丁酸氯維地平原料藥物成分的反相高效液相色譜分析,藥學(xué)論文

丁酸氯維地平原料藥物成分的反相高效液相色譜分析,藥學(xué)論文丁酸氯維地平的化學(xué)名為4-〔2,3-二氯苯基〕-1-4-二氫-2-6-二甲基-3,5-吡啶二羧酸甲基-〔1-氧代丁氧基〕甲酯，是由英國AstraZeneca公司研制開發(fā)的第3代新型短效二氫吡啶類靜脈注射用鈣通道拮抗劑，于2008年8月經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市，主要用于急性高血壓的治療及術(shù)后血壓的控制[1].當(dāng)前各國藥典均未收錄丁酸氯維地平的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，華而不實關(guān)于丁酸氯維地平中有關(guān)物質(zhì)測定方式方法的報道中，熊野娟等[2]采用有緩沖鹽的流動相體系，使用梯度洗脫，測定了丁酸氯維地平和7種雜質(zhì)；袁慧雅等[3]僅對丁酸氯維地平進(jìn)行了研究，并未對專屬性試驗中產(chǎn)生的降解雜質(zhì)進(jìn)一步研究；劉艷華等[4]采用有緩沖鹽的流動相體系，并使用梯度洗脫法測定丁酸氯維地平和10種雜質(zhì)。本實驗選用丁酸氯維地平及其14種雜質(zhì)來優(yōu)化色譜方式方法，有5種雜質(zhì)〔雜質(zhì)II、IV、VII、XIII、XVI〕尚未見文獻(xiàn)報道，華而不實雜質(zhì)IV是丁酸氯維地平水解脫去丁酸酯構(gòu)成的雜質(zhì)，對丁酸氯維地平原料藥的質(zhì)量具有重要影響，雜質(zhì)II、XIII、XVI是工藝雜質(zhì)，雜質(zhì)VII是丁酸氯維地平脫氫氧化和水解構(gòu)成的雜質(zhì)。經(jīng)過色譜條件的優(yōu)化，本實驗采用甲醇環(huán)己烷水〔70∶0.5∶30〕作為流動相，并根據(jù)樣品檢測及強(qiáng)迫降解試驗結(jié)果，在進(jìn)行方式方法學(xué)驗證經(jīng)過中，研究了雜質(zhì)I、III、IV、V.結(jié)果表示清楚，此方式方法專屬性高，操作簡單、分離度好，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度、精致細(xì)密度高。1儀器與材料1.1儀器Agilent1260型高效液相色譜儀，包括G1311B二元泵、G1329B自動進(jìn)樣器、G1316C柱溫箱和G4212BDAD檢測器。1.2藥品和試劑丁酸氯維地平對照品〔批號130306,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.85%〕、原料藥〔批號130715、130816、130817、130818〕以及14個雜質(zhì)對照品均由天津藥物研究院化學(xué)制藥部提供。甲醇為色譜純〔天津市康科德科技發(fā)展有限公司〕，環(huán)己烷為分析純〔天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司〕，水為Milli-Q超純水。雜質(zhì)對照品分別為4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-1,4-二氫吡啶-3,5-二羧酸二丁酰氧甲基酯〔雜質(zhì)I〕、4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-1,4-二氫吡啶-3,5-二羧酸-3-乙氧基-5-甲酯〔雜質(zhì)II〕、4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-1,4-二氫吡啶-3,5-二羧酸二甲酯〔雜質(zhì)III〕、4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-1,4-二氫吡啶-3,5-二羧酸-3-甲酯〔雜質(zhì)IV〕、4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-1,4-二氫吡啶-3,5-二羧酸-3-丁酰氧基甲基酯-5-甲酯〔雜質(zhì)V〕、4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-1,4-二氫吡啶-3-羧酸甲酯〔雜質(zhì)VI〕、4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-3,5-二羧酸-3-甲酯〔雜質(zhì)VII〕、4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-3-吡啶羧酸甲酯〔雜質(zhì)VIII〕、6-〔2,3-二氯苯基〕-4-甲基-2-氧代環(huán)己基-3烯-甲酸甲酯〔雜質(zhì)IX〕、二氰基乙基-4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-1,4-二氫吡啶-3,5-二羧酸酯〔雜質(zhì)XI〕、4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-1,4-二氫吡啶-3,5-二羧酸單甲酯〔雜質(zhì)XII〕、4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-1,4-二氫吡啶-3,5-二羧酸-3-氰基乙氧基-5-乙酯〔雜質(zhì)XIII〕、4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-1,4-二氫吡啶-3,5-二羧酸-3-丁酰氧基甲基酯-5-乙酯〔雜質(zhì)XV〕、4-〔2,3-二氯苯基〕-2,6-二甲基-1,4-二氫吡啶-3,5-二羧酸-3-氰基乙氧基酯-5-甲酯〔雜質(zhì)XVI〕，峰面積歸一化法測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.23%、96.29%、98.12%、98.46%、98.18%、95.13%、97.58%、95.39%、95.79%、95.54%、96.49%、97.51%、95.15%、96.30%.2方式方法與結(jié)果2.1色譜條件WelchromC18色譜柱〔250mm4.6mm,5?m〕；流動相為甲醇環(huán)己烷水〔70∶0.5∶30〕；體積流量為1mL/min;柱溫為30℃；檢測波長為240nm;進(jìn)樣體積為20L.2.2專屬性試驗2.2.1樣品+1%雜質(zhì)的溶液稱取丁酸氯維地平及各雜質(zhì)適量，用甲醇溶解并稀釋制成混合溶液。