基因工程常規(guī)技術(shù)核酸提取純化

基因工程常規(guī)技術(shù)核酸提取純化1第一頁，共七十一頁，2022年，8月28日第4章

基因工程常規(guī)技術(shù)第二頁，共七十一頁，2022年，8月28日由于提取DNA的目的、種類、所用的生物、組織材料、實驗條件等不同，DNA的提純有很多方法。其中最常用的是堿抽提法DNA的提取與純化3第三頁，共七十一頁，2022年，8月28日一、質(zhì)粒DNA的提取

較為常用的有堿抽提法、煮沸法和去污劑裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（<15kb）,去污劑法比較溫和，一般用于分離大質(zhì)粒。4第四頁，共七十一頁，2022年，8月28日plasmidDNAGenomicDNA5第五頁，共七十一頁，2022年，8月28日大腸桿菌基因組DNA6第六頁，共七十一頁，2022年，8月28日分離方法的原理：質(zhì)粒DNA與細(xì)菌DNA物理性質(zhì)上的一些差異，其中最明顯的是分子大小。最大的質(zhì)粒是大腸桿菌染色體的8％，絕大多數(shù)質(zhì)粒遠遠小于它7第七頁，共七十一頁，2022年，8月28日閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會分離，復(fù)性快。原理DNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強堿中性1.堿抽提法提取質(zhì)粒DNA8第八頁，共七十一頁，2022年，8月28日染色體線性DNA或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。變性9第九頁，共七十一頁，2022年，8月28日菌液收集及裂解細(xì)菌收集通過離心進行，不同的質(zhì)粒拷貝數(shù)，菌液的需求量不同。10第十頁，共七十一頁，2022年，8月28日細(xì)菌的裂解是在堿性環(huán)境下進行的，不同的宿主菌細(xì)胞壁厚薄有差異：革蘭氏陽性菌——不用特殊處理，堿裂解即可有效破壁革蘭氏陰性菌——溶菌酶酵母和絲狀真菌——破壁酶或玻璃珠研磨11第十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日所用的試劑作用①溶菌酶能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1，4糖苷鍵。在堿性條件（pH>8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械力（震蕩）的作用而降解。12第十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日③EDTAMg2+、Ca2+的螯合劑，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：強堿，提供pH>12的堿性條件，使DNA雙鏈變性。SDS：溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成“蛋白-SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括DNA酶）變性沉淀。13第十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日冰醋酸把醋酸鉀溶液的pH調(diào)到4.8。用來中和NaOH變性液，使DNA復(fù)性。高濃度的NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥乙醇DNA分子以水合狀態(tài)“溶于”水里，乙醇能奪去DNA分子的水環(huán)境。⑤KAc-HAc緩沖液14第十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE緩沖液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金屬離子（不同于磷酸緩沖液或硼酸緩沖液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。15第十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日蛋白變性劑，進一步抽提DNA溶液中的蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀。但苯酚會殘留在DNA溶液中。（現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化DNA)。⑨酚-氯仿選用以上試劑有商業(yè)試劑盒；也可以自己配制。16第十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解細(xì)菌細(xì)胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA一次配置100ml，滅菌后4度保存。17第十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日溶液II破壞細(xì)胞膜，蛋白質(zhì)和DNA變性。第二步：破膜，蛋白質(zhì)和DNA變性SolutionII的配制(現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫使用)：第三步：中和溶液III使DNA復(fù)性、并促使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物和染色體DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M乙酸鉀（用冰乙酸調(diào)pH至4.8）18第十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日上清液中含有閉合質(zhì)粒DNA。第四步：離心除去沉淀0.6倍體積的異丙醇或2倍體積的無水乙醇。第五步：純化DNA上清液過柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA19第十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.使用試劑盒提取質(zhì)粒DNA市售的質(zhì)粒提取試劑盒大都采用堿抽提法，不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材料。20第二十頁，共七十一頁，2022年，8月28日原理：在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上，然后用低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來。得到的質(zhì)?？梢杂糜诿盖?、PCR、測序、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)下游實驗。21第二十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日天根生化質(zhì)粒提取試劑盒提取流程22第二十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日23第二十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日最重要的是：菌株的遺傳背景，質(zhì)粒自身的拷貝數(shù)。一般要使用endA基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。（1）受體菌株endA基因編碼核酸內(nèi)切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可將雙鏈DNA消化成7bp的寡核苷酸片斷。影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素24第二十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日這是直接決定DNA產(chǎn)量的重要因素之一。（3）質(zhì)粒大小分子量大的質(zhì)粒，拷貝數(shù)少。（2）質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)粒本身的性質(zhì)所決定。25第二十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日若干常用質(zhì)粒的理論產(chǎn)量質(zhì)粒名分子大小bp拷貝數(shù)質(zhì)粒產(chǎn)量g/mlpGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.1226第二十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日一般過程及原理：1.細(xì)菌基因組DNA的制備（1）細(xì)胞裂解物理方法：以機械力的方法打破細(xì)胞外的屏障化學(xué)方法：將細(xì)胞暴露在能夠?qū)?xì)胞整體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響的化學(xué)藥物中，包括一種能夠攻擊細(xì)胞壁的成分和一種能夠除去細(xì)胞膜的成分常用于大腸桿菌的裂解液成分：10%SDS、EDTA和溶菌酶二、基因組DNA的提取27第二十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日（2）DNA純化細(xì)菌提取物包含：DNA;大量的蛋白質(zhì)和RNA（屬于多余成分）去蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法：加入苯酚;或1:1的苯酚與氯仿的混合物。原理：能沉淀出蛋白質(zhì)但仍保留核酸(DNA和RNA)在水溶液中。28第二十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日結(jié)果：細(xì)胞提取物和有機溶劑逐漸混合并離心后，沉淀出的蛋白質(zhì)分子會聚集在水溶液和有機溶劑分層的兩相界面處形成白色的凝集物,水溶液中的核酸分子就能夠用吸管分離出來。29第二十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日30第三十頁，共七十一頁，2022年，8月28日一些RNA分子，特別是mRNA，會在苯酚處理過程中被除去，但是絕大多數(shù)的RNA都和DNA一起保留在水溶液中。最有效的除去RNA的方法：

