除草劑丁草胺對高產(chǎn)水稻土微生物群落功能多樣性的影響講義

會計學(xué)1除草劑丁草胺對高產(chǎn)水稻土微生物群落功能多樣性的影響講義目錄1.背景介紹2.材料和方法3.結(jié)果和分析4.結(jié)論第1頁/共26頁介紹1.丁草胺的概況：

丁草胺是亞洲生產(chǎn)和應(yīng)用最廣泛的除草劑，與乙草胺和草甘膦并稱我國三大除草劑，每年用量超過8000t，且呈持續(xù)增加的趨勢。丁草胺主要應(yīng)用于水稻田，對禾本科雜草有較好的防除效果，但由于使用量大，且直接毒土，不可避免地會在土壤和環(huán)境中殘留，破壞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，影響水稻產(chǎn)量。丁草胺在環(huán)境中的殘留污染主要有三種情況：一是丁草胺隨生產(chǎn)廢水、排灌水及降水的縱向淋溶和橫向擴(kuò)散會造成地表水和地下水的污染；二是丁草胺會對生態(tài)系統(tǒng)中的植物、動物和微生物產(chǎn)生不利影響，從而影響到整個生態(tài)系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)；三是丁草胺具有致突變性和遺傳毒性，能通過食物鏈和生物富集將毒性逐級傳遞并不斷擴(kuò)大，最終影響到人類健康。因此，丁草胺在生態(tài)環(huán)境中的安全性問題已經(jīng)逐漸引起人們的關(guān)注，深入了解丁草胺的環(huán)境生態(tài)效應(yīng)顯得極為重要。第2頁/共26頁2.高產(chǎn)水稻區(qū)概況：

云南永勝濤源鄉(xiāng)是保持我國水稻小面積超高產(chǎn)紀(jì)錄的特殊生態(tài)區(qū)，1983年常規(guī)稻“桂朝2號”在濤源創(chuàng)下畝產(chǎn)1075.4kg的全國高產(chǎn)紀(jì)錄，使我國首次實現(xiàn)單季水稻畝產(chǎn)超噸糧的突破；2001雜交稻“特優(yōu)175”驗收畝產(chǎn)達(dá)1185.5kg，超級稻“Ⅱ優(yōu)明86”驗收畝產(chǎn)達(dá)1196.5kg，雙雙打破印度畝產(chǎn)1184.8kg的世界水稻紀(jì)錄；從2004年到2006年，濤源連續(xù)三年創(chuàng)造1畝以上面積水稻單產(chǎn)突破1200kg大關(guān)的歷史性突破，“協(xié)優(yōu)107”畝產(chǎn)達(dá)1287kg。光照、溫度和當(dāng)?shù)貎?yōu)越的土壤微環(huán)境是造成濤源水稻頻頻高產(chǎn)的重要生態(tài)因素。濤源特殊生態(tài)區(qū)常年使用丁草胺作為水稻選擇性芽前除草劑，大量施用的除草劑究竟會對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)造成多大影響成為研究者關(guān)注的焦點。第3頁/共26頁

本試驗采用BIOLOGECO微平板，通過測定土壤微生物對單一碳源的利用能力和利用程度，研究不同濃度丁草胺對高產(chǎn)水稻土微生物群落功能多樣性的影響。BIOLOG碳素利用法是由美國BIOLOG公司于1989年開發(fā)成功的一種用于微生物純種鑒定的研究方法。BIOLOG方法的原理是：微生物在利用碳源的過程中會產(chǎn)生自由電子，自由電子可引起四唑鹽染料發(fā)生氧化還原顯色反應(yīng)，由于微生物對不同碳源的利用能力很大程度上取決于微生物的種類及其代謝活性，從而達(dá)到鑒定純種微生物或比較分析微生物群落結(jié)構(gòu)的目的。

ECO微平板是BIOLOG碳素利用法中以碳源利用能力為基礎(chǔ)的描述微生物群落功能特征的定量分析方法。ECO微平板共96個孔，每32孔為一組重復(fù)，包含1個對照孔和31個反應(yīng)孔。對照孔中加入水和指示劑，反應(yīng)孔分別加入31種單一碳源和指示劑。將微生物接種到ECO微平板后，各孔中微生物利用碳源底物，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使指示劑變色，然后根據(jù)反應(yīng)孔中顏色變化的吸光值來指示微生物對31種不同碳源的利用情況，得到土壤微生物特有的“代謝指紋”，從而反映微生物群落功能代謝能力的差異。此方法靈敏度高，無需分離培養(yǎng)純種微生物，可最大限度保留微生物群落的原有代謝特征，且操作簡便，數(shù)據(jù)量大，在研究空間及時間尺度上微生物群落變化方面得到廣泛應(yīng)用。研究思路：第4頁/共26頁材料和方法

