基因診斷與基因治療

第二十一章基因診斷與基因治療1第一節(jié)基因診斷一、基因診斷的含義基因診斷（genediagnosis）亦稱分子診斷、DNA診斷。采用分子生物學(xué)的技術(shù)方法來分析受檢者的某一特定基因的結(jié)構(gòu)（DNA水平）或功能（RNA水平）是否異常，以此來對(duì)相應(yīng)的疾病進(jìn)行診斷。2二、基因診斷的原理及方法1基因診斷的原理

檢測(cè)相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)功能特別是RNA產(chǎn)物是否正常

2基因診斷的方法 （1）DNA診斷 （2）RNA診斷3（1）DNA診斷

1）限制性片段長度多態(tài)性2）等位基因特異的寡核苷酸探針雜交（allele-specificoligonucleotideprobe,ASOprobe） 3）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP） 4）DNA序列分析（2）RNA診斷1）RNA印跡（Northernblot）2)RT-PCR41）限制性片段長度多態(tài)性 —基因連鎖分析（1）方法原理：

待測(cè)DNA序列中的點(diǎn)突變導(dǎo)致了某一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變可引起其特異的限制性內(nèi)切酶片段的大小與多少隨之改變，即而通過Southern印跡雜交和限制性內(nèi)切酶酶譜分析診斷出點(diǎn)突變。56（2）診斷原理

在人群中，個(gè)體間DNA的核苷酸序列存在差異，稱為DNA多態(tài)性。DNA多態(tài)性可以改變限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)，產(chǎn)生DNA限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlenthpolymorphism,RFLP）。67

RFLP按照孟德爾方式遺傳，在某一特定家族中，如果某一種致病基因與特異的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可利用這一多態(tài)性片段作為一種遺傳性標(biāo)志來判斷家族成員或胎兒的基因組中是否攜帶致病基因。7889（2）應(yīng)用A

sickle-cellanemia的基因診斷a.

