熒光共振能量轉移FERT教學文稿

熒光共振能量轉移FERTFRET原理(Principle)FRET的條件發(fā)生FRET需要三個條件：1、供體分子的發(fā)射光譜和受體分子的吸收光譜必須有顯著的重迭，一般大于30％；2、供體分子和受體分子間的距離必須在1–10nm之間.D和A間的FRET效率：3、供體分子的發(fā)射態(tài)偶極矩與受體分子的吸收態(tài)偶極矩、以及它們的向量必須滿足一定的條件R0:E=50%時供體和受體分子間的距離.對于特定的供體受體對是常數(shù);R:供體和受體分子間的距離.E:FRET效率.對于R特別靈敏.舉例:假設R0=5nm,

1）R=10nm,E=1.5%2）R=5nm,E=50%3）R=6nm,E=25%

450500550600l

(nm)DEmAEx1)蛋白分子的共定位;2)蛋白分子聚合體;3)轉錄機制;4)轉換途徑;5)分子運動;6)蛋白折疊等生物學問題.FRET的應用通過FRET技術可以獲得有關兩個蛋白分子之間相互作用的空間信息。常用于解決如下問題:LaserLaserDAFRET技術應用一:檢測兩個發(fā)光分子間的重合與共定位熒光標記

利用FRET技術檢測不發(fā)光分子間相互作用的策略FRET技術應用二:檢測分子間的相互作用LaserLaserFRET技術應用三:檢測分子的折疊與構象變化FRET技術應用舉例：細胞內(nèi)鈣離子濃度的實時測量MiyawakiA,etal.,Nature1997,388:882-887(b)BFP-GFP

BFP-YFP

CFP-YFP

CFP-dsRED

GFP-dsRED在FRET實驗中經(jīng)常使用的

供體-受體熒光分子對2.綠色熒光蛋白類(GreenFluorescentProteins,GFPs)1.染料類(Dye)FITC-Rhodamine

Alexa488-Cy3

Cy3-Cy5參考閱讀文獻JonathanD.Violin,etal.,AgeneticallyencodedfluorescentreporterrevealsoscillatoryphosphorylationbyproteinkinaseC.JCellBiology,2003,161:899–909ElizabethAJetl.,FRETImaging.NatureBiotechnology,2003,21:13887-1395RajeshBS.Fluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)microscopyimagingoflivecellproteinlocalizations.JCellBiology,2003,160:629–633JinZhang,etal.,.GeneticallyencodedreportersofproteinkinaseAactivityrevealimpactofsubstratetethering.PNAS,2001,98:14997–15002MichaelG.Erickson,etal.,DsRedasaPotentialFRETPartnerwithCFPandGFP.BiophysicalJournal,2003,85:599–611AlexanderSorkin,etal.,InteractionofEGFreceptorandGrb2inlivingcellsvisualizedbyfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)microscopy.CurrentBiology2000,10:1395–1398思考題2.你認為FRET技術特別適合什么領域?舉例說明。1.為什么FRET效率對供體受體分子間的空間距離非常靈敏?3.A和B分子都不能發(fā)射熒光,要