PCR詳細(xì)講解-課件

PCR1ppt課件PCR1ppt課件PCR（PolymeraseChainReaction)技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱(chēng)DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。1985年由美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明，榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2ppt課件PCR（PolymeraseChainReactioDNA半保留復(fù)制的機(jī)理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)。PCR的基本原理3ppt課件DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；PCR的基本原理3ppt課件PCR擴(kuò)增體系模板（Template）：基因組、質(zhì)粒DNA、cDNA，也可以是細(xì)菌、組織樣品等。引物（Primer）：確定擴(kuò)增目的序列的特異性；確定擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度。DNA聚合酶（DNAPolymerase）：推動(dòng)PCR反應(yīng)進(jìn)行的機(jī)器。擴(kuò)增效率和保真性。緩沖液（Buffer）：控制體系的pH和離子強(qiáng)度，為DNA聚合酶提供最佳工作環(huán)境。脫氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本組成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。Mg2+、K+、增強(qiáng)劑4ppt課件PCR擴(kuò)增體系模板（Template）：基因組、質(zhì)粒DNA、1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（95℃，30s）。2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（45～65℃，30s）。3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（

72℃，30～60s）。PCR的基本原理5ppt課件1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（95℃，30s）。P6ppt課件6ppt課件7ppt課件7ppt課件高溫變性8ppt課件高溫變性8ppt課件低溫退火9ppt課件低溫退火9ppt課件中溫延伸10ppt課件中溫延伸10ppt課件11ppt課件11ppt課件12ppt課件12ppt課件13ppt課件13ppt課件理論：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），如果擴(kuò)增30循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加230也就是109倍。實(shí)際：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實(shí)際上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)106～107。14ppt課件理論：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），如果擴(kuò)增30循環(huán)，目標(biāo)DNAPCR擴(kuò)增曲線1.早期（E期）:引物在單鏈DNA模板上搜索互補(bǔ)序列，并與特定位點(diǎn)雜交。2.中期（M期）：擴(kuò)增反應(yīng)順利進(jìn)行，產(chǎn)物呈指數(shù)型增長(zhǎng)。3.晚期（L期）：平臺(tái)期，DNA聚合酶過(guò)度損耗或者產(chǎn)物的抑制。15ppt課件PCR擴(kuò)增曲線1.早期（E期）:引物在單鏈DNA模板上搜索互PCR擴(kuò)增條件預(yù)變性94℃5min變性94℃30s退火45~65℃30s延伸72℃30s終延伸72℃7min循環(huán)16ppt課件PCR擴(kuò)增條件預(yù)變性94℃5min變性94℃30s退火4PCR反應(yīng)條件94℃5min94℃30s56.2℃30s72℃30s72℃7min4℃∞PC1-P20：模板：基因組DNA；產(chǎn)物：506bp舉個(gè)例子PCR體系（10μL）模板：1μL上游引物：0.2μL下游引物：0.2μLEasyTaq酶：0.1μLEasyTaqBuffer：1μLdNTP：0.8μLddH2O：6.7μL30個(gè)循環(huán)17ppt課件PCR反應(yīng)條件PC1-P20：舉個(gè)例子PCR體系（10μL1.避免PCR試劑的污染2.最適合的反應(yīng)條件3.設(shè)置對(duì)照組：①PCR空白對(duì)照：在反應(yīng)體系中剔除反應(yīng)模板。②PCR陰性對(duì)照：即反應(yīng)體系中用無(wú)關(guān)的基因片段代替目的模板。③PCR陽(yáng)性對(duì)照：即反應(yīng)體系中以已知能夠成功進(jìn)行特異性擴(kuò)增的模板。PCR的注意事項(xiàng)18ppt課件1.避免PCR試劑的污染PCR的注意事項(xiàng)18ppt課件1.為什么完全沒(méi)有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物？①試劑質(zhì)量問(wèn)題或者加樣時(shí)出錯(cuò)，導(dǎo)致反應(yīng)體系不完整。②聚合酶失活或反應(yīng)體系中有聚合酶抑制劑。③PCR儀溫度控制不精確。④模板DNA發(fā)生降解。⑤引物或反應(yīng)溫度設(shè)計(jì)不合理⑥靶片段GC含量過(guò)高或擴(kuò)增對(duì)象長(zhǎng)常見(jiàn)問(wèn)題19ppt課件1.為什么完全沒(méi)有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物？常見(jiàn)問(wèn)題19ppt課件2.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？①反應(yīng)體系被污染。②引物特異性差。③退火溫度不合適。常見(jiàn)問(wèn)題20ppt課件2.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？常見(jiàn)問(wèn)題20ppt課件3.為什么PCR產(chǎn)物很少？①聚合酶活性過(guò)低。②循環(huán)次數(shù)偏低。③模板DNA濃度過(guò)低。常見(jiàn)問(wèn)題21ppt課件3.為什么PCR產(chǎn)物很少？常見(jiàn)問(wèn)題21ppt課件4.為什么PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾？①DNA聚合酶過(guò)多或酶活性差。②dNTP和Mg2+濃度過(guò)高。③退火溫度過(guò)低，PCR循環(huán)數(shù)偏多。④模板DNA用量過(guò)大或模板DNA不純。⑤引物特異性差、引物間形成二聚體導(dǎo)致非特異擴(kuò)增。常見(jiàn)問(wèn)題22ppt課件4.為什么PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾？常見(jiàn)問(wèn)題22ppt課件普通PCR儀溫度梯度PCR儀23ppt課件普通PCR儀溫度梯度PCR儀23ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀24ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀24ppt課件引物設(shè)計(jì)25ppt課件引物設(shè)計(jì)25ppt課件為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，同時(shí)也與PCR擴(kuò)增的效率密切相關(guān)。引物設(shè)計(jì)的最重要的原則：最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)的目的26ppt課件為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板D1、引物應(yīng)具有足夠的特異性。如果需要從基因組等較復(fù)雜的模板中擴(kuò)增特定的DNA序列，則需要考慮目的DNA序列的保守性，盡量避免所選引物設(shè)計(jì)區(qū)域序列的非特異性。引物與非特異序列的同源性不超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基。