使用核糖核酸酶，它能夠迅速降解RNA分子，把它們變成單核苷酸31第三十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日常用：無水乙醇、異丙醇乙醇沉淀法的額外優(yōu)點是將短鏈和單體核酸成分留在了溶液中。核糖核酸酶處理產(chǎn)生的核苷酸因此在這一步得到了去除。（3）沉淀DNA32第三十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日33第三十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日34第三十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日一般過程及原理：動物組織剪成小塊，勻漿或置液氮中凍結(jié)后研磨成細(xì)粉末。組織培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）組織粉碎2.哺乳動物細(xì)胞基因組DNA的抽提35第三十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC溫育。（2）細(xì)胞裂解（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。SDS是離子型去垢劑（detergent），可以使細(xì)胞膜崩解。（5）除去RNA污染RNase。無水乙醇（可以加入1/10體積的3M乙酸銨輔助沉淀）異丙醇（4）沉淀DNA36第三十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日一般過程及原理：（1）組織粉碎用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉末。3.從植物組織中制備DNA（2）細(xì)胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化銨/2巰基乙醇）?；?%SDS和蛋白酶K。65oC溫育1h左右。2%CTAB抽提緩沖液：CTAB10g；5MNaCl140ml；0.5MEDTA25ml；1MTris-Cl（pH8.0）50ml；加ddH2O定容至500ml。37第三十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日用0.6倍體積的異丙醇（3）純化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白質(zhì)污染。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10體積的3M醋酸氨輔助沉淀）。38第三十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日三、噬菌體DNA的提取