病因血紅蛋白中的β珠蛋白N端第6位氨基酸正常為谷氨酸，貧血時(shí)突變?yōu)轭R氨酸。9101234561011b.檢測(cè)限制性內(nèi)切切酶：Sau1酶切位點(diǎn)：：CCTNAGG探針：標(biāo)標(biāo)記的β珠珠蛋白1112c.結(jié)果分析切割正常待待測(cè)血紅蛋蛋白β珠蛋蛋白，DNA與探針針雜交后產(chǎn)產(chǎn)生1.1kb切割異常待待測(cè)血紅蛋蛋白β珠蛋蛋白，DNA與探針針雜交后產(chǎn)產(chǎn)生1.3kb121313141415（1）原理理根據(jù)已知的的基因突變變位點(diǎn)的核核苷酸序列列，人工合合成相應(yīng)于于突變基因因異常核核苷酸序列列的寡核苷苷酸作為雜雜交探針，，從而直接接檢測(cè)和鑒鑒定突變基基因。2）等位基基因特異性性寡核苷酸酸探針雜交交法（allelespecificoligonucleotide,ASO）1516相應(yīng)于突變變基因異常常相應(yīng)于正常?；蚝塑账嵝蛄辛械墓押塑哲蘸塑账嵝蛄辛械墓押塑哲针s交探針?biāo)犭s交探針針與受檢者DNA進(jìn)進(jìn)行分子雜雜交發(fā)生雜交均可雜交與異常不不發(fā)生雜交交(突變純和和子）（雜和子）與正常發(fā)生生雜交(正常純和和子）161717181）病因H-ras（（化學(xué)誘導(dǎo)導(dǎo)）ras家族族K-ras編碼P21蛋白N-ras（（自然然發(fā)生)ras家族族點(diǎn)突變好好發(fā)于12、13、61位位密碼子（2）應(yīng)用用——大腸癌K-ras的基因因診斷18192）檢測(cè)a、PCR擴(kuò)增用人工合成成的位于待待測(cè)點(diǎn)突變變兩側(cè)的引引物，分別別擴(kuò)增含12、13、及61位點(diǎn)的基基因片段。。1920b、ASO分析①將擴(kuò)增產(chǎn)物物結(jié)合在尼尼龍膜上分分別與ras原癌基基因密碼子子12、13、61所有可能能引起堿基基突變的寡寡核苷酸探探針進(jìn)行雜雜交；②②雜交后，膜膜經(jīng)嚴(yán)格的的洗滌，僅僅允許完全全相配的雜雜交雙鏈存存在；③針針結(jié)合處在在光膠片上上呈陽性斑斑點(diǎn)2021223）mRNA的檢測(cè)測(cè)（1）原理理通過對(duì)mRNA進(jìn)行行定量、檢檢測(cè)其剪剪接加工的的缺陷以及及外顯子變變異等判斷斷基因能否否轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄物（mRNA））是否正常常以及轉(zhuǎn)錄錄效率的高高低。2223*mRNA不穩(wěn)定可可將其轉(zhuǎn)為為cDNA再用PCR技術(shù)進(jìn)進(jìn)行研究（（RT-PCR）2324（2）應(yīng)用用視網(wǎng)膜母細(xì)細(xì)胞瘤：Rb基因缺缺陷Rb1基因因的mRNA全長4.7kb采用RT-PCR技術(shù)分析析外顯子突突變或mRNA前體體剪接異常常。2425分析外顯子子19至22間的基基因突變逆轉(zhuǎn)錄引物物：外顯子子22反義義鏈序列5`-GGTACCGTGGAAGCTTACTGCAAAT-3`PCR引物物:外外顯顯子22正正義鏈序列列5`-CCATGGGACCTTCGAATGACGTTTA-3`外顯子19正義鏈序序列5`-GAATTCGTATCTTTCTCCTGTAAGAT-3`2526用RT-PCR檢測(cè)測(cè)艾滋病26三、基因診診斷的應(yīng)用用1.遺傳傳疾病的診診斷產(chǎn)前診斷、、遺傳病易易感性2感染性性疾?。?）病毒毒性感染（2）細(xì)菌菌性感染（3）寄生生蟲（4）其他他273惡性腫腫瘤4法醫(yī)學(xué)學(xué)中應(yīng)用28（1）DNA指紋分分析（DNAfingerprinting）可變串聯(lián)重重復(fù)序列小衛(wèi)星DNA（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）29（2）短串串聯(lián)重復(fù)（（shorttandemrepeat,STR）多態(tài)性性分析微衛(wèi)星DNASTR—PCR30第二節(jié)基基因治療的的基本概念念和基本策略一基基因治療（（genetherapy）的概念念1、背景與與歷史疾病的分子子生物學(xué)了了解新技術(shù)新方方法（特別別是重組DNA）的的迅速發(fā)展展311989年年5月28日

第一一個(gè)基因標(biāo)標(biāo)記計(jì)劃（TIL-NeoR）1990年年9月11日第第一個(gè)基因因治療計(jì)劃劃（ADA-SCID）321995年年NIH組組織Orkin、、Motoksy對(duì)頭頭5年基因因治療評(píng)估估3點(diǎn)建議：：發(fā)展載體技術(shù)術(shù)疾病的分子機(jī)機(jī)制動(dòng)物模型成立3個(gè)國家家實(shí)驗(yàn)室2000年2月532個(gè)計(jì)劃，3400余個(gè)個(gè)病人33病種：惡性腫腫瘤62.2%遺傳性疾病13.3%AIDS6.8%心血管疾病6.8%其他1.3%342、定義基因角度：正正常或有功功能的基因置置換或增補(bǔ)缺陷陷基因。治療角度：新新的遺傳物物轉(zhuǎn)移到某個(gè)個(gè)體獲治療效果果。353、方式基因矯正和置置換:同源源重組基因增補(bǔ):ADA、、血友病基因封閉:myc基因因過度表達(dá)達(dá)，反義抑抑制活化前體藥物物基因治療：：36單純皰疹病毒毒胸腺嘧啶激激酶基因?qū)肽[瘤細(xì)胞合成HSV-TK無毒性的抗病病毒有有毒性的抗病病毒藥物（GCV）藥藥物（GCV三磷磷酸）細(xì)胞死亡374、導(dǎo)入方式式exvivo基基因轉(zhuǎn)移移invivo基基因轉(zhuǎn)移移38第三節(jié)基因因治療的條件件1、目的基因的種種類：細(xì)胞因子、缺缺陷基因、抑抑癌基因、受體基因391、目的基因的獲獲得方法1）真核基因組DNA文庫中中目目的基基因的克隆2）cDNA文庫庫中目的基因因的克克隆3）人工合成基因因片段4）PCR法篩選選擴(kuò)增目的基基因401、外源基因的要要求1）含信號(hào)肽的cDNA，序序列正正確確

