在干旱和高溫單一或共同脅迫下,麻風(fēng)樹抵御氧化性損傷光合變化和保護(hù)機(jī)制

在干旱和高溫單一或共同脅迫下，麻風(fēng)樹抵御氧化損傷的光合變化和保護(hù)機(jī)制

主要內(nèi)容引言材料與方法結(jié)果討論引言干旱和高溫是兩種重要的非生物脅迫，能夠影響農(nóng)作物生長和產(chǎn)量，尤其是熱帶地區(qū)。在半干旱地區(qū)和干旱地區(qū)的野外條件下這些脅迫均是同時(shí)發(fā)生。近期的研究已經(jīng)揭示了干旱和高溫共同作用下的分子和代謝應(yīng)答是特殊的，不能通過干旱或高溫的單一作用來推測。光合作用是非生物脅迫影響的主要進(jìn)程之一。高溫使光合作用受到抑制，因?yàn)橛绊懥穗娮觽鬟f，PSII的光化學(xué)效率下降，抑制了Rubisco活性。Rubisco活性下降已被證明，因?yàn)楦邷赜绊懥薘ubisco活化酶活性，并隨升溫而加劇。另一方面，干旱通過提高CO2從大氣擴(kuò)散到葉片或者從下氣孔到羧化位點(diǎn)的阻力，可能是由CO2可利用率的降低，抑制光合作用。野外條件下，高溫經(jīng)常伴隨缺水和氣孔關(guān)閉，能夠降低CO2利用率，使葉綠體中的CO2/O2比率下降。一旦植物因光合效率降低出現(xiàn)低的NADPH和ATP消耗，NADP+/NADPH也會(huì)下降，光合電子傳遞鏈會(huì)被過度還原。這種情況促進(jìn)電子流向米勒反應(yīng)產(chǎn)生的O2和超氧自由基(O2??)。此外，當(dāng)C3植物暴露于脅迫條件下時(shí)，光呼吸途徑可能增強(qiáng)，因?yàn)樗荝OS潛在的來源，特別是過氧化氫。ROS的產(chǎn)生作為植物細(xì)胞的光合和需氧代謝的天然產(chǎn)物。在低濃度時(shí)，ROS可在植物氧化還原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中當(dāng)作信號(hào)分子?？墒?，脅迫條件下植物細(xì)胞中ROS的過量產(chǎn)生，會(huì)損傷細(xì)胞組分，包括DNA，蛋白質(zhì)和膜脂。有抗氧化系統(tǒng)的植物能夠保護(hù)自身免受氧化脅迫的損傷。這些機(jī)制利用ROS清除酶，比如超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX），以及低分子量的抗氧化劑，如抗壞血酸（ASA）和谷胱甘肽。盡管近期有非生物因素相關(guān)的氧化脅迫報(bào)道，但少有研究干旱高溫共同作用的。而且，這些結(jié)果通常是片面的，與重要過程如光化學(xué)和全部光合作用無聯(lián)系。單一和共同非生物脅迫條件下，氧化代謝的調(diào)控機(jī)制仍少有了解，尤其是它與光合作用和相關(guān)進(jìn)程的關(guān)系。目前關(guān)于這個(gè)問題的知識(shí)仍舊處于初始階段和片面的。對于脅迫條件下作物繁育，發(fā)展耐受高產(chǎn)基因型非常必要。麻風(fēng)樹是生長在半干旱地區(qū)邊緣，經(jīng)常遭受干旱和高溫，在那里很多作物難以生存。麻風(fēng)樹有成為非生物脅迫共同作用下作物抗性的生理和分子機(jī)制的優(yōu)良模型的可能性。本次研究中，檢測了麻風(fēng)樹可在干旱和高溫脅迫下，有效保護(hù)植物免受氧化應(yīng)激和光化學(xué)機(jī)制損傷的假說。