緊急人工氣道建立和護(hù)理

急診緊急氣道建立方式與護(hù)理古交礦區(qū)總醫(yī)院急診科孟玉婷

定義人工氣道是指將導(dǎo)管經(jīng)口、鼻或直接經(jīng)導(dǎo)管插入氣管所建立的氣體通道，以輔助通氣及進(jìn)行肺部疾病的治療,改善呼吸功能的一種技術(shù)。臨床上常包括氣管插管〔經(jīng)口或鼻〕、氣管切開、喉罩、口咽通氣管等。建立人工氣道的目的：新建MicrosoftPowerPoint演示文稿.ppt1.維持通暢的氣體交換通路；2.建立去除分泌物的途徑；3.機(jī)械通氣。哪些情況需要緊急建立人工氣道短時間內(nèi)氣道完整性受到破壞或氣道受阻；呼吸衰竭需要呼吸機(jī)輔助呼吸；緊急保護(hù)氣道以防止可預(yù)見的影響氣道通暢性的因素。常見疾?。汉粑ソ?、呼吸停止、心跳驟停、深昏迷、急性上呼吸道梗阻、顱腦或頸部外傷等。人工氣道的選擇氣管插管/氣管切開口咽通氣管喉罩建立緊急人工氣道工具分類通氣工具：聲門上/下氣道---經(jīng)或不經(jīng)聲門聲門上氣道:口咽通氣道、面罩、喉罩、喉管、食管氣管聯(lián)合導(dǎo)管〔ET-Combitube〕氣管內(nèi)：氣管導(dǎo)管聲門下氣道:環(huán)甲膜穿刺置管、氣管切開建立氣道的輔助工具：喉鏡類---經(jīng)氣管導(dǎo)管外暴露插管直接喉鏡間接喉鏡〔可視喉鏡〕導(dǎo)引器類---經(jīng)氣管導(dǎo)管內(nèi)引導(dǎo)插管盲探引導(dǎo)：硬質(zhì)管芯、插管探條〔Bougie〕、光棒明示引導(dǎo)：硬質(zhì)可視纖維鏡〔shikani，Discopo〕聲門上通氣裝置---喉罩喉罩通氣道是介于面罩及氣管內(nèi)插管之間的保持上呼吸道通暢的裝置；病人體位自然，不用喉鏡，無需任何幫助即可快速將插管插入病人氣道內(nèi)。操作簡便，是緊急時最方便最有效的通氣方法之一。

最適合于急診使用的喉罩：LMA為一次性雙管喉罩，已經(jīng)塑型，置入成功率高。緊急人工氣道技術(shù)

首先：手法開放氣道：仰頭舉頦法雙手舉頦法開放氣道標(biāo)準(zhǔn)：下頜與耳垂垂直聲門上氣道通氣--口咽通氣道適應(yīng)證：手法托下頜無效者需較長時間解除舌后墜者目的：置入后撐起后墜的舌根和咽部的軟組織，從而開放梗阻的上呼吸道。主要用于意識障礙導(dǎo)致的舌后墜的病人。放置方法：1、順插法：在舌鉗或壓舌板的幫助下，將口咽通氣管放入口腔。2、反轉(zhuǎn)法：口咽通氣道凹面向上插入口腔，當(dāng)放置1/2-2/3,翻轉(zhuǎn)1800，成正位后下壓，上提，并用雙手拇指向下推送至適宜位置。適用于昏迷病人:清醒患者可出現(xiàn)惡心、嘔吐、嗆咳、喉痙攣、支氣管痙攣；選擇適宜規(guī)格的口咽通氣道過大：氣道阻塞；過?。翰荒苡行Х_氣道；放置本卷須知:聲門上氣道通氣--口咽通氣道聲門下通氣裝置--環(huán)甲膜穿刺環(huán)甲膜穿刺是經(jīng)聲門下開放氣道的一種方法,用于上呼吸道阻塞如聲門水腫、異物、喉部腫瘤。無法實施插管或喉罩建立氣道的緊急情況；是防止造成窒息死亡的急救裝置；是建立氣道最快捷的方式；為進(jìn)一步搶救贏得了時間。、環(huán)甲膜的位置如何確定?環(huán)甲膜位于甲狀軟骨和環(huán)狀軟骨之間，前無堅硬遮擋組織〔僅有柔軟的甲狀腺通過〕，后通氣管，它僅為一層薄膜，周圍無要害部位，因此利于穿刺。如果自己尋找，可以低頭，然后沿喉結(jié)最突出處向下輕輕地摸，在約2~3厘米處有一如黃豆大小的凹陷，此處即為環(huán)甲膜位置所在。操作步驟：1、患者去枕平臥，肩背部墊起，頭后仰。2、常規(guī)皮膚消毒。3、左手固定環(huán)甲膜，右手持注射器刺入，回抽有空氣后固定針頭?；颊呖捎锌人?，隨后呼吸道病癥緩解。建立氣道輔助工具---直接喉鏡直接喉鏡：彎型、直型、尖端可活動型彎型：放置于舌根與會厭軟骨之間的凹陷處，將會厭軟骨挑起。直型適用于歐洲人。頸前加壓：直接喉鏡下聲門暴露不理想，護(hù)士在甲狀軟骨前加壓，協(xié)助醫(yī)生找到暴露聲門的最正確位置。臨床上該手法可使插管困難發(fā)生率從9%下降到1.3--5.4%。插管插入長度如何確定1.成人：插管型號×32.兒童：年齡÷2+12意義：判斷管位置是否正常，外露局部太長，說明管脫出，太短那么可能滑入支氣管，多滑入右側(cè)支氣管，因右側(cè)主支氣管短而直，與氣管縱軸夾角小。病人表現(xiàn)為極度呼吸困難，出現(xiàn)三凹征。插管的固定

