組合策略提高普魯蘭酶在枯草芽胞桿菌中的表達(dá)

組合策略提高普魯蘭酶在枯草芽胞桿菌中的表達(dá)普魯蘭酶(EC3.2.1.41)屬于a-淀粉酶家族，是一種常在工業(yè)上使用的淀粉酶，它可以特異性的水解支鏈淀粉、糊精、普魯蘭糖等的a-1,6糖昔鍵［1］,以到達(dá)脫支的作用。依據(jù)普魯蘭酶水解糖昔鍵原理的不同和生成產(chǎn)物的差異，其主要分為I型普魯蘭酶和II型普魯蘭酶［2］。I型普魯蘭酶負(fù)責(zé)水解a-1,6糖昔鍵，產(chǎn)物是麥芽三糖和一些線(xiàn)性寡糖；II型普魯蘭酶，是一種雙功能酶，它不僅可以水解a-1,6糖昔鍵，還能夠隨機(jī)水解淀粉直鏈上的a-1,4糖昔鍵，生成還原性末端［3］。因此在糖化過(guò)程中，普魯蘭酶常與其他淀粉酶如糖化酶、a-淀粉酶、B-淀粉酶或環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)配來(lái)快速分解淀粉。此外，普魯蘭酶也被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)果葡糖漿、抗性淀粉、乙醇燃料、啤酒等其他領(lǐng)域［4］。盡管已有多種生產(chǎn)普魯蘭酶的微生物被發(fā)現(xiàn)，但野生型菌的普魯蘭酶產(chǎn)量偏低，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。隨著基因工程和酶工程的迅速開(kāi)展，普魯蘭酶最近在多種模式菌株中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，包括大腸桿菌［5］、枯草芽胞桿菌［6］、地衣芽胞桿菌［7］、短小芽胞桿菌2.2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化不同種類(lèi)的培養(yǎng)基對(duì)重組菌的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶影響較大。本研究首先使用單因素優(yōu)化，來(lái)確定培養(yǎng)基的最正確組分，發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。圖5培養(yǎng)基組分對(duì)普魯蘭酶表達(dá)的影響Fig.5Effectofmediumcomponentsontheexpressionofpullulanase氮源是微生物生長(zhǎng)所必須的基礎(chǔ)物質(zhì)［21］。本研究使用了2種無(wú)機(jī)氮源（尿素和硫酸鐵）、3種有機(jī)氮源（胰蛋白陳、玉米漿、酵母膏）來(lái)考察對(duì)于普魯蘭酶生產(chǎn)的影響。如圖5所示，以玉米漿為氮源時(shí)酶活力最高為66.3U/mL,其余依此為胰蛋白陳、蛋白陳、酵母膏、硫酸鐵、尿素?？傮w而言，有機(jī)氮源更有利于酶的表達(dá)。碳源是是蛋白中心骨架構(gòu)成的重要元素［22］。如圖5所示，以葡萄糖為碳源時(shí)酶活力最高，為61.2U/mL0金屬離子可以改變細(xì)胞膜通透性以促進(jìn)蛋白分泌［23］。本研究選擇了5種金屬離子考察對(duì)產(chǎn)酶的影響。盡管添加Ca2+時(shí)可提高18%的酶活力，但Zn2+、A13+添加后卻導(dǎo)致酶活力大幅下降，說(shuō)明金屬離子并不一定利于普魯蘭酶胞外表達(dá)，跟金屬離子價(jià)位也無(wú)明顯關(guān)系。此外，不同培養(yǎng)基可使酶活力差異到達(dá)1.7倍，進(jìn)一步了證明發(fā)酵條件對(duì)酶表達(dá)的重要性。然而，將各單因素最正確條件直接組合，會(huì)陷入局部最優(yōu)的情況，而非全局最正確的情況。2.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理,對(duì)每個(gè)組分質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化并設(shè)計(jì)了4因素3水平BBD實(shí)驗(yàn)，因素編碼情況見(jiàn)表3,通過(guò)DesignExpertV8.06設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及分析結(jié)果（表4）,模型評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表5所示。