我們測量了麻風(fēng)樹葉片在干旱、高溫單一脅迫和共同脅迫氣體交換，葉綠素?zé)晒夂涂寡趸瘧?yīng)答。結(jié)果表明干旱明顯影響了光化學(xué)活性和氧化代謝，并被高溫脅迫強(qiáng)烈促進(jìn)。數(shù)據(jù)證明高溫干旱共同作用引起了協(xié)同和拮抗作用的復(fù)合反應(yīng)。這些生理應(yīng)答對于植物抵抗非生物脅迫的重要性被加以討論。材料與方法在溫室培養(yǎng)，選擇合適的相對平均氣溫，相對濕度，最大光輻照度及光暗周期。23天后，分組。水狀態(tài)，電解液泄漏率（EL）和葉片干物質(zhì)產(chǎn)量葉片氣體交換和葉綠素?zé)晒馊~片過氧化氫含量和脂質(zhì)過氧化抗壞血酸含量酶的提取純化及活性測定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析結(jié)果干旱，高溫，干旱+高溫處理組引起了葉片干重DW下降了35%，10%和41%，與27°水況良好組相比，但是并沒觀察到可見的脅迫癥狀。只有干旱組葉片的水勢ψW顯著下降，但是仍然與其他處理組的對照組相似(Fig.1A).。干旱脅迫的植物的相對高的葉片水勢與好的葉片水合狀態(tài)相關(guān)，因?yàn)楦叩南鄬λ亢腿~片肉質(zhì)化引起的，與對照組植物出現(xiàn)的相似(數(shù)據(jù)未顯示)。葉片電解質(zhì)滲透率，作為膜損傷的指示，在干旱、高溫、干旱+高溫條件下分別上升了15%，28%，122%(Fig.1B)，通過TBARS積累測得的脂質(zhì)過氧化分別增加了100%，50%和200%，與對照相比(Fig.1C).。這些結(jié)果表明高溫和干旱的共同作用是不利的。與對照相比，葉片的CO2同化率(PN)在所有實(shí)驗(yàn)組中明顯下降（86%，41%and89%）(Fig.2A)。相似地，氣孔導(dǎo)度(gS)和瞬時(shí)羧化作用(PN/CI)也因干旱和高溫降低。與對照組相比，gS下降了80%,47%and94%,PN/CI比率下降了84%,35%and82%在干旱，干旱+高溫，高溫實(shí)驗(yàn)組(Fig.2BandC)。干旱和高溫的共同作用對葉片氣體交換并無相互影響，不管溫度如何干旱的影響占優(yōu)勢地位。高溫對這些測量結(jié)果沒有干旱的影響明顯。光化學(xué)通過實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)額(△F/’FM’),非光化學(xué)熒光淬滅(NPQ)和表觀電子傳遞速率(ETRS’).在遭受了干旱和聯(lián)合脅迫的實(shí)驗(yàn)組中△F/’FM’和ETRS’值下降了56%and83%(Fig.3AandB).可是，與對照相比，脅迫組和無脅迫組的FV/FM都沒有顯著差異（數(shù)據(jù)未顯示），只有干旱和聯(lián)合脅迫組的qN顯著上升(Fig.3C).。高溫，干旱+高溫處理組的ETRS’/Pn比率上升了大約50%，300%在干旱處理組(Fig.3D).這些數(shù)據(jù)表明干旱和高溫在向CO2固定途徑分配PSII的過剩電子有明顯的正相互作用（協(xié)同作用）。單獨(dú)的高溫處理不會(huì)改變多數(shù)光化學(xué)參數(shù)的值(Fig.3)?？墒?，干旱引起的光合機(jī)構(gòu)的損傷被高溫增強(qiáng)（拮抗作用）?？寡趸?