1成功后迅速拔出管芯,于插管旁放置牙墊或5ml注射器2用小紗帶在套管上打死結(jié)，經(jīng)雙側(cè)面頰部，繞過枕后在耳前方打結(jié)，注意固定時不能壓住耳根。3用膠布交叉固定于面部，要注意的是：由于口腔分泌物易流出，造成膠布松動，應(yīng)密切觀察并及時更換。4氣囊注氣：用注射器注入5-8ml空氣，氣囊中度保即可，既能阻止漏氣，還防止了氣管粘膜的受壓缺血。5如需接呼吸機(jī)輔助通氣，那么應(yīng)調(diào)整好呼吸機(jī)管道的長度和位置，防止?fàn)坷箤?dǎo)管移位或脫出。氣管插管本卷須知1、選擇適宜型號的氣管導(dǎo)管，插管時要有管芯，管芯內(nèi)端短于導(dǎo)管口1-1.5cm,管芯平時保持平直狀態(tài)，不能到處打彎，以免影響插管。2、防止反復(fù)插管。3、護(hù)士要嚴(yán)密觀察患者生命體癥以及血氧飽和度，兩側(cè)胸部起伏情況。4、護(hù)士要注意插管外留長度，認(rèn)真交接班。防止插管脫出或下滑。氣管插管的護(hù)理1.氣管插管的選擇(已經(jīng)口為例〕年齡內(nèi)腔直徑〔mm)導(dǎo)管深度〔cm)女性7-821-23男性8-922-24小兒〔>1歲〕年齡/4+4年齡/2+12未成熟兒2.5-39-10新生兒〔足月〕3.0-3.511-12

導(dǎo)管深度直氣管導(dǎo)管自中切牙至氣管中段的距離經(jīng)鼻插管較經(jīng)口插管小號，深度在加2-3cm，小兒年齡/2+15

氣管插管的護(hù)理2，確認(rèn)氣管導(dǎo)管的位置并妥善固定1〕聽診雙肺呼吸音2〕看氣體從導(dǎo)管溢出〔白霧〕3〕測呼氣末二氧化碳分壓4〕上呼吸級機(jī)的病人觀察潮氣量的變化。防止脫出、防止單肺通氣：記錄長度嚴(yán)格交接班氣管插管的護(hù)理3，調(diào)整合理舒適的體位