2））必要的調(diào)控元元件（順式作作用元件件啟動(dòng)子子、增強(qiáng)子子、靜止子子）413）外源基因進(jìn)入入細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄錄，再再轉(zhuǎn)移至細(xì)細(xì)胞漿，間隔隔序列列（內(nèi)含含子），剪接接信號(hào)（（SA,SD）PolyA信號(hào)，核核內(nèi)內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子子4）翻譯的起始密密碼子、終止止密密碼子、內(nèi)核核糖體進(jìn)入位位點(diǎn)點(diǎn)（IRES）元件5）外源基因的丟丟失、失活、、甲基化化424、基因治療療的靶細(xì)胞（（targetcell）1）生殖細(xì)胞全世界受嚴(yán)格格控制2）體細(xì)細(xì)胞選擇的標(biāo)準(zhǔn)：：A、容易取出和移移植B、容易體外培養(yǎng)養(yǎng)C、目的基因高效效導(dǎo)入D、細(xì)胞壽命長43常用靶細(xì)胞；；自體、同同種異異體、異異種、、淋淋巴、骨骨髓、皮膚、、肝、肌、腫腫瘤細(xì)胞等4445基因?qū)氲姆椒绞剑篹xvivo——體外將基因?qū)?dǎo)入targetcell,然后將將此修飾過的的細(xì)胞胞回輸給病人人。Invivo——外源基因直接接導(dǎo)入體內(nèi)內(nèi)有關(guān)的的組織器官。。463、基因?qū)?dǎo)入（轉(zhuǎn)移））的工具與方方法。將外源基因或或DNA片斷斷導(dǎo)入宿主細(xì)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增增或表達(dá)，需需要有一個(gè)能能在該宿主細(xì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制制和表達(dá)的載載體（vector）來來攜帶。前者者與后者在體體外構(gòu)成重組組DNA分子子，然后導(dǎo)入入宿主細(xì)胞。471）非病毒方方法4849（一）磷酸鈣鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)磷酸鈣--DNA導(dǎo)入細(xì)胞吞噬體轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞器瞬時(shí)穩(wěn)穩(wěn)定外源基因存在在外外源源基因非特異異于染色體DNA外與與宿主主染色體DNA重組12小時(shí)內(nèi)表表達(dá)持續(xù)約3-4天降解穩(wěn)穩(wěn)定定轉(zhuǎn)化細(xì)胞株株50（二）DEAE-葡葡聚糖轉(zhuǎn)染技技術(shù)（略）51（三）脂質(zhì)體體轉(zhuǎn)染法（（20%）聚陽離子脂質(zhì)質(zhì)體-DNA脂質(zhì)體DNA陽離子復(fù)合合物負(fù)電荷的細(xì)胞胞膜吸收此復(fù)復(fù)合物（融合吸收））優(yōu)點(diǎn)：簡便、、低毒性、無無免疫原性、、無病毒產(chǎn)生、、化學(xué)成分已已知可大量商業(yè)供應(yīng)應(yīng)缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效效率低，短暫暫表達(dá)52（四）電穿孔孔轉(zhuǎn)染技術(shù)靶細(xì)胞（懸浮浮態(tài)）+外源源目的DNA電穿孔儀高高壓壓電脈沖靶細(xì)胞膜發(fā)生生瞬時(shí)可逆性性破裂形形成微孔外源目的DNA進(jìn)入靶細(xì)細(xì)胞53（五）基因槍槍技術(shù)電子發(fā)射裝置置或高壓氣流流金或鎢顆粒包包裹外源目的的DNA形成成“子彈”打入靶細(xì)胞54上述物理、化化學(xué)方法轉(zhuǎn)移移基因的缺缺點(diǎn)：1）轉(zhuǎn)移效率低，，多應(yīng)用于實(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