，比如CAT,APX,andSOD,表明了對干旱，高溫，高溫+干旱的不同形式的應(yīng)答。葉片CAT活性在高溫下38%，但是在干旱和干旱+高溫組分別強(qiáng)烈抑制了60%和36%。結(jié)果表明高溫和干旱對CAT活性的拮抗作用(Fig.4A).。與非脅迫相比，所有脅迫條件下，APX活性上升（在遭受干旱，高溫和共同脅迫條件下大約100%，100%和300%(Fig.4B)。因此，兩種脅迫因子有協(xié)同作用。高溫處理下SOD活性受激36%，可是活性不只受干旱單獨(dú)影響，在共同脅迫條件下抑制了42%。這些結(jié)果表明干旱和高溫強(qiáng)烈的拮抗作用(Fig.4C).。與無脅迫組相比，葉片H2O2濃度在脅迫組顯著上升。脅迫組上升的大約27%相似(Fig.5A),表明干旱和高溫?zé)o加成效果。相比之下，共同脅迫組的總抗壞血酸濃度（ASA+脫氫抗壞血酸（DHA））下降了13%。與對照組相比，共同脅迫組無顯著性差異(Fig.5B).暴露于干旱和干旱+高溫組的葉片ASA/DHA比率并無變化，在高溫脅迫組上升了71%。通過雷達(dá)圖數(shù)據(jù)分析(Fig.6)表明植物在遭受高溫干旱共同脅迫時(shí)，有最顯著的變化。例如，在平行于較高的APX組中觀察到顯著的膜損傷（上升的TBARSandEL引起的）。而且，與其他情況相比，在干旱條件下，植物表現(xiàn)出一個(gè)較高的可替電子吸收匯活性（highETRS’/PN)）和耗散過剩光能(highNPQ)的作用機(jī)理。另一方面，與干旱脅迫組相比，在高溫脅迫下維持高的凈光合速率(PN)引起低的ETRS’/PN值(Fig.6).?？墒?，這些結(jié)果不意味著可替電子吸收匯因?yàn)楦邷厥Щ?。麻風(fēng)樹遭受高溫條件（6h），這個(gè)物種的光合機(jī)構(gòu)可能變的對高溫脅迫耐受。而且，干旱預(yù)處理和同時(shí)發(fā)生的干旱不會(huì)改善高溫下麻風(fēng)樹的光合性能。這些結(jié)果與經(jīng)干旱預(yù)處理后表現(xiàn)對高溫脅迫適應(yīng)性的其他報(bào)道不一致。討論研究表明干旱，高溫和高溫+干旱脅迫能夠引起麻風(fēng)樹關(guān)鍵生理學(xué)過程的主要變化，通過膜完整性的測量，葉片氣體交換，葉綠素?zé)晒?，氧化損傷指示劑和ROS清除系統(tǒng)來表明。葉片CO2同化率下降，部分因?yàn)橄薅l件下氣孔(lowgS)和代謝限制(lowPN/CI)，主要是在干旱條件下(Fig.2)。細(xì)胞間的CO2濃度的維持與低的CO2同化率為脅迫條件下麻風(fēng)樹無氣孔限制光合作用提供額外的證據(jù)?？墒?，gS的下降與高溫脅迫下低的葉片水勢無關(guān)，表明氣孔對升溫的適應(yīng)或者對增強(qiáng)的空氣水汽壓虧損的適應(yīng)。除了在葉片觀測氣體交換的變化，光化學(xué)活動(dòng)也受干旱和共同脅迫的影響，而不只是熱脅迫。事實(shí)上，實(shí)際原初光化學(xué)量子產(chǎn)量和表觀電子傳遞率因?yàn)槊{迫強(qiáng)烈下降(Fig.3).。因?yàn)镋TRS’可能被視為一個(gè)整體的光化學(xué)活性指數(shù)，數(shù)據(jù)表明干旱，干旱+高溫處理引起了類囊體膜電子傳遞鏈的顯著失活。這些變化可能與醌積累的降低引起的PSII初級(jí)電子受體損傷有關(guān)，通過△F/’FM’的顯著下降表明。