1)無論氣管切開還是氣管插管，在24-48小時內(nèi)病人應(yīng)采取平臥位或半臥位，而體位不易變動過多，以增加氣管與管道相容性

2)頭稍后仰減輕氣管導(dǎo)管對咽部的壓迫

3)機(jī)械通氣時氣管導(dǎo)管與病人平行

4)吸痰時一只手固定氣管插管人工氣囊的護(hù)理氣囊不放氣技術(shù)：高容低壓?！铂F(xiàn)在插管氣囊均為高容積低壓氣囊，充氣后呈圓柱形，與氣管壁接觸面積贈大，對氣管壁壓力明顯減輕。新觀點認(rèn)為，不需要常規(guī)放氣，理論依據(jù)是壓迫區(qū)毛細(xì)血管血流1小時也很難恢復(fù)。〕氣囊壓力:18-25mmHg〔如何判斷〕作用：密封氣道和預(yù)防分泌物的吸入壓力過高：氣管食管瘺、張力性氣胸、縱隔氣腫壓力過低：漏氣、返流最小閉合容量技術(shù)〔MOV〕與最小漏氣技術(shù)〔MLT〕之區(qū)別MOVMLT定義：套囊充氣后吸氣時無氣體漏出套囊充氣后吸氣時有少量氣體漏出步驟：1.將聽診器放于頸部，同時1.同前給套囊充氣直到無氣體漏出為止2.抽出氣體可聞及漏氣聲2.抽出氣體以開始，直到吸氣時3.再注氣，直到吸氣時聽不到聽到漏氣聲止漏氣聲止優(yōu)點：1.不易發(fā)生誤吸1.防止套囊上產(chǎn)生滯留物，在套囊周圍2.不影響潮氣量有一向上氣流將流向肺內(nèi)的痰液咯出2.與MOV比，減少了潛在氣道損傷缺點：比MLT易發(fā)生氣道損傷1.易發(fā)生誤吸。2.可降低潮氣量人工氣囊的護(hù)理漏氣的判斷反流的判斷聽：有無漏氣聲、發(fā)音看：口、鼻有無氣體溢出試：氣囊放氣量與充氣量是否相等查：套管位置有無改變致漏氣潮氣量、壓力改變正確吸痰吸痰時機(jī)適時、按需吸痰，出現(xiàn)以下情況時可確定病人吸痰：①病人出現(xiàn)嗆咳，有痰液的回動。②上機(jī)病人在排除管路扭曲等各種因素外，氣道壓力增高，峰壓報警。③雙肺聽診時有痰鳴音存在。④SPO2下降〔肺功能正常時SPO2大于95%，老年肺病時，SPO2大于88%〕正確吸痰吸痰原那么無菌、無創(chuàng)、快速、有效。為了防止醫(yī)院性感染及交叉感染，吸痰應(yīng)盡量做到無菌，對氣道沒有創(chuàng)傷，時間要求15秒左右，如果有大量痰貯存在氣道時，那么相應(yīng)延長時間。吸痰是動作輕柔、口、鼻腔、人工氣道吸引時應(yīng)分開。正確吸痰吸痰壓力為了防止負(fù)壓吸引對氣道的損傷，壓力在之間。成人壓力一般小于200mmHg,兒童在80~100mmHg，嬰幼兒在60~80mmHg.正確吸痰方法1吸純氧或高氧2霧化吸入3翻身拍背以大小魚際叩擊病人肺部，其方法應(yīng)由上向下，由外向內(nèi)，均勻有力的叩擊，引起體內(nèi)痰液的震動，促進(jìn)痰液的排出注意：吸痰時由淺入深、左右旋轉(zhuǎn)輕柔，遇到分泌物出稍停留，禁忌一插到底，以免將氣管外部的痰帶入氣管深部，引起二重感染。吸痰是觀察患者的面色，心率及SPO2。正確吸痰深度原那么上應(yīng)比氣管導(dǎo)管長4-5cm，以確保能吸出氣管支氣管內(nèi)的分泌物。深昏迷的病人插入深度越深越好，清醒及有咳嗽反射的病人，插入深度應(yīng)到達(dá)病人有效咳嗽為宜吸痰時病人的體位應(yīng)取平臥位，以保證吸痰時氣道通暢無阻。