)研研究2）維持時(shí)間短2、病毒方方法55在以基因治療療為目的的載載體系統(tǒng)中，，以病毒載體體最為常用，，其優(yōu)點(diǎn)：1）易于改造與操操作2）轉(zhuǎn)移效率高3）較高的靶靶細(xì)胞特異性性56病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)載體————用于具有分裂裂功能的細(xì)細(xì)胞中進(jìn)行行基因轉(zhuǎn)移與與表達(dá)57腺病毒(adenovirus)、腺相關(guān)病病毒(adeno-associated-virus—————用于非增殖性性細(xì)胞中進(jìn)行行基因轉(zhuǎn)移與與表達(dá)58（六）逆轉(zhuǎn)錄錄病毒載體1、逆轉(zhuǎn)錄病病毒的結(jié)構(gòu)由2條相同的的38S單鏈鏈RNA組成成2、逆轉(zhuǎn)錄病毒的的生活周期596061感染宿主細(xì)胞胞病毒基因組的的整和原病毒DNA的轉(zhuǎn)錄與翻翻譯逆轉(zhuǎn)錄病毒顆顆粒的釋放623、原病毒DNA的結(jié)構(gòu)構(gòu)特點(diǎn)63644、逆轉(zhuǎn)錄病病毒載體的構(gòu)構(gòu)建65665、包裝細(xì)胞胞系的構(gòu)建1）沒有包裝裝細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病毒載體體就不能裝配配成假病毒顆粒感染染靶細(xì)胞，完完成外源源基因的高效效轉(zhuǎn)移672）去除除莫洛尼氏小小鼠5’端含含有包裝信號(hào)號(hào)ψ一段序列列輔助病毒整和NIH3T3染色體形成包裝細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄編碼病毒毒結(jié)構(gòu)基因攜攜帶帶外源基因的的逆不能包裝成病病毒顆粒轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病病毒載體（含含有包裝信號(hào)號(hào)）導(dǎo)入該細(xì)細(xì)胞系提供病病毒結(jié)結(jié)構(gòu)基因提提供包包裝裝信號(hào)包裝成僅含有有外源目的基基因假病毒686、逆轉(zhuǎn)錄病病毒-包裝細(xì)細(xì)胞系的特特點(diǎn)1）感染增殖分裂裂的細(xì)胞2）轉(zhuǎn)移效率高3）有效整和、傳傳代4）宿主范圍廣（七）腺病毒毒載體1、腺病毒載載體的結(jié)構(gòu)6970713、腺病毒載載體的特點(diǎn)1）可感染非增殖殖分裂的細(xì)胞胞2）易于培養(yǎng)與儲(chǔ)儲(chǔ)存3）非整和4）可致免疫反應(yīng)應(yīng)（八）質(zhì)粒DNA直接接注射72基因治療的基基本過程73靶基因+載體體————重重組DNA分分子——————靶細(xì)胞—————病人人74舉例：細(xì)胞因子修飾飾腫瘤細(xì)胞降降低低其致瘤性性提高其免疫疫原性751、靶基因：細(xì)細(xì)胞因子（αα-TNF,IL-2,γ-IFN,等等）2載體體：逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病毒ψLTRgagpolenvLTR76逆轉(zhuǎn)錄病毒載載體PLN系系列：ψLTRNEOLTR773、包裝細(xì)細(xì)胞：PA317,包包裝為為病毒4、感染靶靶細(xì)胞5、在靶細(xì)細(xì)胞中表達(dá)基基因產(chǎn)物78基因治療的安安全性問題:2次事故靶向性、效、、基因整合位位點(diǎn)、表達(dá)調(diào)控控79基因敲除（knockout）與與基因添加（knockin）遺傳工程生物物中，一個(gè)正正?；蚩杀槐粠追N方式所改變方法1：正?；蛲耆换虻耐煌蛔兛截愃嫣鎿Q可以在沒有正正?；虻母筛蓴_下提供供突變基因活性的信信息80方法2正正常常基因徹底失失活應(yīng)用于獲得正正?