及同一植株株的不同部位位，往往有不不同的代謝能能力；通過(guò)人工誘變變改良細(xì)胞系系；通過(guò)遺傳改良良篩選細(xì)胞系系。云南紅豆杉東北紅豆杉中國(guó)紅豆杉南方紅豆杉雜種紅豆杉篩選出的高效效、高產(chǎn)細(xì)胞胞株系，有的的植物細(xì)胞系系其高效、高高產(chǎn)性能穩(wěn)定定多年，但有有的植物細(xì)胞胞系不穩(wěn)定，，因此，還需需要定期檢測(cè)測(cè)，更新細(xì)胞胞株系。培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)成分一方面面要滿足植物物細(xì)胞的