美國呼吸道管理協(xié)會將呼吸音改善、峰值吸氣壓降低、呼吸道阻力降低或肺順應(yīng)性增加、潮氣量增加、SaO2改善作為成功吸痰的標(biāo)準(zhǔn)吸痰效果評價加溫和濕化濕化方法間斷霧化吸入氣管內(nèi)直接滴藥，應(yīng)用微量泵以每小時泵入，量根據(jù)痰液情況而定，〔現(xiàn)在不建議常規(guī)使用氣道內(nèi)滴注濕化液?！畴姛岷銣貪窕b置〔上機(jī)病人〕可以調(diào)節(jié)吸入管道氣體的溫度。呼吸道氣溫32-35度。調(diào)節(jié)室內(nèi)適宜的溫濕度，勤镲地，溫度20-22℃保證濕度50-60%。感染及預(yù)防嚴(yán)格執(zhí)行無菌技術(shù)操作原那么操作者、吸痰盤、吸痰管的應(yīng)用消毒保持呼吸道通暢濕化、翻身叩背、吸痰腸內(nèi)營養(yǎng)體位、小號鼻飼管、鼻腸管、持續(xù)滴入做好口腔護(hù)理或口腔沖洗，預(yù)防VAP的發(fā)生氣管切開換藥按時換藥，污染時隨時更換選用適宜的濕化器和濕化液呼吸機(jī)管路及附件的更換與消毒房間消毒護(hù)士如何配合醫(yī)生建立人工氣道建立人工氣道的物品設(shè)備準(zhǔn)備齊全，定人定時檢查定點放置，保證性能良好，完好備用；掌握建立人工氣道各種方式適應(yīng)癥及操作步驟，知曉醫(yī)生下一步要做什么，以便及時、準(zhǔn)確配合；物品設(shè)備按操作步驟有序擺放以利于快速選??；做好準(zhǔn)備工作：如撤床頭、去枕、清理呼吸道、協(xié)助醫(yī)生擺好體位、準(zhǔn)備好負(fù)壓吸引器、呼吸機(jī)……建立氣道后及時整理、檢查，保持床單位整潔，病人舒適，實施保護(hù)性醫(yī)療。提倡：每個科急救車內(nèi)準(zhǔn)備氣道設(shè)備搶救車或箱內(nèi)容包括上述緊急氣道工具,可以結(jié)合本科室的具體條件有所調(diào)整,但應(yīng)當(dāng)至少有一種急癥氣道工具。設(shè)備車內(nèi)還應(yīng)備好各種型號的氣管導(dǎo)管、面罩、通氣道以及簡易呼吸器;另外還需配備牙墊、注射器、膠帶等輔助物品。設(shè)備車〔箱〕應(yīng)由專人負(fù)責(zé),定期檢查并補(bǔ)充和更換設(shè)備,使各種器具處于備用狀態(tài)?？偨Y(jié)建立人工氣道的目的是維持患者的通氣和氧合，任何時候碰到困難氣道問題，首先要解決通氣問題，防止缺氧。喉罩應(yīng)作為首選工具〔之所以不是面罩，是因為面罩通氣困難本身就是困難氣道的一種〕；不管是用口咽通氣道還是環(huán)甲膜穿刺、氣管插管等，只要患者能夠維持通氣〔不管是控制呼吸還是自己呼吸〕，患者就平安了，也就給后面來的上級醫(yī)生贏得了時間。病人只會死于通氣失敗，不會死于插管失敗原那么——通氣總是第一的！謝謝！5-Aza-CdR對人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及TFPI-2mRNA表達(dá)的影響5-Aza-CdR對人食管癌細(xì)胞株生物學(xué)行為及TFPI-2mRNA表達(dá)的影響杜雅冰，邵應(yīng)舉，樊青霞，孫楨，王琳，趙培榮作者單位：(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南鄭州450002)【摘要】目的探討5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干預(yù)對食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706生長增殖及其組織因子途徑抑制物2(tissuefactorpathwayinhibitor-2，TFPI-2)基因表達(dá)的影響。方法選取食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706，并用不同濃度的5-Aza-CdR處理該細(xì)胞株。MTT法檢測干預(yù)前后細(xì)胞增長率的變化，F(xiàn)CM法檢測干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化，RT-PCR技術(shù)檢測干預(yù)前后Eca9706細(xì)胞TFPI-2基因mRNA的表達(dá)，免疫組化檢測干預(yù)前后Eca9706細(xì)胞TFPI-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果食管鱗癌細(xì)胞株Eca9706存在TFPI-2基因超甲基化狀態(tài)，經(jīng)5-Aza-CdR處理后，超甲基化狀態(tài)解除，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞凋亡率明顯提高(P<0.05);細(xì)胞中TFPI-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時mRNA的表達(dá)水平也較處理前明顯提高(P<0.05)。結(jié)論食管癌細(xì)胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表達(dá)，當(dāng)其超甲基化解除后，細(xì)胞增殖受到抑制，同時細(xì)胞凋亡率相應(yīng)提高?！