表3因素水平編碼表Codingtableoffactorsandlevels表4Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及結(jié)果DesignandresultsofBox-Behnken表5回歸模型方差分析表Varianceanalysisofexperimentalresults根據(jù)BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了酶活力與培養(yǎng)基組分間的回歸方程:酶活力=15.70+1.52A+1.71B-2.61C+101.80D+0.08AB+0.31AC-1.70AD-0.30BC-0.59BD+1.29CD-0.18A2-0.03B2+1.04C2-39.40D2。由模型顯著性檢驗(yàn)說(shuō)明，P值和失擬項(xiàng)分別為0.0013（顯著）和0.2948（不顯著），說(shuō)明擬合程度較好。此外，模型R2為0.85,說(shuō)明能解釋約85%總變異,可信度較好?；诖耍浖A(yù)測(cè)培養(yǎng)基的最正確組分為玉米漿14.8g/L,蛋白膿7.3g/L,葡萄糖17.5g/L,Ca2+1.2mmol/Lo在此條件下，發(fā)酵36h后酶活力到達(dá)129.4U/mL,相比培養(yǎng)基優(yōu)化前提高了4.4倍。與單因素優(yōu)化相比，基于模型擬合的響應(yīng)面優(yōu)化效果更為明顯；與全因子組合實(shí)驗(yàn)（43）相比，實(shí)驗(yàn)方案僅有29組，顯著減少了實(shí)驗(yàn)工作量。2.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基的5L罐培養(yǎng)在5L罐上進(jìn)行放大培養(yǎng),發(fā)酵過(guò)程如圖6所示。接種8h內(nèi)，殘?zhí)墙档?7%為14.1g/L,0D600到達(dá)12（為最大值的26%）。說(shuō)明此時(shí)為細(xì)胞生長(zhǎng)前期，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需求較少。此后,0D600迅速增加，殘?zhí)菐缀跖c0D600完全呈相反態(tài)勢(shì)，快速降低。在24h左右,0D600首次超過(guò)最大值的80%,此后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯放緩。恰好此時(shí)殘?zhí)且彩状谓档椭裂a(bǔ)料時(shí)間點(diǎn)（溶氧開(kāi)始反彈，殘?zhí)菫?.65,5）。由于B.subtilis在營(yíng)養(yǎng)貧瘠時(shí)會(huì)形成芽胞以抵御不良情況，并且芽胞形成是不可逆，對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)不利。并且芽胞也是食品保存的一大障礙和平安隱患［24］o可以通過(guò)補(bǔ)加葡萄糖來(lái)抑制芽胞的形成，但是過(guò)量的葡萄糖會(huì)導(dǎo)致葡萄糖效應(yīng)，限制菌體生長(zhǎng)和酶蛋白的合成［24］。因此本實(shí)驗(yàn)保持葡萄糖質(zhì)量濃度在10g/L左右以平衡兩者關(guān)系。如圖5所示，在補(bǔ)料后，酶活力跟細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)了2次上升的態(tài)勢(shì)。最終在發(fā)酵53h后，酶活力到達(dá)最高，為226.4U/mLo根據(jù)發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)可知，酶活力與0D600曲線(xiàn)緊密偶聯(lián)，符合P566組成型啟動(dòng)子的特征［16］（圖6、圖7）o但是酶合成和細(xì)胞生長(zhǎng)同步，在一定程度上帶來(lái)細(xì)胞代謝壓力,影響細(xì)胞最終的產(chǎn)酶能力[25]o為進(jìn)一步提高產(chǎn)酶水平，將對(duì)重組菌的發(fā)酵進(jìn)行過(guò)程控制，包括分批、分階段的溫度和補(bǔ)料控制策略等。圖6重組普魯蘭酶在5L發(fā)酵罐的發(fā)弊過(guò)程曲線(xiàn)Thefermentationprocesscurveofpullulanasein5Lfermenter圖7重組普魯蘭酶在5L罐的SDS電泳分析圖SDSanalysisoftherecombinantpullulanasein5Lfermenter3結(jié)論本文成功將來(lái)源于Baci1lusderamificans的普魯蘭酶基因在B.subtilis中異源表達(dá)。通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子替換、培養(yǎng)基組成的單因素和響應(yīng)面優(yōu)化策略，使酶活力提高至優(yōu)化前的4.4倍。最后在5L罐進(jìn)行放大培養(yǎng)，通過(guò)葡萄糖補(bǔ)料控制，在發(fā)酵53h后到達(dá)最高酶活力,是初始優(yōu)化前的7.7倍。