黃曲霉毒素測(cè)定法-高效液相色譜法

中藥制劑分析技術(shù)黃曲霉毒素測(cè)定法——高效液相色譜法ShandongCollegeofTraditionalChineseMedicine黃曲霉毒素測(cè)定法-高效液相色譜法黃曲霉毒素主要由曲霉菌黃曲霉、寄生曲霉、集封曲霉和偽溜曲霉四種真菌產(chǎn)生，是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似二氫呋喃香豆素的衍生化合物《中國(guó)藥典》收載黃曲霉毒素檢查法有：高效液相色譜法（第一法）和高效液相色譜-質(zhì)譜法（第二法）。一、測(cè)定原理本法的基本原理為樣品經(jīng)有機(jī)溶劑提取、免疫親和柱凈化后，利用高效液相色譜分離，柱后碘衍生—熒光檢測(cè)器或柱后光化學(xué)衍生—熒光檢測(cè)器檢測(cè)進(jìn)行分析測(cè)定。黃曲霉毒素測(cè)定法——高效液相色譜法黃曲霉毒素測(cè)定法——高效液相色譜法二、儀器與用具高速勻漿器、振蕩器、高效液相色譜系統(tǒng)、柱后衍生系統(tǒng)、光化學(xué)衍生器、離心機(jī)、超純水處理系統(tǒng)、超聲波提取器、黃曲霉總量（B1、B2、G1、G2）免疫親和柱、固相萃取裝置、離心管、具塞錐形瓶、刻度濃縮瓶、移液管、容量瓶等黃曲霉總量（B1、B2、G1、G2）免疫親和柱高速勻漿器光化學(xué)衍生器黃曲霉毒素測(cè)定法——高效液相色譜法柱后衍生又稱柱后反應(yīng)(Post-columnDerivatization)，利用衍生反應(yīng)使被測(cè)物與相應(yīng)的試劑發(fā)生反應(yīng)，以改變其物理或化學(xué)性質(zhì)，使其被檢測(cè)到。例如將發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)鍵合到樣品中去，多極放大檢測(cè)靈敏度，柱后衍生系統(tǒng)開創(chuàng)了柱后衍生系統(tǒng)性能、價(jià)格及外形的新標(biāo)準(zhǔn)。柱后衍生系統(tǒng)固相萃取裝置三、操作方法1.色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（40:18:42）檢測(cè)方法：柱后衍生化：碘衍生法和光化學(xué)衍生法兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5黃曲霉毒素測(cè)定法——高效液相色譜法2.混合對(duì)照品溶液的制備精密量取黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液（黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2標(biāo)示濃度分別為1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0/μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。黃曲霉毒素測(cè)定法——高效液相色譜法3.供試品溶液的制備供試品粉末15g加氫氧化鈉3g75ml供試品甲醇溶液70%甲醇11000轉(zhuǎn)/min攪拌2min2500轉(zhuǎn)/min離心5min取上清15mL置50ml量瓶中水稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過(guò)取續(xù)濾液20ml通過(guò)免疫結(jié)合柱20ml水洗脫，3ml/min，棄洗脫液，再用適量甲醇洗脫收集洗脫液，置2ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度搖勻，即得供試品黃曲霉毒素測(cè)定法——高效液相色譜法4.測(cè)定法分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液5μl、l0μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。另精密吸取上述供試品溶液20?25μl，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2的量，計(jì)算，即得。黃曲霉毒素測(cè)定法——高效液相色譜法PHRE-15光化學(xué)衍生器衍生效果圖黃曲霉毒素測(cè)定法——高效液相色譜-質(zhì)譜法黃曲霉毒素測(cè)定法——高效液相色譜法圖1：陳皮項(xiàng)目四種黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（從左到右依次為G2，G1，B2，B1，濃度為0.75ppb，2.5ppb，0.75ppb，2.5ppb）圖2：陳皮樣品色譜圖四、注意事項(xiàng)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護(hù)措施，并不得污染環(huán)境。殘留有黃曲霉毒素的廢液或廢渣的玻璃器皿，應(yīng)置于專用貯存容器（裝有10%次氯酸鈉溶液）內(nèi)，浸泡24小時(shí)以上，再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。當(dāng)測(cè)定結(jié)果超出限度時(shí)，采用第二法進(jìn)行確認(rèn)。黃曲霉毒素測(cè)定法——高效液相色譜法1.高效液相色譜法測(cè)定黃曲霉毒素的原理是樣品經(jīng)有機(jī)溶劑提取、免疫親和柱凈化后，利用高效液相色譜分離，柱后碘衍生—熒光檢測(cè)器或柱后光化學(xué)衍生—熒光檢測(cè)器檢測(cè)進(jìn)行分析測(cè)定。2.黃曲霉毒素主要由曲霉菌黃曲霉、寄生曲霉、集封曲霉和偽溜曲霉四種真菌產(chǎn)生，是一