娟P(guān)鍵詞】食管癌;組織因子途徑抑制物-2;5-氮雜-2-脫氧胞苷;甲基化;免疫組化;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響;凋亡ABSTRACT：ObjectiveToexploretheeffectsof5-Aza-2-deoxycytidine(5-Aza-CdR)interventiononthegrowthandproliferationofEca9706celllineandproteinexpressionoftissuefactorpathwayinhibitor-2(TFPI-2).MethodsEca9706celllinewastreatedby5-azaCdRofdifferentconcentrations;MTT，flowcytometry，immunohistochemistryandRT-PCRwereusedtodeterminethecellgrowth，apoptosis，andtheexpressionofTFPI-2geneanditsprotein.ResultsEca9706celllinehadhypermethylationofTFPI-2.Afterdemethylationby5-Aza-CdRtreatment，theproliferationofEca9706wasinhibited，theapoptosisratewasalsoincreasedsignificantlyintheconcentration-dependentmanner.RT-PCRdetectedthatmRNAexpressionofTFPI-2geneinEca9706celllinerecoveredsignificantly(P<0.05).Conclusion5-Aza-CdRcanslowthegrowthofEca9706cell，increasetheapoptosisrate，reactivatetheTFPI-2genetranscriptionandproteinexpressionbydemethylation.KEYWORDS：esophagealcarcinoma;tissuefactorpathwayinhibitor-2;5-Aza-CdR;methylation;immunohistochemistry;RT-PCR;apoptosis組織因子途徑移植物2(tissuefactorpathwayinhibitor，TFPI-2)是絲氨酸蛋白酶抑制物，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移方面起著重要作用。目前，關(guān)于TFPI-2在食管癌中的基因表達(dá)情況的分析研究尚少。本研究旨在探討TFPI-2基因的失活機(jī)制，并尋找食管癌治療的新靶點。1材料與方法材料RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶生物科技;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購自天津市灝洋生物制品科技;Trizol試劑購自MBI公司;RT-PCR試劑盒購自MBI公司;5-Aza-CdR購自Sigma公司;人食管癌細(xì)胞株Eca9706由鄭州大學(xué)腫瘤生物學(xué)研究室惠贈。細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理人食管癌細(xì)胞Eca9706以含10mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3d消化傳代1次。MTT法檢測干預(yù)前后細(xì)胞增長率的變化取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度至5×104/mL接種于96孔板，按5-Aza-CdR濃度分為6組：0、、、、、102.4μmol/L，每組復(fù)設(shè)5個孔。待細(xì)胞貼壁后，分別于24、48、72h后參加MTT液，4h后棄去上清液，每孔加DMSO150μL，在490nm波長測定各孔吸光度值(absorbance，A)。細(xì)胞增殖抑制率(cellularproliferationinhibitionrate，CPIR)按公式計算：CPIR=(1-實驗組A均值/對照組A均值)×100%。流式細(xì)胞儀(FCM)檢測干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化取對數(shù)生長期細(xì)胞，按5×105/mL的密度接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后加藥，分組如下：對照組(0μmol/L),1.6μmol/L5-Aza-CdR組，25.6μmol/L5-Aza-CdR組，102.4μmol/L5-Aza-CdR組。每組均于5-Aza-CdR作用48h后消化收集細(xì)胞，700mL/L冰乙醇固定，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡測定。RT-PCR技術(shù)檢測TFPI-2基因mRNA的表達(dá)分組同F(xiàn)CM，每組細(xì)胞均5-Aza-CdR作用48h。TFPI-2的上、下游引物分別為5′-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3′和5′-ATGGAATTTTCTTTGGTGCG-3′，合成產(chǎn)物為440bp;β-actin作為內(nèi)參照，上下游引物分別為5′-AGGCATTGTGATGGACTCCG-3′和5′-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3′，合成產(chǎn)物為301bp。按照試劑盒說明書，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計分析后，按Sigma公司RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit說明書操作。