華而不實丁酸氯維地平質(zhì)量濃度為0.3mg/mL,各雜質(zhì)質(zhì)量濃度為0.003mg/mL,色譜圖見圖1.2.2.2強(qiáng)迫降解試驗〔1〕未降解試驗稱取丁酸氯維地平適量，用甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為1.5mg/mL的儲備液。量取2mL樣品儲備液于10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度；〔2〕酸降解試驗量取樣品儲備液2mL于10mL量瓶中，在室溫下，參加0.5mol/L鹽酸溶液0.5mL,立即用20%氫氧化鈉調(diào)pH值至中性，并用甲醇稀釋至刻度，同法做空白溶液；〔3〕堿降解試驗量取樣品儲備液2mL于10mL量瓶中，在室溫下，參加0.5mol/L氫氧化鈉溶液2滴，立即用20%鹽酸調(diào)pH值至中性，并用甲醇稀釋至刻度，同法做空白溶液；〔4〕氧化降解試驗量取樣品儲備液10mL于50mL圓底燒瓶中，加30%過氧化氫0.5mL,水浴90℃下加熱5min,放置至室溫，再定量轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，同法做空白溶液；〔5〕加熱降解試驗量取樣品儲備液10mL于50mL圓底燒瓶中，加熱回流4.5h,再放置至室溫，定量轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，同法做空白溶液；〔6〕光照降解試驗量取樣品儲備液2mL于10mL透明量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，于光照試驗箱〔4500500〕lx中放置16d,同法做空白溶液。從降解前后的物料平衡和色譜峰質(zhì)量分?jǐn)?shù)兩個方面考察降解試驗結(jié)果，見表1、2,圖譜見圖2.結(jié)果表示清楚：降解前后物料平衡結(jié)果在90%~110%,符合要求。在酸、堿條件下本品易水解為雜質(zhì)IV;在長時間光照情況下，易氧化為雜質(zhì)V,部分雜質(zhì)V經(jīng)水解可轉(zhuǎn)化為雜質(zhì)VII;故本品在保存及運輸經(jīng)過中應(yīng)避免與水和酸堿接觸，避光，密封保存。分別稱取丁酸氯維地平對照品以及雜質(zhì)I、III、IV、V對照品約15mg,置不同25mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度；然后各取0.5mL置同一100mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得1%儲備液〔混合〕；分別量取1%儲備液〔混合〕0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0mL于不同10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。再量取雜質(zhì)V溶液0.5mL置100mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得1%儲備液；分別量取1%儲備液0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、3.0mL于不同10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。上述溶液即為相應(yīng)質(zhì)量濃度的丁酸氯維地平以及雜質(zhì)I、III、IV、V溶液，取相應(yīng)質(zhì)量濃度的溶液20L進(jìn)樣，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3.2.4檢測限稱取丁酸氯維地平對照品、各雜質(zhì)適量，用甲醇溶解并逐步稀釋至信噪比3〔S/N3〕相對應(yīng)的質(zhì)量濃度，作為檢測限，結(jié)果見表4.2.5定量限分別稱取丁酸氯維地平對照品以及雜質(zhì)I、III、IV、V約15mg,置不同50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。將上述溶液分別逐步稀釋至信噪比10相對應(yīng)的質(zhì)量濃度。每份樣品進(jìn)樣20L,連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積值，結(jié)果其RSD值分別為1.89%、1.94%、1.56%、1.57%、1.38%.2.6回收率試驗分別精致細(xì)密稱取雜質(zhì)I、III、IV、V對照品15.08、15.10、15.08、15.14mg,置不同50mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度。