以上說(shuō)明通過(guò)優(yōu)化基因的內(nèi)在調(diào)控元件和外在發(fā)酵環(huán)境，可以顯著增強(qiáng)B.subtilis目的蛋白的表達(dá)，為應(yīng)用枯草芽胞桿菌生產(chǎn)其他異源蛋白提供了方法學(xué)參考。［8］、畢赤酵母等［9］。但大腸桿菌和短小芽胞桿菌不是平安菌株，畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá)需要甲醇的添加，會(huì)導(dǎo)致食品平安問(wèn)題，且畢赤酵母的發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)。根據(jù)GB2760-2022《食品平安國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，食品級(jí)普魯蘭酶生產(chǎn)菌株僅為產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)、枯草芽胞桿菌(BaciHussubtilis)、嗜酸普魯蘭芽胞桿菌(Bacillusacidopullulyticus)＞地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformi)和長(zhǎng)野解普魯蘭桿菌(Pullulanibacillusnaganoensis)?？傮w來(lái)看，提高普魯蘭酶在B.subtilis中的表達(dá)對(duì)于滿(mǎn)足普魯蘭酶工業(yè)應(yīng)用需求具有非常重要的意義。B.subtilis是革蘭氏陽(yáng)性菌種的模式菌株，其作為表達(dá)宿主被廣泛使用，具有以下諸多優(yōu)點(diǎn)：(1)屬于公認(rèn)的食品級(jí)平安菌株(GRAS認(rèn)證)［10］；(2)無(wú)明顯的密碼子偏好性，表達(dá)異源蛋白時(shí)具有天然優(yōu)勢(shì)［11］;(3)分泌能力強(qiáng)，其具有Sec、Tat等4條蛋白分泌途徑以及大量鑒定的信號(hào)肽，可以有效地分泌蛋白至胞外以及簡(jiǎn)化后續(xù)純化過(guò)程［12］；(4)生長(zhǎng)速率快，培養(yǎng)、發(fā)酵周期短［11］;(5)具有透徹的研究背景和豐富的基因改造工具［13］。本研究中，將融合信號(hào)肽AprE［14］的Bacillusderamificans普魯蘭酶基因在B.subtilisWB600中表達(dá)。先后通過(guò)啟動(dòng)子類(lèi)型優(yōu)化、培養(yǎng)基組分單因素和響應(yīng)面優(yōu)化，提高了普魯蘭酶的表達(dá)水平，并在5L罐上進(jìn)行放大培養(yǎng)。1材料與方法1.1材料與試劑1.1.1菌株與質(zhì)粒菌株B.subtilisWB600-E.coliJM109為實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒pP43NMK由實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pUC57-Pul由上海生工公司合成，其含有B.subtilis內(nèi)源信號(hào)肽AprE和來(lái)源于Baci1lusderamificans的普魯蘭酶基因(GenBank：KT897705.1),并根據(jù)B.subtilis密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化。1.1.2引物本文中的引物如表1所示。表1本研究所用的引物Table1Primersusedinthisstudy1.1.3試劑PrimeSTARDNAPrimeSTARDNA聚合酶、PrimeSTARDNA聚合酶、DNALigationKit試劑盒、DNA連接酶(solutionI)、瓊脂糖,TaKaRa公司(大連)；柱回收試劑盒、膠回收試劑盒,Invitrogen；質(zhì)粒提取試劑盒、氨葦青霉素、卡娜霉素、即用型無(wú)縫克隆試劑盒、尿素、硫酸錠、胰蛋白膿、甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖，生工生物工程(上海)股份；蛋白陳、PrimeSTARDNA聚合酶、酵母粉,OXIOD公司；玉米漿，上海源葉生物科技；SDS蛋白電泳試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)蛋白，Invitrogen；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.4培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5,蛋白膿10,氯化鈉10。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加2%瓊脂粉。