當(dāng)麻風(fēng)樹暴露于單一干旱或共同脅迫條件下，NPQ上升。高的NPQ值表明非輻射能量耗散機(jī)制是活躍的，而且較高比例的能量以熱能形式散失而非用于光合作用。過剩激發(fā)能的熱耗散被認(rèn)為是光保護(hù)機(jī)制，能維持PSII初級(jí)電子受體在氧化狀態(tài)，減少光損傷的可能性。實(shí)際上，在干旱脅迫的植物中這種機(jī)制更活躍。另外，暴露在干旱條件下的麻風(fēng)樹高的ETRS’/PN率，表明更多的電子被傳遞給替代電子匯而不是CO2同化反應(yīng)。這些替代電子匯給PSII活性提供了額外的保護(hù)，因?yàn)榕c那些干旱+高溫組相比，△F/’FM’和ETRS’較少受到干旱脅迫的影響。干旱脅迫對葉片氣體交換和光化學(xué)反應(yīng)起最大的影響。而且，干旱+高溫同時(shí)脅迫增強(qiáng)了干旱對光化學(xué)活性的抑制作用，在遭受干旱+高溫脅迫組中觀察到最低的△F/’FM’和ETRS’值(Fig.3)。干旱+高溫處理對葉片氣體交換和光化學(xué)活性最有害，與膜完整性(EL)和脂質(zhì)過氧化(TBARSlevels)結(jié)果一致。EL上升與TBARS積累有正相關(guān)，表明干旱+高溫脅迫引起的質(zhì)膜損傷至少部分是氧化損傷的結(jié)果。很多研究已經(jīng)證明非生物脅迫對植物細(xì)胞造成的損傷部分因?yàn)檠趸{迫引起的。SOD–APX–CAT系統(tǒng)保護(hù)光合機(jī)構(gòu)在環(huán)境脅迫條件下免受氧化損傷。SOD清除葉綠體和線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生的O2??，SOD活動(dòng)產(chǎn)生的H2O2被不同細(xì)胞組分的APX清除。另外，CAT去除過氧物酶體內(nèi)通過光呼吸途徑產(chǎn)生的H2O2。在當(dāng)前研究中，氧化脅迫明顯存在于麻風(fēng)樹葉片所有脅迫實(shí)驗(yàn)中，被脂質(zhì)過氧化的增強(qiáng)引起(Fig.1C)。脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度在遭受共同脅迫的植物中更高，表明葉片組織中主要的氧化損傷的進(jìn)展。研究報(bào)道TBARS在葉片中積累，是植物組織中氧化損傷的良好指示者。CAT和SOD活性受高溫脅迫促進(jìn)，卻受共同脅迫條件的強(qiáng)烈抑制(Fig.4BandC).。因干旱和共同脅迫造成的CAT和SOD活性抑制，可能是基因表達(dá)的下調(diào)或降解、變性和這些蛋白的抑制或失活的結(jié)果。例如，總CAT蛋白和活性的光依賴的下降在在對鹽分的反應(yīng)中出現(xiàn)。而且，需要不間斷的蛋白合成，以在降解超過再合成條件下維持CAT活性，否則會(huì)下降。反之，遭受高溫的麻風(fēng)樹葉片中CAT和SOD活性的上升，可能是因?yàn)楦邷匾鸬幕虮磉_(dá)上調(diào)或/和蛋白亞型的激活。與CAT和SOD活性相比，遭受脅迫處理的植物中APX活性上升，但是除了共同脅迫組。一些APX亞型廣泛分布在幾乎所有的細(xì)胞器中，非生物脅迫總是引起基因表達(dá)和APX總活性的共同增強(qiáng)，為了補(bǔ)償CAT活性的缺失。可是，APX總活性上升不會(huì)直接補(bǔ)償受損的CAT活性，因?yàn)镠2O2在葉片組織中顯著積累。