先逆轉(zhuǎn)錄制備單鏈cDNA，再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用上、下游產(chǎn)物進(jìn)行PCR反響擴(kuò)增目的基因。反響條件為：94℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30s,51℃退火30s,72℃延伸30s，循環(huán)30次，最后72℃延伸5min,4℃保溫。擴(kuò)增片段經(jīng)20g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。免疫組化方法檢測TFPI-2蛋白的表達(dá)取對數(shù)生長期細(xì)胞，按5×104/mL的密度接種于經(jīng)預(yù)處理的蓋玻片上，待細(xì)胞貼壁后加藥(分組同RT-PCR)。培養(yǎng)48h后參加40g/L多聚甲醛溶液固定30min,30mL/LH2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下10min,100mL/L動物血清封閉，室溫下10min，滴加1∶100的稀釋的TFPI-2抗體4℃過夜，二抗室溫下1h，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明封片。另取爬片滴加PBS液代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：TFPI-2蛋白陽性信號均呈棕黃色顆粒樣物質(zhì)，位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。光鏡下隨機(jī)選取10個視野(每個視野觀察細(xì)胞數(shù)不少于100個)，按陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行結(jié)果判定。陽性率=(陽性細(xì)胞數(shù)/1000)×100%。統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，采用單因素方差分析加LSD兩兩比較法進(jìn)行分析。檢驗水準(zhǔn)。2結(jié)果干預(yù)前后細(xì)胞增長率的變化經(jīng)MTT檢測，結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞抑制率明顯高于未加藥組，且隨著作用時間的延長和濃度的增加而增加(表1)。表1不同濃度的5-aza-CdR對Eca9706細(xì)胞增殖的影響干預(yù)前后細(xì)胞凋亡率的變化流式細(xì)胞儀分析可見，經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR誘導(dǎo)48h后，Eca9706細(xì)胞各處理組凋亡率分別為(13.76±0.47)%、(26.97±0.39)%、(41.03±0.19)%，與5-Aza-CdR誘導(dǎo)濃度成正比。與對照組[(1.39±0.27)%]比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且各濃度組間比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義，圖1)。以上實驗重復(fù)5次。干預(yù)前后Eca9706細(xì)胞mRNA的表達(dá)情況擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，Eca9706細(xì)胞中TFPI-2mRNA表達(dá)在各用藥組和未用藥組之間有明顯差異，TFPI-2mRNA在未用藥組細(xì)胞中未見表達(dá)。經(jīng)、、102.4μmol/L5-Aza-CdR處理后可見TFPI-2mRNA表達(dá)，說明在一定范圍內(nèi)隨5-Aza-CdR藥物濃度的增加TFPI-2mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)(圖2)。圖1各組流式細(xì)胞凋亡散點圖A：對照組;B：1.6μmol/L5-Aza-CdR組;C：25.6μmol/L5-Aza-CdR組;D：102.4μmol/L5-Aza-CdR組。圖25-Aza-CdR處理前后Eca9706細(xì)胞TFPI-2mRNA的表達(dá)M：DNAmarker;β-actin：301bp;TFPI-2：440bp;1：對照組;2：組;3：25.6μmol/L組;4：1.6μmol/L組;5：H2O對照組。干預(yù)前后TFPI-2蛋白的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示，經(jīng)5-Aza-CdR作用Eca9706細(xì)胞48h，TFPI-2蛋白的陽性表達(dá)率增加，對照組、1.6μmol/L組、25.6μmol/L組、102.4μmol/L組TFPI-2蛋白的陽性表達(dá)率分別為(2.10±1.42)%、(9.31±2.70)%、(14.72±3.50)%、(68.20±3.20)%，不同濃度組之間以及用藥組與對照組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，圖3)。圖3各組TFPI-2蛋白的表達(dá)情況3討論人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22區(qū)域，全長由8164個堿基組成，其cDNA全長為1222kb。