TB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油5,蛋白蛛12,酵母粉24,磷酸二氫鉀31,磷酸氫二鉀16.37o5L罐補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖500,玉米漿65,酵母浸膏35,CaC120.13o1.2實(shí)驗(yàn)方法普魯蘭酶基因的合成與表達(dá)載體的構(gòu)建利用引物Pul-F/RPCR擴(kuò)增普魯蘭酶基因，引物Pul-F/R-plasmid擴(kuò)增pP43NMK質(zhì)粒骨架,通過(guò)無(wú)縫克隆試劑盒，將片段融合構(gòu)建質(zhì)粒P43-Pul。質(zhì)粒的提取參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。普魯蘭酶重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.colil09感受態(tài)細(xì)胞中，在含質(zhì)量濃度100Ug/mL氨葦西林的LB固定培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以Pul-F和Clone-R為弓物，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因測(cè)序確認(rèn)。L2.3B.subtilis轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)與表達(dá)將測(cè)序正確后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到B.subtilis,并在LB固定培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將單菌落接種到含有20mLLB培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，37℃.220r/min培養(yǎng)8h活化種子液。接著取1mL種子液轉(zhuǎn)接至裝有25mLTB培養(yǎng)基的250mL搖瓶?jī)?nèi)，37℃下發(fā)酵，定時(shí)測(cè)量細(xì)胞0D600值和普魯蘭酶酶活力。以上培養(yǎng)基添加卡納霉素(50ug/mL)o啟動(dòng)子表達(dá)變體的構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子(PlytR,P223,P556和P566和P6366)[15-17],誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PxylA)[18]、自誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PsrfA)15]分別替換原有組成型啟動(dòng)子P43(啟動(dòng)子序列見(jiàn)表2)0P223、P566和P6366均為短啟動(dòng)子，將其直接設(shè)計(jì)在引物的非同源部分。所用引物對(duì)為223-F/223-R.566-F/566-R、6366-F/6366-R,PCR產(chǎn)物通過(guò)DNALigationKit連接試劑盒，環(huán)化后構(gòu)建啟動(dòng)子變體。剩余啟動(dòng)子通過(guò)引物對(duì)lytR-F/R、xylA-F/R和srfA-F/R擴(kuò)增，通過(guò)引物對(duì)lytR-plasmid-F/R、xylA-plasmid-F/R>srfA-plasmid-F/R擴(kuò)增質(zhì)粒載體，并通過(guò)一步克隆試劑盒構(gòu)建啟動(dòng)子變體。重組質(zhì)粒的提取和鑒定同上述方法。表2本研究所選用的啟動(dòng)子Table2Thepromotersselectedinthisstudy優(yōu)化培養(yǎng)基配方和產(chǎn)酶條件以TB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選用2種無(wú)機(jī)氮源（尿素、硫酸錠）、3種有機(jī)氮源（胰蛋白陳、玉米漿、酵母膏）替換原有蛋白陳；選用2種單糖碳源（葡萄糖、果糖）、2種雙糖碳源（蔗糖、麥芽糖）替代原有甘油;額外添加lmmol/L金屬離子（MgC12、ZnC12、CaC12、FeC13、A1C13）考察金屬離子的影響。1.2.6重組B.subtilis的5L罐發(fā)酵接種生長(zhǎng)在抗性平板上的單菌落至多個(gè)含有50mLLB培養(yǎng)基的300mL搖瓶中，培養(yǎng)8h以到達(dá)對(duì)數(shù)期，活化種子液。然后將種子液按照5%的體積比接種至含有2.5L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中。