植物堿性焦磷酸酶(AlkalinePyrophosphatase)活性比色法

PAGEPAGE4植物堿性焦磷酸酶（AlkalinePyrophosphatase）產(chǎn)品說明書（中文版）主要用途植物堿性焦磷酸酶（AlkalinePyrophosphatase）活性比色法法定量檢測試劑是一種旨在使用無機焦磷酸，在堿性焦磷酸酶去磷酸化后，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后峰值的變化，采用比色法測定其峰值的變化，以此進(jìn)行測算單位酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、（bulb（tube（root（coleoptile）和葉片裂解懸液樣品或純化以及粗提的酶蛋白的堿性焦磷酸酶活性及其抑制劑的檢測。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。技術(shù)背景焦磷酸酶Pyrophosphatase；PPase；EC3.6.1.1，又稱為無機焦磷酸酶（inorganicpyrophosphatas，屬于磷酸酶家族，包括磷酸單酯酶（phosphomonoesteras、磷酸二酯酶（phosphodiesterase）等。通過釋放DNARNA活動。焦磷酸酶分為堿性和酸性，前者作用于合成代謝，而后者作用于分解反應(yīng)。焦磷酸酶催化無機焦磷2個磷酸根離子的反應(yīng)，為能量釋放反應(yīng)exergonicreactio4或碳3植物的葉片中，活性最高。在固碳還原和光合作用起著重要作用成為碳4植物通路的指標(biāo)?；诘孜餆o機焦磷酸，在堿性條件下，受到堿性焦磷酸酶的去磷酸化作用，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后，在分光光度儀下（660nm波長）產(chǎn)生峰值的變化，由此測定堿性焦磷酸酶的活性。產(chǎn)品內(nèi)容清理液（Reagent毫升裂解液（ReagentB） 毫升緩沖液（ReagentC） 毫升陰性液（ReagentD） 毫升反應(yīng)液（ReagentE） 微升顯色液（ReagentF） 毫升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent微升產(chǎn)品說明書 1份保存方式保存裂解液（ReagentB）和顯色液（ReagentF）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；顯色液（ReagentF）具有腐蝕性，避免直接用手接觸；有效保證3月用戶自備15毫升離心管：用于樣品處理的容器1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器DOUNCE勻漿器：用于裂解組織樣品（微型）臺式離心機：用于樣品收集培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物比色皿：用于比色的容器實驗步驟實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。一、樣品準(zhǔn)備1．準(zhǔn)備好新鮮的植物組織，并秤重以確定組織重量200毫克（選擇步驟）15毫升錐形離心管（選擇步驟）X清理液（Reagent1次移入到一個液氮凍存管即刻放進(jìn)液氮罐過夜次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：）15毫升錐形離心管X裂解液（Reagent5秒，充分混勻即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器10．在冰槽里用研磨棒勻化組織（80下111.5毫升離心管4516000g（13000RPMeppendorf5415）5001.5毫升離心管10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（建議使用Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）即刻放進(jìn)－70二、測定準(zhǔn)備準(zhǔn)備好待測樣品（例如植物裂解萃取液等，置于冰槽里（注意：）設(shè)定好分光光度儀（37℃660n，并置零51.515號管陰性液（Reagent（ReagentG）到每個離心管，混勻15號管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表管號陰性液（ReagentD）標(biāo)準(zhǔn)液（ReagentG）測定體系標(biāo)準(zhǔn)磷濃度10X微升X微摩爾/升2X微升X微升X微摩爾/升3X微升X微升X微摩爾/升4X微升X微升X微摩爾/升5X微升00三、標(biāo)準(zhǔn)曲線測定200微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到新的比色皿3020分鐘X顯色液（Reagent，混勻3710分鐘，避免光照即刻放進(jìn)分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)16四次構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾升X緩沖液（ReagentC）到新的比色皿20微升待測樣品（100微克植物裂解萃取液蛋白）3010分鐘X陰性液（Reagent，混勻X顯色液（Reagent，混勻3710分鐘，避免光照即刻放進(jìn)分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對應(yīng)磷濃度（微摩爾/升X緩沖液（ReagentC）到新的比色皿20微升待測樣品（100微克植物裂解萃取液蛋白）302分鐘X反應(yīng)液（Reagent3010分鐘X陰性液（Reagent，混勻X顯色液（Reagent，混勻3710分鐘，避免光照即刻放進(jìn)分光光度儀檢測：獲得吸光讀數(shù)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品總活性對應(yīng)磷濃度（/升）六、計算樣品活性注意事項255次（點）標(biāo)準(zhǔn)測定操作時，須戴手套1條1.00.5-1.0之間如果加樣精準(zhǔn)，樣品背景讀數(shù)可以跳過顯色液（ReagentF）具有腐蝕性，避免直接用手接觸樣品切忌使用磷酸緩沖液處理比色測定后，比色皿須清洗徹底建議使用比色皿測定9650RPM660nm600660nm的任一波長替代吸光讀數(shù)增高，表明具有酶活性100微克/20微升；如果樣本