NCBIPrimerBLAST

引物設(shè)計(jì)的基本原則27ppt課件1、引物應(yīng)具有足夠的特異性。引物設(shè)計(jì)的基本原則27ppt課件2、避開(kāi)易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板序列區(qū)域。

分子內(nèi)互補(bǔ)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、分子間互補(bǔ)。

二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)增加引物與模板雜交以及PCR的困難，因此要盡可能避開(kāi)這種序列區(qū)域。

用有關(guān)軟件預(yù)測(cè)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)。

引物設(shè)計(jì)的基本原則28ppt課件2、避開(kāi)易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板序列區(qū)域。引物設(shè)計(jì)的基本原則2829ppt課件29ppt課件3、引物長(zhǎng)度一般為18-30個(gè)堿基之間。引物長(zhǎng)度與反應(yīng)的特異性和解鏈溫度成正相關(guān)。過(guò)短：擴(kuò)增特異性下降過(guò)長(zhǎng)：引物自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，以及引物二聚體。引物設(shè)計(jì)的基本原則30ppt課件3、引物長(zhǎng)度一般為18-30個(gè)堿基之間。引物設(shè)計(jì)的基本原則34、G+C含量一般為40%-60%引物的堿基組成也會(huì)對(duì)引物的解鏈溫度產(chǎn)生影響。G+C含量過(guò)低：引物解鏈溫度低，引物易于從模板上解離。G+C含量過(guò)高：引物解鏈溫度高，易與非特異性序列雜交，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶。引物設(shè)計(jì)的基本原則31ppt課件4、G+C含量一般為40%-60%引物設(shè)計(jì)的基本原則31pp5、Tm值之差應(yīng)小于1℃，最適退火溫度在55-60℃。一對(duì)引物的Tm值差過(guò)大可直接導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率下降或失敗。對(duì)于20bp左右的引物：Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）

一般情況下，PCR的最佳退火溫度比引物Tm值低5℃左右。引物設(shè)計(jì)的基本原則32ppt課件5、Tm值之差應(yīng)小于1℃，最適退火溫度在55-60℃。引物設(shè)6、引物中四種堿基最好是隨機(jī)分布的避免4個(gè)以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重復(fù)。特別是引物的3’端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G或C，否則會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)域產(chǎn)生錯(cuò)配，降低擴(kuò)增的特異性。引物設(shè)計(jì)的基本原則33ppt課件6、引物中四種堿基最好是隨機(jī)分布的引物設(shè)計(jì)的基本原則33pp7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身互補(bǔ)——發(fā)夾結(jié)構(gòu)

引物之間互補(bǔ)——二聚體

引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不應(yīng)超過(guò)3個(gè)，引物之間連續(xù)互補(bǔ)堿基不應(yīng)超過(guò)4個(gè)，尤其避免3’端的互補(bǔ)重疊。引物設(shè)計(jì)的基本原則34ppt課件7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物設(shè)計(jì)的基本原則38、引物的5’端可以修飾，3’端不可以修飾。引物的5’端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。如：加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、引入點(diǎn)突變等。

由于延伸是從3’端開(kāi)始的，所以不能進(jìn)行任何修飾。引物設(shè)計(jì)的基本原則35ppt課件8、引物的5’端可以修飾，3’端不可以修飾。引物設(shè)計(jì)的基本原9、引物的3’端不可以A結(jié)尾。引物3’端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T(mén)時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3’端最好選擇T。引物設(shè)計(jì)的基本原則36ppt課件9、引物的3’端不可以A結(jié)尾。引物設(shè)計(jì)的基本原則36ppt課10、引物3’端要避開(kāi)密碼子的第3位。如擴(kuò)增序列位于基因編碼區(qū)域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。引物設(shè)計(jì)的基本原則37ppt課件10、引物3’端要避開(kāi)密碼子的第3位。引物設(shè)計(jì)的基本原則371、避免重復(fù)堿基，尤其是G。2、引物退火溫度在58-60℃之間。

3、G+C為30-80%。

4、3’端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C。5、引物的產(chǎn)物大小一般在80-250bp之間；80-150bp最為合適（可以延長(zhǎng)至300bp）。

Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)原則38ppt課件1、避免重復(fù)堿基，尤其是G。Real-TimePCR引物設(shè)6、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。7、Real-TimePCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，以避免基因組DNA污染影響。

Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)原則39ppt課件6、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。Real-PrimerPremier5.0Oligo6Primer3（在線）Primer-BLAST（在線）引物設(shè)計(jì)常用軟件40ppt課件PrimerPremier5.0引物設(shè)計(jì)常用軟件40ppFileNewDNAsequence粘貼模板序列41ppt課件FileNewDNAsequence粘貼模板序42ppt課件42ppt課件引物搜索43ppt課件引物搜索43ppt課件引物位置產(chǎn)物大小引物長(zhǎng)度44ppt課件引物位置產(chǎn)物大小引物長(zhǎng)度44ppt課件45ppt課件45ppt課件46ppt課件46ppt課件47ppt課件47ppt課件48ppt課件48ppt課件49ppt課件49ppt課件50ppt課件50ppt課件Oligo51ppt課件Oligo51ppt課件52ppt課件52ppt課件53ppt課件53ppt課件54ppt課件54ppt課件55ppt課件55ppt課件PrimerBLAST56ppt課件PrimerBLAST56ppt課件57ppt課件57ppt課件58ppt課件58ppt課件59ppt課件59ppt課件60ppt課件60ppt課件逆轉(zhuǎn)錄PCR61ppt課件逆轉(zhuǎn)錄PCR61ppt課件由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）稱(chēng)作逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR），由依賴(lài)RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來(lái)完成。

逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理62ppt課件由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）稱(chēng)作逆轉(zhuǎn)逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理63ppt課件逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理63ppt課件逆轉(zhuǎn)錄PCR的反應(yīng)體系1、模板RNA2、逆轉(zhuǎn)錄酶3、逆轉(zhuǎn)錄引物64ppt課件逆轉(zhuǎn)錄PCR的反應(yīng)體系1、模板RNA64ppt課件65ppt課件65ppt課件66ppt課件66ppt課件67ppt課件67ppt課件變性94℃30s

93-96℃，較高的溫度變性更快更徹底，尤其是對(duì)富含G+C的靶序列而言。68ppt課件變性94℃30s93-96℃，較高的溫度變性更快更退火45~65℃30s

退火溫度與時(shí)間取決于引物的堿基組成、長(zhǎng)度和濃度。退火溫度可以通過(guò)計(jì)算推斷，通常采用溫度梯度PCR的方法進(jìn)行摸索。

45.045.546.949.051.453.856.258.660.963.164.565.0MPC1-P20退火溫度摸索69ppt課件退火45~65℃30s退火溫度與時(shí)間取決于引物的堿延伸72℃30s

延伸的溫度通常為所以DNA聚合酶的最適工作溫度，一般為72℃；延伸的時(shí)間主要取決于目的片段的大小，不同種類(lèi)的聚合酶的合成效率也不同，因此還與DNA聚合酶的種類(lèi)有關(guān)。EasyTaq：1-2kb/minTransStartTaq:1-2kb/minFastPfu:2-4kb/min70ppt課件延伸72℃30s延伸的溫度通常為所以DNA聚合酶的循環(huán)數(shù)：

在其他參數(shù)都已優(yōu)化的條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃度。一般情況下30-35個(gè)循環(huán)即可。循環(huán)數(shù)太多：會(huì)增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量和復(fù)雜性。循環(huán)數(shù)太少：PCR產(chǎn)量太低。71ppt課件循環(huán)數(shù)：71ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：

（1）隨機(jī)六聚核苷酸引物

僅長(zhǎng)6個(gè)核苷酸，每個(gè)核苷酸位點(diǎn)上隨機(jī)加入4中不同的脫氧核苷酸，因此是46中不同引物的集合體。

所有RNA分子均可以充當(dāng)模板，合成的cDNA中有96%來(lái)自rRNA。72ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：72ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：

（2）Oligo（dT）

僅由dTTP構(gòu)成，長(zhǎng)度一般為18-24個(gè)核苷酸。

識(shí)別mRNA的3’端poly（A）尾，因此僅mRNA可被逆轉(zhuǎn)錄。73ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：73ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：

（3）特異性引物

能與目標(biāo)RNA堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸引物，僅產(chǎn)生待分析基因的cDNA。74ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：74ppt課件半定量RT-PCR75ppt課件半定量RT-PCR75ppt課件基本概念半定量RT-PCR（semi-quantitatiereversetranscriptionandpolymeraseChainreaction,SqRT-PCR）是常用的一種簡(jiǎn)捷、特異的定量RNA測(cè)定方法，通過(guò)mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)定PCR產(chǎn)物的數(shù)量，可以推測(cè)樣品中特異mRNA的相對(duì)數(shù)量。定量RT-PCR（quantitatiereversetranscriptionandpolymeraseChainreaction,qRT-PCR）是在用一步法或兩步法，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。76ppt課件基本概念半定量RT-PCR（semi-quantitatie灰度值（IOD值）

用凝膠成像系統(tǒng)自帶的分析軟件分析目的條帶的平均密度值，也稱(chēng)為灰度值。是density和area的乘積。平臺(tái)效應(yīng)

PCR擴(kuò)增屬于酶促反應(yīng)，所以，DNA擴(kuò)增過(guò)程遵循酶促動(dòng)力學(xué)原理。靶DNA片段的擴(kuò)增最初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當(dāng)引物-模板/DNA/聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺(tái)效應(yīng)。管家基因