分別取各雜質(zhì)對照品溶液0.5mL于同一50mL量瓶中，即得1%雜質(zhì)儲備液；取1%雜質(zhì)儲備液1mL于10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得0.1%雜質(zhì)對照溶液；稱取丁酸氯維地平原料藥〔批號130715〕約3mg,于10mL量瓶，用甲醇溶解并稀釋刻度，平行配制9份。分別參加1%雜質(zhì)儲備液0.8、1、1.2mL,各3份。分別取上述供試品溶液進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表示清楚，雜質(zhì)I、III、IV、V的平均回收率分別為101.62%、97.54%、110.24%、102.16%,RSD值分別為3.28%、1.68%、6.20%、6.41%〔n=9〕。雜質(zhì)IV回收率較高是由于丁酸氯維地平溶液不穩(wěn)定，在放置經(jīng)過中主成分易水解為雜質(zhì)IV.2.7精致細(xì)密度試驗稱取丁酸氯維地平〔批號130715〕3mg于10mL量瓶，按0.1%的雜質(zhì)限度〔雜質(zhì)質(zhì)量濃度為0.3g/mL〕參加雜質(zhì)I、III、IV、V,用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合溶液；將該混合溶液平行進(jìn)樣6次，進(jìn)樣20L,記錄色譜圖，計算各雜質(zhì)峰面積的RSD值，結(jié)果雜質(zhì)I、III、IV、V峰面積的RSD值分別為4.45%、0.004%、12.56%、0.003%.在不同時間由不同操作人員，按上述重復(fù)性試驗，同法配制混合溶液并進(jìn)樣，記錄色譜圖，計算各雜質(zhì)峰面積的RSD值，結(jié)果雜質(zhì)I、III、IV、V的峰面積的日間RSD值分別為4.08%、0.003%、10.17%、9.12%.2.8耐用性試驗通過考察不同批次色譜柱、檢測波長、柱溫的微小變化對混合溶液〔混合溶液使用2.2.2強(qiáng)迫降解試驗項下樣品+1%雜質(zhì)的溶液〕中各峰分離度的影響，并同時測定樣品〔批號130715〕+0.1%雜質(zhì)的供試品溶液〔該供試品溶液配制方式方法見2.7精致細(xì)密度項下混合溶液的配制方式方法。〕研究后表示清楚，雜質(zhì)V與丁酸氯維地平之間分離度不小于1.5,各峰之間分離度符合要求，并且在各微小變化情況下，雜質(zhì)總量都在0.5%左右，雜質(zhì)總量的RSD值為2.90%,雜質(zhì)個數(shù)沒有發(fā)生變化。2.9系統(tǒng)適用性試驗通過耐用性試驗結(jié)果可知，當(dāng)雜質(zhì)V與主峰的分離度較好時，其余雜質(zhì)之間及雜質(zhì)與主峰之間的分離度符合要求。故系統(tǒng)適用性試驗主要考察雜質(zhì)V與丁酸氯維地平之間的分離度。取雜質(zhì)V和丁酸氯維地平適量，用甲醇溶解并稀釋，制成含雜質(zhì)V0.009mg/mL、丁酸氯維地平0.3mg/mL的溶液，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果雜質(zhì)V與主峰分離度不小于1.5.2.10穩(wěn)定性試驗稱取丁酸氯維地平樣品〔批號130715〕適量，用甲醇溶解，制備0.3mg/mL溶液，分別于0、2、4、7、10、12、24h進(jìn)樣測定。結(jié)果表示清楚，氯維地平、雜質(zhì)IV、雜質(zhì)III質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為0.12%、97.15%、4.75%.雜質(zhì)IV在2h有所增加，表示清楚樣品溶液不穩(wěn)定，容易水解成雜質(zhì)IV,故樣品應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。2.11樣品測定取4批丁酸氯維地平原料藥樣品，精致細(xì)密稱定，加甲醇適量，振搖使溶解，制成0.3mg/mL丁酸氯維地平溶液，作為供試品溶液〔供試品溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用〕；精致細(xì)密量取供試品溶液1mL,置100mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照溶液；進(jìn)樣測定，用主成分1%本身對照法計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表5.3討論3.1流動相中水相的考察分別考察了不同pH值情況下測定混合樣品，結(jié)果顯示pH值對分離度和峰形影響較小；另外考察了在緩沖鹽和純水的條件下測定混合樣品，結(jié)果顯示不加緩沖鹽情況下分離度和峰形均較好，故選擇純水作為流動相中的水相。3.2柱溫的考察分別考察了不同柱溫〔30、35、40℃〕條件下測定混合樣品，結(jié)果顯示隨著柱溫的升高，雜質(zhì)I峰形變差，雜質(zhì)II、V與主峰之間分離度變小，且柱溫高影響色譜柱使用壽命，故選擇柱溫為30℃。3.3色譜柱的考察分別考察了不同廠家色譜柱〔ThermoScientificC18、AgelaVenusilXBPC18、CosmosilC18、WelchromC18〕測定混合樣品，結(jié)果顯示W(wǎng)elchromC18柱測定時雜質(zhì)與雜質(zhì)之間及雜質(zhì)與主峰之間分離度及峰形均較好。綜上所述，在已有對丁酸氯維地平原料藥的方式方法學(xué)研究中，文獻(xiàn)中采用的方式方法有的采用了緩沖鹽體系作為流動相，使用梯度洗脫，對色譜柱損耗較大，操作繁瑣；有的對重要雜質(zhì)研究不完善。本文在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，重新探索了