過氧物酶體和葉綠體中產(chǎn)生的過量的H2O2可能擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中，通過Fentonreaction轉(zhuǎn)化為羥基自由基。這些是毒害最強(qiáng)的ROS并與脂質(zhì)過氧化直接相關(guān)。我們的結(jié)果表明ROS清除系統(tǒng)對于保護(hù)麻風(fēng)樹葉片免受氧化損傷，特別是那些遭受共同脅迫的，被高水平的脂質(zhì)過氧化和H2O2積累確認(rèn)(Figs.1Cand5A).。脅迫條件下麻風(fēng)樹葉片中過氧化氫的積累可能主要由光呼吸產(chǎn)生，主要位于過氧物酶體內(nèi)的過程。這種假設(shè)是在實(shí)驗(yàn)條件下，被CAT活性的下降(Fig.4)和ETRS’/PN率的上升支持的(Fig.3D)。光呼吸是C3植物中一個(gè)主要的可替電子匯，可能被實(shí)驗(yàn)中的脅迫條件促進(jìn)。ETRS’/PN率達(dá)到了很高的值（大約60），表示光合損傷。實(shí)際上，我們發(fā)現(xiàn)無脅迫條件下的生長季的柑橘ETRS’/PN率大約在10，當(dāng)冬季水況良好時(shí)，這些植物的表觀ETRS’/PN值大約是21。這些變化可能是由低溫下受損的光合作用引起的，因?yàn)樽畲驲ubisco羧化率和RuBP最大再生下降，都依賴于光化學(xué)電子傳遞的能量供應(yīng)。從這項(xiàng)研究中得出的數(shù)據(jù)表明單一脅迫和聯(lián)合脅迫條件下，光化學(xué)損傷和氧化脅迫之間關(guān)系的復(fù)雜性。實(shí)際上，光合作用和抗氧化酶活性的變化不足以解釋麻風(fēng)樹的應(yīng)答，特別是氧化損傷。作為一個(gè)指示者，干旱比高溫更具脅迫性，依據(jù)對光合作用的干擾（CO2同化率和光化學(xué)活性）和氧化損傷。這些更為嚴(yán)重的不利影響與電子從PSII到羧化反應(yīng)的大量損失，CAT和SOD活性和較高的H2O2積累有關(guān)。與對照組相比，干旱只大幅抑制CAT，促進(jìn)APX和維持SOD活性，高溫處理組顯著促進(jìn)所有三種酶的活性。同時(shí)，對高溫的響應(yīng)對于H2O2清除和超氧自由基極其有利，特別是在葉綠體和過氧物酶體。維持SOD，APX，和CAT之間的良好平衡對于避免ROS積累、保護(hù)光化學(xué)機(jī)構(gòu)和避免現(xiàn)在的氧化損傷是很有必要的，正如在高溫脅迫的植物中表現(xiàn)的。實(shí)際上，受損的光化學(xué)活性和光呼吸的激增是葉片ROS積累的主要原因。數(shù)據(jù)表明干旱+高溫條件引起了膜完整性、光合CO2同化、光化學(xué)活性和氧化代謝的最不利的影響。實(shí)際上，我們觀察到PSII活性損傷，CAT和SOD活性顯著抑制和過氧化氫積累。暴露于聯(lián)合脅迫的植物葉片中總APX活性的激增，不足以避免重要的氧化損傷或過氧化氫積累。共同脅迫可以引發(fā)細(xì)胞質(zhì)中基因亞型的上調(diào)但不會(huì)顯著影響葉綠體中亞型的表達(dá)。細(xì)胞質(zhì)APX亞型對植物細(xì)胞氧化還原平衡維持非常重要。然而，在共同脅迫條件下，總APX活性被顯著上調(diào)，但是總抗壞血酸濃度和它的氧化還原平衡沒有變化。這些結(jié)果表明一部分作為APX活性底物的還原