持家基因(house-keepinggenes)：又稱(chēng)管家基因，是指所有細(xì)胞中均要表達(dá)的一類(lèi)基因,其產(chǎn)物是對(duì)維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的。管家基因表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，而是在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的大多數(shù)、或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小。它的表達(dá)只受啟動(dòng)序列或啟動(dòng)子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機(jī)制調(diào)節(jié)。77ppt課件灰度值（IOD值）77ppt課件基本原理PCR擴(kuò)增反應(yīng)是酶促反應(yīng)，遵循酶促動(dòng)力學(xué)原理，開(kāi)始的循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)積累，產(chǎn)物與模板呈線性關(guān)系。半定量RT-PCR技術(shù)正是利用產(chǎn)物與模板量的這一線性關(guān)系，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)對(duì)比總RNA中目的基因的表達(dá)。78ppt課件基本原理PCR擴(kuò)增反應(yīng)是酶促反應(yīng)，遵循酶促動(dòng)力學(xué)基本流程79ppt課件基本流程79ppt課件注意的問(wèn)題RNA的提取做RT前必需測(cè)RNA濃度，常用500ng或1ug。A260/A280和A260/A230A260/A280在1.8-2.0時(shí)，認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的，當(dāng)用Tris作為緩沖液檢測(cè)吸光度時(shí)，R值可能會(huì)大于2（一般應(yīng)該是<2.2的）。當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯；當(dāng)R>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、鹽（胍鹽）等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。如果RNA樣品的260/280=1-1.5,260/230=1-1.5，那么污染原因就應(yīng)該考慮是酚殘留。如果RNA樣品的260/280>=2，260/230<1，那么污染原因就應(yīng)該考慮是胍鹽殘留。80ppt課件注意的問(wèn)題RNA的提取80ppt課件注意的問(wèn)題RNA的電泳圖譜一般的，RNA的電泳都是用變性膠進(jìn)行的，但是如果僅僅是為了檢測(cè)RNA的質(zhì)量，用普通的瓊脂糖膠就可以了。電泳的目的是在于檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，RNA的質(zhì)量是好的。注意的問(wèn)題81ppt課件注意的問(wèn)題RNA的電泳圖譜注意的問(wèn)題81ppt課件注意的問(wèn)題引物設(shè)計(jì)所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增效率和特異性要好，一般選擇在基因的cds區(qū)域設(shè)計(jì)引物，在可能的情況下將PCR引物置于基因的不同外顯子上以消除基因和mRNA的共線性。注意的問(wèn)題82ppt課件注意的問(wèn)題引物設(shè)計(jì)注意的問(wèn)題82ppt課件注意的問(wèn)題內(nèi)參的選擇為了客觀地比較不同樣本中目標(biāo)基因表達(dá)量的相對(duì)多少，消除由于反轉(zhuǎn)錄時(shí)總RNA濃度差異造成的誤差，要選擇合適的Control基因。經(jīng)常用于RT-PCR法的Control有：GAPDH、β-actin、18SrRNA、28SrRNA等83ppt課件注意的問(wèn)題內(nèi)參的選擇83ppt課件注意的問(wèn)題同管擴(kuò)增或異管擴(kuò)增的選擇同管擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)：保證擴(kuò)增效率一致。缺點(diǎn)：兩種基因相互競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)影響擴(kuò)增的進(jìn)程。分管擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)：保證每個(gè)基因的擴(kuò)增進(jìn)程優(yōu)化。缺點(diǎn)：擴(kuò)增效率不能保證一致。注意的問(wèn)題84ppt課件注意的問(wèn)題同管擴(kuò)增或異管擴(kuò)增的選擇注意的問(wèn)題84ppt課件注意的問(wèn)題PCR循環(huán)數(shù)的確定最好選線性期的開(kāi)始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內(nèi)，所以選一個(gè)這兩種的契合點(diǎn)。actin和GAPDH<28-30，否則增加模板量注意的問(wèn)題85ppt課件注意的問(wèn)題PCR循環(huán)數(shù)的確定注意的問(wèn)題85ppt課件注意的問(wèn)題其他擴(kuò)增條件固定（時(shí)間）循環(huán)數(shù)、循環(huán)時(shí)間、變性時(shí)間、退火和延伸、升降溫的速度體系固定（PCRmix）dNTPs、引物、反應(yīng)模板、DNA聚合酶PCR儀固定凝膠濃度EB濃度梳子的選擇掃膠（曝光）注意的問(wèn)題86ppt課件注意的問(wèn)題其他注意的問(wèn)題86ppt課件結(jié)果分析將要比較的兩個(gè)樣品的內(nèi)參調(diào)成一樣的亮度；根據(jù)擴(kuò)增內(nèi)參時(shí)加入的cDNA量，進(jìn)行目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增；電泳掃描后，計(jì)算灰度值，先用一個(gè)標(biāo)本的目標(biāo)和內(nèi)參進(jìn)行比較，然后用這個(gè)相對(duì)值再去和其他你所要比較的平行組進(jìn)行比較，一般每組3個(gè)樣本以上。結(jié)果分析87ppt課件結(jié)果分析將要比較的兩個(gè)樣品的內(nèi)參調(diào)成一樣的亮度；結(jié)果分析87實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)介紹(RealtimeQuantitativePCR)88ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)介紹88ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法89ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)原理常規(guī)PCR技術(shù)：

對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析90ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理定量原理介紹三個(gè)概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對(duì)起始模板定量？通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析91ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理定量原理介紹三個(gè)概念：如何對(duì)起始模板定實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-----------擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：

橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件92ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-----------擴(kuò)增曲線擴(kuò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號(hào)閾值（threshold）：

前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段

真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過(guò)域值93ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號(hào)閾實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：

PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)value94ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；

Ct值則極具重現(xiàn)性95ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線

模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量96ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan3、MolecularBeacon

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記97ppt課件非特異性熒光標(biāo)記：實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法1---------SYBRGreen法98ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法1---------SYBRGSYBRGreen法工作機(jī)理SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時(shí)，DNA雙鏈分開(kāi)，無(wú)熒光復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRGreen發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。SYBRGreen99ppt課件SYBRGreen法實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理100ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI工實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法2---------Taqman探針?lè)?01ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法2---------Taqman實(shí)驗(yàn)方法RealTimePCR嚴(yán)格上可以區(qū)分為DNA起始的RealTimePCR和RNA起始的RealTimeRT-PCR。102ppt課件實(shí)驗(yàn)方法RealTimePCR嚴(yán)格上可實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲線分析103ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理SYBRGreenI熔SYBRGreen法融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無(wú)非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)物104ppt課件SYBRGreen法CyclenumberFlourescencCk102Ck104SampleCyclenumberLogofDNAconcentrationSYBRGreen法定量原理

模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量105ppt課件CyclenumberFlourescencCk102SYBRGreen法------------引物設(shè)計(jì)106ppt課件SYBRGreen法------------引物SYBRGreen法------------PCR反應(yīng)的建立反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:SYBRGreen使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱，不易檢測(cè)Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物反應(yīng)Buffer體系的優(yōu)化反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定其他與常規(guī)PCR相同107ppt課件SYBRGreen法------------PCSYBRGreen法------------PCR反應(yīng)性的確認(rèn)108ppt課件SYBRGreen法------------PCSYBRGreen法------------PCR條件優(yōu)化109ppt課件SYBRGreen法------------PCSYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)

對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性

----適用于任何DNA

使用方便

-----不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針?lè)浅ｌ`敏便宜優(yōu)點(diǎn)

容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性但可以通過(guò)融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件對(duì)引物特異性要求較高缺點(diǎn)110ppt課件SYBRGreen法熒光定量PCR的解析方法——絕對(duì)定量確定未知樣品的C(t)值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量Sample25111ppt課件熒光定量PCR的解析方法——絕對(duì)定量確定未知樣品的C(t)熒光定量PCR的解析方法——絕對(duì)定量112ppt課件熒光定量PCR的解析方法——絕對(duì)定量112ppt課件熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量113ppt課件熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量113ppt課件熒光定量PCR的解析方法熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量114ppt課件熒光定量PCR的解析方法熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量115ppt課件熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量115ppt課件熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量對(duì)于雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，比較適合于樣本量不大，但研究的基因較多的客戶(hù)，這樣對(duì)不同基因條件優(yōu)化相對(duì)Delta-deltaCt法更為簡(jiǎn)單。116ppt課件熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量對(duì)于雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，比較適熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量117ppt課件熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量117ppt課件熒光定量PCR的解析方法ComparativeDelta-deltaCt法的特點(diǎn)1.