1.供試藥品丁草胺，上海升聯(lián)化工有限公司生產(chǎn)，農(nóng)藥登記號：D20091403，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號：HG3292-2001，施用方法：藥土法。2.土壤含水量測定稱取30-40g（精確到0.01g）新鮮土樣置于培養(yǎng)皿中，放入110℃烘箱烘烤6h，取出稱重；之后重新放回烘箱繼續(xù)烘烤，每隔30min重復(fù)稱重一次，直至恒重，設(shè)置三個重復(fù)。土壤含水量計算公式為：其中，m0表示烘干前樣品重，g；m1表示烘干后樣品重，g。第5頁/共26頁3.丁草胺處理試驗設(shè)計

丁草胺的合理施用標(biāo)準(zhǔn)為有效成分濃度747-1278g/hm2（GB/T8321.1-2000），折算合0.216-0.370mg/kg干土，本研究取中間濃度0.30mg/kg干土作為100%推薦劑量。稱取相當(dāng)于500g干重的新鮮土樣，加入超純水使其含水量為田間最大持水量的60%，在室內(nèi)模擬條件下，添加以超純水稀釋的丁草胺，使其在土樣中的有效成分濃度分別為50%推薦劑量(0.15mg/kg，簡稱B15)、100%推薦劑量（0.30mg/kg，簡稱B30）和500%推薦劑量（1.5mg/kg，簡稱B150），攪拌均勻，另設(shè)不加丁草胺的處理為對照（0mg/kg，簡稱CK），每個處理3個重復(fù)。所有處理密封，置于恒溫培養(yǎng)箱（25±1℃）中避光培養(yǎng)，于藥劑處理后的7、15、30、45d取樣測定，每隔2-3d用差減法補(bǔ)充水分以調(diào)節(jié)含水量。第6頁/共26頁4.土壤微生物功能多樣性測定方法ECO微平板的測定方法參照Garland（1991），具體步驟為：①0.1mol/L磷酸緩沖液：KH2PO4/K2HPO4，pH7.0，分裝至250mL三角瓶中，每瓶90mL，121℃滅菌備用；②0.85%生理鹽水：NaCl8.5g，蒸餾水1000mL，分裝至玻璃試管，每管9mL，121℃滅菌備用；③稱取相當(dāng)于10g干土重的處理土樣，加入90mL0.1mol/L磷酸緩沖液中，180r/min振蕩30min，靜置10min；④取土壤浸出液上清1mL，加入9mL0.85%生理鹽水，混勻，梯度稀釋成10-3土壤菌懸液；⑤用移液器接種土壤菌懸液至ECO微平板，每孔150μL，每個樣品三個重復(fù)；⑥25℃恒溫培養(yǎng)箱溫育7d，在培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168h后用BIOLOG自動讀板儀讀取590nm波長下的吸光值。

第7頁/共26頁5.數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件處理，采用單因素（onewayANOVA）方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較（р＜0.05）。第8頁/共26頁3.數(shù)據(jù)處理

微生物代謝活性采用微平板每孔顏色平均變化率（AverageWellColorDevelopment，AWCD）描述，采用Shannon指數(shù)（Shannonindex）和Simpson指數(shù)（Simpsonindex）表征土壤微生物群落功能多樣性（表4-1）；使用SPSS17.0軟件處理AWCD值、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)計算結(jié)果，采用單因素（onewayANOVA）方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較（р＜0.05）。第9頁/共26頁結(jié)果與分析1.不同處理微生物群落代謝活性分析

第10頁/共26頁圖土壤微生物群落溫育過程中AWCD值的變化

施藥7d，B30的AWCD值明顯高于其它處理，其次為B15。B150和CK差別不明顯，說明中低劑量丁草胺可刺激微生物生長，高濃度丁草胺影響不顯著；各處理均在溫育72-120h期間表現(xiàn)出較強(qiáng)的碳源利用能力。第11頁/共26頁

施藥15d，B30仍然保持最強(qiáng)的代謝活性，B15在溫育96h后降至CK以下，B30在溫育168h時與CK持平，而B150始終保持相對較低的代謝狀況，說明隨著處理時間延長，中低濃度丁草胺對微生物的刺激作用逐漸消退，高濃度則表現(xiàn)出抑制作用；第12頁/共26頁

施藥30d，CK表現(xiàn)出對碳源最強(qiáng)的利用能力，溫育96h時，其AWCD值與B15和B30差異不明顯，但比B150高出40.5%，說明隨著農(nóng)藥的自然降解，中低濃度丁草胺的刺激作用已不存在，高濃度的抑制作用尚未解除；第13頁/共26頁