以50%的氨水和30%的磷酸控制pH在7.0。發(fā)酵溫度控制在37寸，攪拌轉(zhuǎn)速與溶氧偶聯(lián)，設(shè)定值為30%（攪拌轉(zhuǎn)速下限300r/min,上限900r/min）,通氣量為1.5vvmo實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)殘?zhí)侵登闆r,當(dāng)殘?zhí)?g/L時(shí)（底物耗盡，溶氧開(kāi)始反彈）進(jìn)行補(bǔ)料控制，使殘?zhí)蔷S持在10g/L左右。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和酶活力，當(dāng)酶活性數(shù)值連續(xù)2次下降時(shí)，終止發(fā)酵。1.2.7普魯蘭酶酶活力檢測(cè)和SDS分析分別取1mL的底物（1.0%普魯蘭酶溶液）和0.9mL的0.1mol/LpH4.5的醋酸緩沖液于試管中，60t水浴預(yù)熱10min左右。加入0.1mL稀釋的酶液樣品，振蕩混勻，反響10min,加入2mLDNS終止反響,沸水浴7min,冰水中冷卻。向上述反響體系中加入10mL的蒸儲(chǔ)水,混勻，在540nm下測(cè)量其吸光值［19］。蛋白樣品上樣量為5UL,與4XSDS蛋白上樣緩沖液按體積比3：1混合、煮沸，進(jìn)行SDS凝膠電泳，設(shè)置恒壓120V。2結(jié)果分析2.1重組B.subtilis的構(gòu)建普魯蘭酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為實(shí)現(xiàn)普魯蘭酶在B.subtilis中的胞外表達(dá)，根據(jù)B.subtilis密碼子偏好性合成N-端融合信號(hào)肽AprE的普魯蘭酶基因，并克隆至質(zhì)粒PUC57。再以重組質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增AprE-普魯蘭酶基因片段。結(jié)果如圖1-a所示,PCR產(chǎn)物在2000?3000bp間有明顯條帶，與目的基因的理論大小(2259bp)一致。使用引物對(duì)Pul-plasmid-F/R擴(kuò)增pP43NMK表達(dá)質(zhì)粒骨架。如圖l-b所示,PCR產(chǎn)物在7500bp處有明顯條帶，與質(zhì)粒大小吻合。以上片段通過(guò)無(wú)縫克隆試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒P43-PU1,導(dǎo)入E.coliJM109中，轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證。如圖l-c所示,PCR產(chǎn)物與目標(biāo)條帶的理論大小(2767bp)一致。轉(zhuǎn)化子測(cè)序正確后，獲得普魯蘭酶表達(dá)質(zhì)粒P43-Puloa-合成基因片段PCR擴(kuò)增；b-pP43NMK質(zhì)粒骨架擴(kuò)增；c-重組菌菌落PCRa-M-1kbMarker,l-Pul合成基因擴(kuò)增片段驗(yàn)證；b-M-15kbMarker,l-pP43NMK質(zhì)粒擴(kuò)增片段驗(yàn)證；c-轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證圖1普魯蘭酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證Fig.1Constructionandverificationofpullulanaserecombinantplasmid普魯蘭酶表達(dá)質(zhì)粒在B.subtilis中的表達(dá)將質(zhì)粒P43-Pul轉(zhuǎn)入B.SubtilisWB600并在含有卡那霉素的固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。將單菌落經(jīng)LB種子液活化后，接種至TB培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)如圖2所示，通過(guò)測(cè)量取樣，發(fā)酵36h后普魯蘭酶到達(dá)最高酶活力，為29.6U/mLo圖2普魯蘭酶在B.subtilisWB600中的發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)FermentationcurveofpullulanaseinB.subtilisWB600發(fā)酵結(jié)束后,對(duì)上清液進(jìn)行SDS,如圖3所示。根據(jù)氨基酸序列預(yù)測(cè)該酶的理論分子質(zhì)量為79kDa,在約79kDa處檢測(cè)出明顯條帶，說(shuō)明目的基因成功在B.