ComparativeDelta-deltaCt法的一大特點(diǎn)是，當(dāng)優(yōu)化的體系已經(jīng)建立后，在每次實(shí)驗(yàn)中無(wú)需再對(duì)看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對(duì)待測(cè)樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可。2.

每次實(shí)驗(yàn)都默認(rèn)目的基因和看家基因的擴(kuò)增效率一致，而并非真實(shí)擴(kuò)增情況的反映，因此實(shí)驗(yàn)條件需要嚴(yán)格優(yōu)化，并且總會(huì)存一定的偏差。用ComparativeDelta-deltaCt法展開(kāi)定量實(shí)驗(yàn)前，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，必需對(duì)目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。Rotor-Gene的軟件會(huì)自動(dòng)給出兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的R值、擴(kuò)增效率等信息，如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即M值的差小于0.1，表明兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率已非常接近，那么后續(xù)實(shí)驗(yàn)中就可以用ComparativeDelta-deltaCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就無(wú)法用該方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。此時(shí)的解決方法有兩種，一是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，使兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對(duì)定量方法。熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量118ppt課件熒光定量PCR的解析方法ComparativeDelta-熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量119ppt課件熒光定量PCR的解析方法——相對(duì)定量119ppt課件2-ΔCt法120ppt課件2-ΔCt法120ppt課件謝謝！121ppt課件謝謝！121ppt課件PCR122ppt課件PCR1ppt課件PCR（PolymeraseChainReaction)技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱(chēng)DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。1985年由美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明，榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。123ppt課件PCR（PolymeraseChainReactioDNA半保留復(fù)制的機(jī)理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)。PCR的基本原理124ppt課件DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；PCR的基本原理3ppt課件PCR擴(kuò)增體系模板（Template）：基因組、質(zhì)粒DNA、cDNA，也可以是細(xì)菌、組織樣品等。引物（Primer）：確定擴(kuò)增目的序列的特異性；確定擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度。DNA聚合酶（DNAPolymerase）：推動(dòng)PCR反應(yīng)進(jìn)行的機(jī)器。擴(kuò)增效率和保真性。緩沖液（Buffer）：控制體系的pH和離子強(qiáng)度，為DNA聚合酶提供最佳工作環(huán)境。脫氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本組成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。Mg2+、K+、增強(qiáng)劑125ppt課件PCR擴(kuò)增體系模板（Template）：基因組、質(zhì)粒DNA、1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（95℃，30s）。2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（45～65℃，30s）。3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（

72℃，30～60s）。PCR的基本原理126ppt課件1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（95℃，30s）。P127ppt課件6ppt課件128ppt課件7ppt課件高溫變性129ppt課件高溫變性8ppt課件低溫退火130ppt課件低溫退火9ppt課件中溫延伸131ppt課件中溫延伸10ppt課件132ppt課件11ppt課件133ppt課件12ppt課件134ppt課件13ppt課件理論：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），如果擴(kuò)增30循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加230也就是109倍。實(shí)際：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實(shí)際上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)106～107。135ppt課件理論：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），如果擴(kuò)增30循環(huán)，目標(biāo)DNAPCR擴(kuò)增曲線1.早期（E期）:引物在單鏈DNA模板上搜索互補(bǔ)序列，并與特定位點(diǎn)雜交。2.中期（M期）：擴(kuò)增反應(yīng)順利進(jìn)行，產(chǎn)物呈指數(shù)型增長(zhǎng)。3.晚期（L期）：平臺(tái)期，DNA聚合酶過(guò)度損耗或者產(chǎn)物的抑制。136ppt課件PCR擴(kuò)增曲線1.早期（E期）:引物在單鏈DNA模板上搜索互PCR擴(kuò)增條件預(yù)變性94℃5min變性94℃30s退火45~65℃30s延伸72℃30s終延伸72℃7min循環(huán)137ppt課件PCR擴(kuò)增條件預(yù)變性94℃5min變性94℃30s退火4PCR反應(yīng)條件94℃5min94℃30s56.2℃30s72℃30s72℃7min4℃∞PC1-P20：模板：基因組DNA；產(chǎn)物：506bp舉個(gè)例子PCR體系（10μL）模板：1μL上游引物：0.2μL下游引物：0.2μLEasyTaq酶：0.1μLEasyTaqBuffer：1μLdNTP：0.8μLddH2O：6.7μL30個(gè)循環(huán)138ppt課件PCR反應(yīng)條件PC1-P20：舉個(gè)例子PCR體系（10μL1.避免PCR試劑的污染2.最適合的反應(yīng)條件3.設(shè)置對(duì)照組：①PCR空白對(duì)照：在反應(yīng)體系中剔除反應(yīng)模板。②PCR陰性對(duì)照：即反應(yīng)體系中用無(wú)關(guān)的基因片段代替目的模板。③PCR陽(yáng)性對(duì)照：即反應(yīng)體系中以已知能夠成功進(jìn)行特異性擴(kuò)增的模板。PCR的注意事項(xiàng)139ppt課件1.避免PCR試劑的污染PCR的注意事項(xiàng)18ppt課件1.為什么完全沒(méi)有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物？①試劑質(zhì)量問(wèn)題或者加樣時(shí)出錯(cuò)，導(dǎo)致反應(yīng)體系不完整。②聚合酶失活或反應(yīng)體系中有聚合酶抑制劑。③PCR儀溫度控制不精確。④模板DNA發(fā)生降解。⑤引物或反應(yīng)溫度設(shè)計(jì)不合理⑥靶片段GC含量過(guò)高或擴(kuò)增對(duì)象長(zhǎng)常見(jiàn)問(wèn)題140ppt課件1.為什么完全沒(méi)有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物？常見(jiàn)問(wèn)題19ppt課件2.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？①反應(yīng)體系被污染。②引物特異性差。③退火溫度不合適。常見(jiàn)問(wèn)題141ppt課件2.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？常見(jiàn)問(wèn)題20ppt課件3.為什么PCR產(chǎn)物很少？①聚合酶活性過(guò)低。②循環(huán)次數(shù)偏低。③模板DNA濃度過(guò)低。常見(jiàn)問(wèn)題142ppt課件3.為什么PCR產(chǎn)物很少？常見(jiàn)問(wèn)題21ppt課件4.為什么PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾？①DNA聚合酶過(guò)多或酶活性差。②dNTP和Mg2+濃度過(guò)高。③退火溫度過(guò)低，PCR循環(huán)數(shù)偏多。④模板DNA用量過(guò)大或模板DNA不純。⑤引物特異性差、引物間形成二聚體導(dǎo)致非特異擴(kuò)增。常見(jiàn)問(wèn)題143ppt課件4.為什么PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾？常見(jiàn)問(wèn)題22ppt課件普通PCR儀溫度梯度PCR儀144ppt課件普通PCR儀溫度梯度PCR儀23ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀145ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀24ppt課件引物設(shè)計(jì)146ppt課件引物設(shè)計(jì)25ppt課件為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，同時(shí)也與PCR擴(kuò)增的效率密切相關(guān)。引物設(shè)計(jì)的最重要的原則：最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)的目的147ppt課件為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板D1、引物應(yīng)具有足夠的特異性。如果需要從基因組等較復(fù)雜的模板中擴(kuò)增特定的DNA序列，則需要考慮目的DNA序列的保守性，盡量避免所選引物設(shè)計(jì)區(qū)域序列的非特異性。引物與非特異序列的同源性不超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基。