施藥45d，所有處理整體代謝活性無明顯差別，隨著溫育時間延長，B150碳源利用能力逐漸增強(qiáng)，說明高濃度丁草胺對微生物的抑制作用正逐漸消除。

第14頁/共26頁

施用丁草胺會改變高產(chǎn)水稻土微生物群落代謝活性，中低濃度對微生物有促生長作用，高濃度有抑制作用，隨著培養(yǎng)時間延長，促進(jìn)和抑制作用逐漸減緩，直至完全消失。小結(jié)：第15頁/共26頁2.不同處理微生物群落多樣性指數(shù)分析施藥7d，除B30的Shannon指數(shù)明顯偏高外，其余處理與CK均無顯著差異，說明100%推薦劑量可提高微生物碳源利用能力，與AWCD值分析結(jié)果一致。施藥15d，所有處理Shannon指數(shù)與CK均無顯著差異，丁草胺未表現(xiàn)出明顯影響。施藥30d，B150的Shannon指數(shù)首先顯著下降。施藥45d，B30也表現(xiàn)出Shannon指數(shù)顯著下降，據(jù)此趨勢推測，若繼續(xù)培養(yǎng)，B15的Shannon指數(shù)很可能也會下降。說明施用丁草胺會導(dǎo)致微生物群落可利用碳源種類數(shù)顯著下降，施藥濃度越高，發(fā)生微生物群落可利用碳源種類數(shù)減少所需時間越短。第16頁/共26頁施藥7d，除B30的Simpson指數(shù)明顯偏低外，其余處理與CK均無顯著差異，說明100%推薦劑量可提高微生物碳源利用能力，與AWCD值和Shannon指數(shù)分析結(jié)果一致。施藥15d，B150最早出現(xiàn)Simpson指數(shù)的明顯升高，與CK達(dá)到差異顯著，說明高濃度處理最早引起微生物碳源利用能力集中，可利用碳源種類數(shù)減少。施藥30d，B150的Simpson指數(shù)進(jìn)一步提高，比CK高出33.3%，達(dá)到差異顯著；而B30和B15與CK雖未達(dá)到差異顯著，但其Simpson指數(shù)也表現(xiàn)出升高的趨勢，比CK分別高出15.9%和11.6%。施藥45d，B30的Simpson指數(shù)與CK達(dá)到差異顯著，說明中等濃度處理也引起了微生物碳源利用能力集中。據(jù)此趨勢推測，若繼續(xù)培養(yǎng)，B15很可能也會引起微生物碳源利用能力集中。施用丁草胺會導(dǎo)致微生物群落碳源利用能力集中，施藥濃度越高，發(fā)生微生物群落碳源利用能力集中所需時間越短。第17頁/共26頁兩個多樣性指數(shù)分析結(jié)果均表明，施用丁草胺會對高產(chǎn)水稻土微生物群落碳源利用能力產(chǎn)生不利影響，施藥濃度是導(dǎo)致微生物群落碳源利用能力集中、可利用碳源種類數(shù)減少的直接原因，且施藥濃度越高，發(fā)生微生物群落碳源利用能力減弱所需時間越短。小結(jié)：第18頁/共26頁3.不同處理微生物碳源利用特征主成分因子分析施藥7d，主成分因子PC1和主成分因子PC2貢獻(xiàn)率分別為47.14%和32.36%，累計方差貢獻(xiàn)率79.50%；PC1能較好區(qū)分CK、B15和B30，PC2能較好區(qū)分CK和B15，說明施用丁草胺會造成高產(chǎn)水稻土微生物群落碳源利用能力的差別，B15和B30首先獲得響應(yīng)，考慮到PC1和PC2貢獻(xiàn)率不同，綜合評價應(yīng)為B30變化最顯著。第19頁/共26頁施藥15d，主成分因子PC1和主成分因子PC2貢獻(xiàn)率分別為47.71%和32.43%，累計方差貢獻(xiàn)率80.14%；PC1能較好地將三個農(nóng)藥處理與CK區(qū)分開，PC2能較好區(qū)分CK、B30和B150，說明隨培養(yǎng)時間延長，高濃度處理微生物碳源利用能力也開始發(fā)生改變，但不及中低濃度處理變化明顯。第20頁/共26頁施藥30d，主成分因子PC1和主成分因子PC2貢獻(xiàn)率分別為41.15%和29.92%，累計方差貢獻(xiàn)率71.06%；PC1能較好地將CK與其他三個處理區(qū)分開，PC2則只能明顯區(qū)分CK和B150，說明丁草胺對微生物碳源利用能力的影響仍存在，但中低濃度影響力開始減弱。第21頁/共26頁施藥45d，主成分因子PC1和主成分因子PC2貢獻(xiàn)率分別為41.38%和32.38%，累計方差貢獻(xiàn)率74.21%；PC1和PC2均能夠較好區(qū)分CK、B15和B150，而無法區(qū)分CK和B30。說明隨著丁草胺的自然降解，農(nóng)藥對土微生物碳源利用能力的影響逐漸消退。按此趨勢推測，若繼續(xù)培養(yǎng)，其它濃度處理微生物碳源利用能力也會逐漸恢復(fù)。第22頁/共26頁結(jié)論1）施用丁草胺會改變高產(chǎn)水稻土微生物群落代謝活性，中低濃度對微生物有促生長作用，高濃度有抑制作用，隨著培養(yǎng)時間延長，促進(jìn)和抑制作用逐漸減緩，直至完全消失。2）施用丁草胺會對高產(chǎn)水稻土微生物群落碳源利用能力產(chǎn)生不利影響，施藥濃度是導(dǎo)致微生物群落碳源利用能力集中、可利用碳源種類數(shù)減