其mRNA的啟動子具有典型的管家基因特征，沒有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的轉(zhuǎn)錄起始位點區(qū)域GC含量超過80%[1]。TFPI-2可在體內(nèi)多種組織廣泛表達(dá)，在這些組織內(nèi)一旦出現(xiàn)腫瘤，TFPI-2的表達(dá)水平也會隨之顯著下降[2]。有研究證實，在絨毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、纖維肉瘤和胸部惡性腫瘤組織中，與腫瘤產(chǎn)生相關(guān)的TFPI-2表達(dá)水平減少可能與其啟動子的甲基化密切相關(guān)[1,3-5]。啟動子區(qū)cpG島高甲基化在腫瘤形成機(jī)制中確實切作用尚不清楚，然而眾多證據(jù)說明，腫瘤抑癌基因CpG島異常的甲基化導(dǎo)致基因失活和轉(zhuǎn)錄抑制是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一[6-8]。目前，有體外實驗說明，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR通過去甲基化作用可使多種含有CpG島的高甲基化抑癌基因重新表達(dá)，從而恢復(fù)抑癌功能[9]。本實驗RT-PCR結(jié)果顯示，TFPI-2在Eca9706細(xì)胞中無表達(dá)，經(jīng)過不同濃度的5-Aza-CdR處理Eca9706細(xì)胞后，TFPI-2亦重新出現(xiàn)表達(dá)，且在一定范圍內(nèi)隨藥物誘導(dǎo)濃度的增大表達(dá)逐漸增強(qiáng)。MIZUNO等[10]研究說明，腫瘤細(xì)胞中DNMT的表達(dá)較正常的高4～12倍，也證實DNMT上調(diào)參與腫瘤發(fā)生。這與我們的實驗結(jié)果一致。根據(jù)MTT實驗可知，經(jīng)過5-Aza-CdR干預(yù)處理過的Eca9706細(xì)胞增殖明顯受抑制，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用越明顯。從本實驗結(jié)果分析，DNA啟動子區(qū)去甲基化能較明顯地抑制食管癌細(xì)胞增殖，并與其誘導(dǎo)劑量呈正相關(guān)，推測這種抑制作用與去甲基化后重新激活TFPI-2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有著直接關(guān)系;此外可能與去甲基化后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。進(jìn)而通過流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR干預(yù)的Eca9706的細(xì)胞中，用藥組與對照組相比細(xì)胞凋亡率凋亡率有所增加，并且與5-Aza-CdR誘導(dǎo)劑量有依賴性關(guān)系。BENDER等[11]在同等條件下用5-Aza-CdR處理惡性腫瘤細(xì)胞系和正常纖維細(xì)胞系時，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖均被抑制，而纖維細(xì)胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR對Eca9706細(xì)胞增殖的抑制及凋亡的增加不是藥物的毒性影響，可能是因為使TFPI-2重新表達(dá)的結(jié)果。目前，國外以TFPI-2為藥物研究靶點，就TFPI-2在腫瘤治療、腫瘤臨床診斷、促進(jìn)傷口愈合和動脈粥樣硬化治療等領(lǐng)域中的應(yīng)用，也正在進(jìn)行廣泛深入的研究。本研究用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR處理人食管癌Eca9706細(xì)胞株，檢測TFPI-2基因表達(dá)的變化及其對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期尋找治療腫瘤的新靶點。

【參考文獻(xiàn)】[1]HUBEF，REBERDIAUP，IOCHMANNS，etal.CharacterizationandfunctionalanalysisofTFPI-2genepromoterinahumanchoriocarcinomacellline[J].ThrombRes，203，109(4)：207-215.[2]MIYAGIiY，KOSHIKAWAN，YASUMITSUH，etal.cDNAcloningandmRNAexpressionofaserineprotein5andtissuefactorpathwayinhibitor-2[J].JBiochem，1994，116(5)：939-942.[3]RAOCN，SEGAWAT，NAVARIJR，etal.MethylationofTFPI-2geneisnotthesolecauseofitssilencing[J].IntJOncol，2003，22(4)：843-848.[4]KONDURISD，SRIVENUGOPALKS，YANAMANDRAN，etal.Promotermethylandsilencingofthetissuefactorpathwayinhibitor-2(TFPI-2)，ageneencodinganinhibitorofmatrixmetalloproteinasesinhumangliomacells[J].Oncogene，2003，22(29)：4509-416.

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