NCBIPrimerBLAST

引物設(shè)計(jì)的基本原則148ppt課件1、引物應(yīng)具有足夠的特異性。引物設(shè)計(jì)的基本原則27ppt課件2、避開(kāi)易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板序列區(qū)域。

分子內(nèi)互補(bǔ)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、分子間互補(bǔ)。

二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)增加引物與模板雜交以及PCR的困難，因此要盡可能避開(kāi)這種序列區(qū)域。

用有關(guān)軟件預(yù)測(cè)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)。

引物設(shè)計(jì)的基本原則149ppt課件2、避開(kāi)易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板序列區(qū)域。引物設(shè)計(jì)的基本原則28150ppt課件29ppt課件3、引物長(zhǎng)度一般為18-30個(gè)堿基之間。引物長(zhǎng)度與反應(yīng)的特異性和解鏈溫度成正相關(guān)。過(guò)短：擴(kuò)增特異性下降過(guò)長(zhǎng)：引物自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，以及引物二聚體。引物設(shè)計(jì)的基本原則151ppt課件3、引物長(zhǎng)度一般為18-30個(gè)堿基之間。引物設(shè)計(jì)的基本原則34、G+C含量一般為40%-60%引物的堿基組成也會(huì)對(duì)引物的解鏈溫度產(chǎn)生影響。G+C含量過(guò)低：引物解鏈溫度低，引物易于從模板上解離。G+C含量過(guò)高：引物解鏈溫度高，易與非特異性序列雜交，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶。引物設(shè)計(jì)的基本原則152ppt課件4、G+C含量一般為40%-60%引物設(shè)計(jì)的基本原則31pp5、Tm值之差應(yīng)小于1℃，最適退火溫度在55-60℃。一對(duì)引物的Tm值差過(guò)大可直接導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率下降或失敗。對(duì)于20bp左右的引物：Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）

一般情況下，PCR的最佳退火溫度比引物Tm值低5℃左右。引物設(shè)計(jì)的基本原則153ppt課件5、Tm值之差應(yīng)小于1℃，最適退火溫度在55-60℃。引物設(shè)6、引物中四種堿基最好是隨機(jī)分布的避免4個(gè)以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重復(fù)。特別是引物的3’端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G或C，否則會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)域產(chǎn)生錯(cuò)配，降低擴(kuò)增的特異性。引物設(shè)計(jì)的基本原則154ppt課件6、引物中四種堿基最好是隨機(jī)分布的引物設(shè)計(jì)的基本原則33pp7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身互補(bǔ)——發(fā)夾結(jié)構(gòu)

引物之間互補(bǔ)——二聚體

引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不應(yīng)超過(guò)3個(gè)，引物之間連續(xù)互補(bǔ)堿基不應(yīng)超過(guò)4個(gè)，尤其避免3’端的互補(bǔ)重疊。引物設(shè)計(jì)的基本原則155ppt課件7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物設(shè)計(jì)的基本原則38、引物的5’端可以修飾，3’端不可以修飾。引物的5’端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。如：加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、引入點(diǎn)突變等。

由于延伸是從3’端開(kāi)始的，所以不能進(jìn)行任何修飾。引物設(shè)計(jì)的基本原則156ppt課件8、引物的5’端可以修飾，3’端不可以修飾。引物設(shè)計(jì)的基本原9、引物的3’端不可以A結(jié)尾。引物3’端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T(mén)時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3’端最好選擇T。引物設(shè)計(jì)的基本原則157ppt課件9、引物的3’端不可以A結(jié)尾。引物設(shè)計(jì)的基本原則36ppt課10、引物3’端要避開(kāi)密碼子的第3位。如擴(kuò)增序列位于基因編碼區(qū)域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。引物設(shè)計(jì)的基本原則158ppt課件10、引物3’端要避開(kāi)密碼子的第3位。引物設(shè)計(jì)的基本原則371、避免重復(fù)堿基，尤其是G。2、引物退火溫度在58-60℃之間。

3、G+C為30-80%。

4、3’端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C。5、引物的產(chǎn)物大小一般在80-250bp之間；80-150bp最為合適（可以延長(zhǎng)至300bp）。

Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)原則159ppt課件1、避免重復(fù)堿基，尤其是G。Real-TimePCR引物設(shè)6、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。7、Real-TimePCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，以避免基因組DNA污染影響。

Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)原則160ppt課件6、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。Real-PrimerPremier5.0Oligo6Primer3（在線）Primer-BLAST（在線）引物設(shè)計(jì)常用軟件161ppt課件PrimerPremier5.0引物設(shè)計(jì)常用軟件40ppFileNewDNAsequence粘貼模板序列162ppt課件FileNewDNAsequence粘貼模板序163ppt課件42ppt課件引物搜索164ppt課件引物搜索43ppt課件引物位置產(chǎn)物大小引物長(zhǎng)度165ppt課件引物位置產(chǎn)物大小引物長(zhǎng)度44ppt課件166ppt課件45ppt課件167ppt課件46ppt課件168ppt課件47ppt課件169ppt課件48ppt課件170ppt課件49ppt課件171ppt課件50ppt課件Oligo172ppt課件Oligo51ppt課件173ppt課件52ppt課件174ppt課件53ppt課件175ppt課件54ppt課件176ppt課件55ppt課件PrimerBLAST177ppt課件PrimerBLAST56ppt課件178ppt課件57ppt課件179ppt課件58ppt課件180ppt課件59ppt課件181ppt課件60ppt課件逆轉(zhuǎn)錄PCR182ppt課件逆轉(zhuǎn)錄PCR61ppt課件由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）稱(chēng)作逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR），由依賴(lài)RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來(lái)完成。

逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理183ppt課件由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）稱(chēng)作逆轉(zhuǎn)逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理184ppt課件逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理63ppt課件逆轉(zhuǎn)錄PCR的反應(yīng)體系1、模板RNA2、逆轉(zhuǎn)錄酶3、逆轉(zhuǎn)錄引物185ppt課件逆轉(zhuǎn)錄PCR的反應(yīng)體系1、模板RNA64ppt課件186ppt課件65ppt課件187ppt課件66ppt課件188ppt課件67ppt課件變性94℃30s

93-96℃，較高的溫度變性更快更徹底，尤其是對(duì)富含G+C的靶序列而言。189ppt課件變性94℃30s93-96℃，較高的溫度變性更快更退火45~65℃30s

退火溫度與時(shí)間取決于引物的堿基組成、長(zhǎng)度和濃度。退火溫度可以通過(guò)計(jì)算推斷，通常采用溫度梯度PCR的方法進(jìn)行摸索。

45.045.546.949.051.453.856.258.660.963.164.565.0MPC1-P20退火溫度摸索190ppt課件退火45~65℃30s退火溫度與時(shí)間取決于引物的堿延伸72℃30s

延伸的溫度通常為所以DNA聚合酶的最適工作溫度，一般為72℃；延伸的時(shí)間主要取決于目的片段的大小，不同種類(lèi)的聚合酶的合成效率也不同，因此還與DNA聚合酶的種類(lèi)有關(guān)。EasyTaq：1-2kb/minTransStartTaq:1-2kb/minFastPfu:2-4kb/min191ppt課件延伸72℃30s延伸的溫度通常為所以DNA聚合酶的循環(huán)數(shù)：

在其他參數(shù)都已優(yōu)化的條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃度。一般情況下30-35個(gè)循環(huán)即可。循環(huán)數(shù)太多：會(huì)增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量和復(fù)雜性。循環(huán)數(shù)太少：PCR產(chǎn)量太低。192ppt課件循環(huán)數(shù)：71ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：

（1）隨機(jī)六聚核苷酸引物

僅長(zhǎng)6個(gè)核苷酸，每個(gè)核苷酸位點(diǎn)上隨機(jī)加入4中不同的脫氧核苷酸，因此是46中不同引物的集合體。

所有RNA分子均可以充當(dāng)模板，合成的cDNA中有96%來(lái)自rRNA。193ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：72ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：

（2）Oligo（dT）

僅由dTTP構(gòu)成，長(zhǎng)度一般為18-24個(gè)核苷酸。

識(shí)別mRNA的3’端poly（A）尾，因此僅mRNA可被逆轉(zhuǎn)錄。194ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：73ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：

（3）特異性引物

能與目標(biāo)RNA堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸引物，僅產(chǎn)生待分析基因的cDNA。195ppt課件逆轉(zhuǎn)錄引物：74ppt課件半定量RT-PCR196ppt課件半定量RT-PCR75ppt課件基本概念半定量RT-PCR（semi-quantitatiereversetranscriptionandpolymeraseChainreaction,SqRT-PCR）是常用的一種簡(jiǎn)捷、特異的定量RNA測(cè)定方法，通過(guò)mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并測(cè)定PCR產(chǎn)物的數(shù)量，可以推測(cè)樣品中特異mRNA的相對(duì)數(shù)量。定量RT-PCR（quantitatiereversetranscriptionandpolymeraseChainreaction,qRT-PCR）是在用一步法或兩步法，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。197ppt課件基本概念半定量RT-PCR（semi-quantitatie灰度值（IOD值）

用凝膠成像系統(tǒng)自帶的分析軟件分析目的條帶的平均密度值，也稱(chēng)為灰度值。是density和area的乘積。平臺(tái)效應(yīng)

PCR擴(kuò)增屬于酶促反應(yīng)，所以，DNA擴(kuò)增過(guò)程遵循酶促動(dòng)力學(xué)原理。靶DNA片段的擴(kuò)增最初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當(dāng)引物-模板/DNA/聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺(tái)效應(yīng)。管家基因

