阿維菌素的液相色譜分析

阿維菌素的液相色譜分析

1a1.阿維菌素介紹阿維菌素的產(chǎn)生菌———阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)是1975年日本北里研究所從日本靜崗縣的一個土壤樣品中別離得到的.阿維鏈霉菌自發(fā)現(xiàn)以來,以日本北里大學和北里研究所以及美國Merk公司為主的研究小組分別對它開展了深入研究,形成了一個重要的抗生素研究領(lǐng)域.與其他鏈霉菌一樣,阿維鏈霉菌不僅具有復雜的形態(tài)分化,也具有合成多種次級代謝產(chǎn)物的能力,由它產(chǎn)生的阿維菌素在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)上有著重要的商業(yè)價值.目前對阿維鏈霉菌的研究主要集中在阿維菌素的生物合成領(lǐng)域.2a2.阿維菌素結(jié)構(gòu)阿維菌素的天然發(fā)酵產(chǎn)物共有8個組分A1a,A21,A2a,A2b,B1a,B1b,B2a和B2b,它們的區(qū)別主要在于C25,C222,23和C226位所連接的基團不同。3a3儀器和試劑

高效液相色譜儀:具有紫外可變波長檢測器;(島津公司LC-10A色譜數(shù)據(jù)處理機;(CLASS-10A工作站。)色譜柱:150mm×3.9mm(id)不銹鋼柱,內(nèi)裝Nova-PakC18、5μm填充物;(Waters)過濾器:濾膜孔徑約0.45μm;微量進樣器:50μL;定量進樣管:5μL;超聲波清洗器;甲醇:色譜級;水:新蒸二次蒸餾水;乙腈:色譜級;阿維菌素標樣:阿維菌素(B1a+B1b)質(zhì)量分數(shù)≥98.0%。4a4.色譜操作條件

流動相:甲醇+乙腈+水=38+38+24,膜過濾,并進行脫氣;流量:1.0mL/min;柱溫:室溫(溫差變化應不大于2℃);檢測波長:245nm;進樣體積:5μL;保存時間:B1a15.6min,B1b11.3min。5a典型阿維菌素乳油高效液相色譜圖見圖6a5.溶液的配制

標樣溶液的制備稱取阿維菌素標樣0.05g(精確至0.0002g),置于100mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。試樣溶液的制備稱取含阿維菌素0.05g的試樣(精確0.0002g),置于100mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。7a6.測定

在上述操作條件下,待儀器穩(wěn)定后,連續(xù)注入數(shù)針標樣溶液,直至相鄰兩針阿維菌素峰面積相對變化小于1.5%后,按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。8a7.計算

試樣中阿維菌素(B1a+B1b)的質(zhì)量分數(shù)X1(%)按式(1)計算式中:A1———兩針標樣溶液,阿維菌素B1a與B1b峰面積和的平均值;A2———兩針試樣溶液,阿維菌素B1a與B1b峰面積和的平均值;m1———標樣的質(zhì)量,g;m2———試樣的質(zhì)量,g;p———標樣中阿維菌素(B1a+B1b)的質(zhì)量分數(shù),%。9a8.結(jié)果和討論

線性關(guān)系試驗在一定質(zhì)量范圍內(nèi),按照濃度遞增的順序配制數(shù)個樣,按上述操作條件進行分析。以阿維菌素標樣質(zhì)量為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線。此標準曲線通過原點。計算得回歸方程為Y=2.52×108X+4.69×103,線性相關(guān)系數(shù)。試驗證明當阿維菌素濃度在0.004g/100mL~0.2g/100mL之間(進樣體積5μL)與其相應的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。10a方法精密度試驗對阿維菌素原藥、乳油按上述操作條件進行屢次重復測定,試驗說明該定量方法具有較好的精密度。其標準偏差分別為、0.0089,變異系數(shù)分別為0.34%、1.1%。方法準確度試驗稱取數(shù)個含量的阿維菌素原藥、阿維菌素乳油試樣,分別參加一定量的阿維菌素標準品,按本方法測定其中阿維菌素總質(zhì)量并計算回收率。阿維菌素原藥、乳油的平均回收率分別為99.9%、100.4%,說明該方法具有良好的準確度。11a最正確操作條件的選擇檢測波長確實定由阿維菌素的紫外光譜圖可以看出,阿維菌素B1a和B1b的最大吸收波長均在245nm附近,由于流動相在該波長處無吸收且對B1a和B1b峰位置無干擾,故檢測波長確定為245nm。12a流動相的選擇我們首先用單純的甲醇+水作流動相,結(jié)果局部廠家的乳油產(chǎn)品中B1a和雜質(zhì)峰別離不開。因此又改用乙腈+水作為流動相,但B1a和B1b不能與雜質(zhì)完全別離。最后嘗試用乙腈+甲醇+水作流動相,改變乙腈和甲醇之間的比例,發(fā)現(xiàn)當乙腈與甲醇比例小于1時,B1a和雜質(zhì)不能完全別離。當乙腈與甲醇比例大于1時,B1b和雜質(zhì)不能完全別離,當乙腈和甲醇比例在1附近時B1a和B1b均能與雜質(zhì)完全別離,因此