；蛟谡w生物中的可能功功能的信息方法3一一個(gè)個(gè)突變基因加加入到基因組組最易進(jìn)行的遺遺傳工程8182轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的的概念用實(shí)驗(yàn)方法把把外源基因?qū)?dǎo)入動(dòng)物的受受精卵，再將將這一受精卵卵接種到借腹腹懷孕的寄養(yǎng)養(yǎng)雌性動(dòng)物（（fostermother）的的子宮內(nèi)，使使之發(fā)育繁殖殖，這時(shí)外源源基因與動(dòng)物物本身的基因因組整合，外外源基因就能能隨細(xì)胞分裂裂而增殖，再再體內(nèi)表達(dá)，，并傳給下一一代，這樣生生育的動(dòng)物稱稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物8384小鼠基因置換換過程的總結(jié)結(jié)8586動(dòng)物藥廠的基基本概念87889、靜靜夜夜四四無無鄰鄰，，荒荒居居舊舊業(yè)業(yè)貧貧。。。。1月月-231月月-23Sunday,January1,202310、雨雨中中黃黃葉葉樹樹，，燈燈下下白白頭頭人人。。。。13:54:0713:54:0713:541/1/20231:54:07PM11、以我獨(dú)沈久久，愧君相見見頻。。1月-2313:54:0713:54Jan-2301-Jan-2312、故故人人江江海海別別，，幾幾度度隔隔山山川川。。。。13:54:0713:54:0713:54Sunday,January1,202313、乍見見翻疑疑夢(mèng)，，相悲悲各問問年。。。1月-231月-2313:54:0713:54:07January1,202314、他鄉(xiāng)生生白發(fā)，，舊國見見青山。。。01一一月20231:54:07下午午13:54:071月-2315、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。。一月月231:54下下午午1月月-2313:54January1,202316、行行動(dòng)動(dòng)出出成成果果，，工工作作出出財(cái)財(cái)富富。。。。2023/1/113:54:0713:54:0701January202317、做前，，能夠環(huán)環(huán)視四周周；做時(shí)時(shí)，你只只能或者者最好沿沿著以腳腳為起點(diǎn)點(diǎn)的射線線向前。。。1:54:07下午午1:54下午午13:54:071月-239、沒有失敗敗，只有暫暫時(shí)停止成成功！。1月-231月-23Sunday,January1,202310、很多事情努努力了未必有有結(jié)果，但是是不努力卻什什么改變也沒沒有。。13:54:0713:54:0713:541/1/20231:54:08PM11、成成功功就就是是日日復(fù)復(fù)一一日日那那一一點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)小小小小努努力力的的積積累累。。。。1月月-2313:54:0813:54Jan-2301-Jan-2312、世間成事事，不求其其絕對(duì)圓滿滿，留一份份不足，可可得無限完完美。。13:54:0813:54:0813:54Sunday,January1,202313、不知香積寺寺，數(shù)里入云云峰。。1月-231月-2313:54:0813:54:08January1,202314、意志堅(jiān)強(qiáng)的的人能把世界界放在手中像像泥塊一樣任任意揉捏。01一月20231:54:08下午13:54:081月-2315、楚塞三三湘接，，荊門九九派通。。。。一月231:54下午午1月-2313:54January1,202316、少年十十五二十十時(shí)，步步行奪得得胡馬騎騎。。2023/1/113:54:0813:54:0801January202317、空山新雨后后，天氣晚來來秋。。1:54:08下午1:54下下午13:54:081月-239、楊柳柳散和和風(fēng)，，青山山澹吾吾慮。。。1月-231月-23Sunday,January1,2