持家基因(house-keepinggenes)：又稱(chēng)管家基因，是指所有細(xì)胞中均要表達(dá)的一類(lèi)基因,其產(chǎn)物是對(duì)維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的。管家基因表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，而是在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的大多數(shù)、或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，或變化很小。它的表達(dá)只受啟動(dòng)序列或啟動(dòng)子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機(jī)制調(diào)節(jié)。198ppt課件灰度值（IOD值）77ppt課件基本原理PCR擴(kuò)增反應(yīng)是酶促反應(yīng)，遵循酶促動(dòng)力學(xué)原理，開(kāi)始的循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)積累，產(chǎn)物與模板呈線性關(guān)系。半定量RT-PCR技術(shù)正是利用產(chǎn)物與模板量的這一線性關(guān)系，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)對(duì)比總RNA中目的基因的表達(dá)。199ppt課件基本原理PCR擴(kuò)增反應(yīng)是酶促反應(yīng)，遵循酶促動(dòng)力學(xué)基本流程200ppt課件基本流程79ppt課件注意的問(wèn)題RNA的提取做RT前必需測(cè)RNA濃度，常用500ng或1ug。A260/A280和A260/A230A260/A280在1.8-2.0時(shí)，認(rèn)為RNA中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染是可以容忍的，當(dāng)用Tris作為緩沖液檢測(cè)吸光度時(shí)，R值可能會(huì)大于2（一般應(yīng)該是<2.2的）。當(dāng)R<1.8時(shí)，溶液中蛋白或者時(shí)其他有機(jī)物的污染比較明顯；當(dāng)R>2.2時(shí)，說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、鹽（胍鹽）等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。如果RNA樣品的260/280=1-1.5,260/230=1-1.5，那么污染原因就應(yīng)該考慮是酚殘留。如果RNA樣品的260/280>=2，260/230<1，那么污染原因就應(yīng)該考慮是胍鹽殘留。201ppt課件注意的問(wèn)題RNA的提取80ppt課件注意的問(wèn)題RNA的電泳圖譜一般的，RNA的電泳都是用變性膠進(jìn)行的，但是如果僅僅是為了檢測(cè)RNA的質(zhì)量，用普通的瓊脂糖膠就可以了。電泳的目的是在于檢測(cè)28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，RNA的質(zhì)量是好的。注意的問(wèn)題202ppt課件注意的問(wèn)題RNA的電泳圖譜注意的問(wèn)題81ppt課件注意的問(wèn)題引物設(shè)計(jì)所設(shè)計(jì)引物的擴(kuò)增效率和特異性要好，一般選擇在基因的cds區(qū)域設(shè)計(jì)引物，在可能的情況下將PCR引物置于基因的不同外顯子上以消除基因和mRNA的共線性。注意的問(wèn)題203ppt課件注意的問(wèn)題引物設(shè)計(jì)注意的問(wèn)題82ppt課件注意的問(wèn)題內(nèi)參的選擇為了客觀地比較不同樣本中目標(biāo)基因表達(dá)量的相對(duì)多少，消除由于反轉(zhuǎn)錄時(shí)總RNA濃度差異造成的誤差，要選擇合適的Control基因。經(jīng)常用于RT-PCR法的Control有：GAPDH、β-actin、18SrRNA、28SrRNA等204ppt課件注意的問(wèn)題內(nèi)參的選擇83ppt課件注意的問(wèn)題同管擴(kuò)增或異管擴(kuò)增的選擇同管擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)：保證擴(kuò)增效率一致。缺點(diǎn)：兩種基因相互競(jìng)爭(zhēng)，會(huì)影響擴(kuò)增的進(jìn)程。分管擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)：保證每個(gè)基因的擴(kuò)增進(jìn)程優(yōu)化。缺點(diǎn)：擴(kuò)增效率不能保證一致。注意的問(wèn)題205ppt課件注意的問(wèn)題同管擴(kuò)增或異管擴(kuò)增的選擇注意的問(wèn)題84ppt課件注意的問(wèn)題PCR循環(huán)數(shù)的確定最好選線性期的開(kāi)始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內(nèi)，所以選一個(gè)這兩種的契合點(diǎn)。actin和GAPDH<28-30，否則增加模板量注意的問(wèn)題206ppt課件注意的問(wèn)題PCR循環(huán)數(shù)的確定注意的問(wèn)題85ppt課件注意的問(wèn)題其他擴(kuò)增條件固定（時(shí)間）循環(huán)數(shù)、循環(huán)時(shí)間、變性時(shí)間、退火和延伸、升降溫的速度體系固定（PCRmix）dNTPs、引物、反應(yīng)模板、DNA聚合酶PCR儀固定凝膠濃度EB濃度梳子的選擇掃膠（曝光）注意的問(wèn)題207ppt課件注意的問(wèn)題其他注意的問(wèn)題86ppt課件結(jié)果分析將要比較的兩個(gè)樣品的內(nèi)參調(diào)成一樣的亮度；根據(jù)擴(kuò)增內(nèi)參時(shí)加入的cDNA量，進(jìn)行目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增；電泳掃描后，計(jì)算灰度值，先用一個(gè)標(biāo)本的目標(biāo)和內(nèi)參進(jìn)行比較，然后用這個(gè)相對(duì)值再去和其他你所要比較的平行組進(jìn)行比較，一般每組3個(gè)樣本以上。結(jié)果分析208ppt課件結(jié)果分析將要比較的兩個(gè)樣品的內(nèi)參調(diào)成一樣的亮度；結(jié)果分析87實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)介紹(RealtimeQuantitativePCR)209ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)介紹88ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法210ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)原理常規(guī)PCR技術(shù)：

對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析211ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理定量原理介紹三個(gè)概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值如何對(duì)起始模板定量？通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析212ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理定量原理介紹三個(gè)概念：如何對(duì)起始模板定實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-----------擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：

橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件213ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-----------擴(kuò)增曲線擴(kuò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號(hào)閾值（threshold）：

前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段

真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過(guò)域值214ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------熒光閾值熒光信號(hào)閾實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：

PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)value215ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；

Ct值則極具重現(xiàn)性216ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值的重現(xiàn)性橫軸實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線

模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量217ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan3、MolecularBeacon

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------DNA產(chǎn)物的熒光標(biāo)記218ppt課件非特異性熒光標(biāo)記：實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法1---------SYBRGreen法219ppt課件實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法1---------SYBRGSYBRGreen法工作機(jī)理SYBRGreen能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位SYBRGreen只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光變性時(shí)，DNA雙鏈分開(kāi)，無(wú)熒光復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA，SYBRG