噬菌體DNA一般都是從噬菌體顆粒中制得，不從被侵染細(xì)胞中制得，因此不存在被細(xì)菌DNA污染的問題。但除去噬菌體衣殼過程中需要用到專門技術(shù)。一個例外：M13噬菌體的雙鏈復(fù)制模式，像細(xì)菌質(zhì)粒一樣，M13噬菌體DNA也能夠從被侵染的大腸桿菌中獲得。39第三十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日噬菌體顆粒能夠從被侵染細(xì)菌的細(xì)胞外培養(yǎng)基中大量獲得。當(dāng)這樣的培養(yǎng)物被離心時，細(xì)菌聚集成小球沉淀在離心管的底部，把噬菌體顆粒留在了懸液中,噬菌體顆粒接著被從懸液中收集起來。噬菌體DNA需要經(jīng)過一個去除蛋白的步驟以除去蛋白衣殼后才能夠得到。40第四十頁，共七十一頁，2022年，8月28日41第四十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日溶源性λ噬菌體的制備：被侵染培養(yǎng)物主要是由含有已經(jīng)整合到細(xì)菌染色體的前噬菌體的細(xì)胞所組成，在這種環(huán)境下，細(xì)胞外的λ噬菌體濃度非常低。為了得到高產(chǎn)量的細(xì)胞外λ噬菌體，培養(yǎng)物必須被誘導(dǎo)，以使所有細(xì)菌進入侵染循環(huán)中的溶解階段，導(dǎo)致細(xì)胞死亡并將λ噬菌體顆粒釋放到培養(yǎng)基中1.λ噬菌體DNA的抽提42第四十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日43第四十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日非溶源性λ噬菌體的制備絕大多數(shù)的噬菌體都是溶源性噬菌體，但很多源自λ噬菌體的克隆載體都經(jīng)過了改造，切除了一些基因以消除細(xì)菌的溶源性。因此這些噬菌體就不能夠整合到細(xì)菌基因組中，并且只能夠通過細(xì)菌溶解循環(huán)來侵染細(xì)胞。44第四十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日存在的問題：噬菌體在細(xì)胞分裂達到其最大分裂速度之前加入，所有細(xì)胞都會立刻溶解，這樣得到的噬菌體濃度非常低。另一方面，如果細(xì)胞密度太高的情況下加入噬菌體，培養(yǎng)物不能夠徹底溶解，所得的噬菌體濃度也比較低。45第四十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日46第四十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日噬菌體顆粒在上清液中一般過程及原理：（1）離心收集噬菌體顆粒（2）聚乙二醇(PEG)沉淀噬菌體顆粒聚乙二醇是一種長鏈多聚化合物，在鹽存在下，能夠吸收水分，使像噬菌體顆粒這樣的大分子聚集沉淀（3）重懸噬菌體顆粒收集并在一個適當(dāng)?shù)男◇w積中重新溶解47第四十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日（4）CsCl密度梯度離心48第四十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日（5）透析除去CsCl49第四十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日（6）除去蛋白質(zhì)有機溶劑法、酶法（7）沉淀DNA無水乙醇、異丙醇50第五十頁，共七十一頁，2022年，8月28日2.M13噬菌體DNA的抽提被侵染培養(yǎng)物的生長；離心沉淀細(xì)菌；PEG沉淀噬菌體顆粒；苯酚抽提分離噬菌體蛋白外殼；乙醇沉淀濃縮制得DNA。一般過程及原理：51第五十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日52第五十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日1.紫外光譜法DNA（或RNA）在260nm波長處有特異的紫外吸收峰。用微量比色杯（10l）在紫外分光光度計直接測定。原理：蛋白質(zhì)在280nm處有吸收峰四、DNA的定量和純度測定53第五十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日54第五十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日溴化乙錠（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能發(fā)紅色熒光。2.瓊脂糖凝膠電泳估計原理：與已知濃度的DNA電泳帶熒光強度對比，就可以估計出DNA含量。55第五十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日一般使用瓊脂糖凝膠電泳，與已知分子量的DNA標(biāo)準(zhǔn)混合液對比得知。DNA分子量Marker有許多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。五、DNA分子量的估計MarkerMarker56第五十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日DNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarker57第五十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日58第五十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日總RNA的提取與純化

不同豐度組織名稱樣品量總RNA含量高豐度肝臟1mg2-4μg脾臟1mg心臟1mg中豐度大腦1mg0.05-2μg胚胎1mg腎臟1mg肺1mg低豐度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高豐度成纖細(xì)胞1050.5-1μg人白細(xì)胞105中豐度酵母1050.5-1.5μg擬南芥葉片1mg0.2-0.5μg低豐度煙草葉片1mg0.05-0.1μg玉米葉片1mgRNA分布59第五十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日RNA提取注意事項制備RNA的關(guān)鍵—防止內(nèi)外源RNase的作用RNase的特點：抗酸抗堿,具很廣pH作用范圍;

抗高溫嚴(yán)寒(0-65℃均具活性）

抗變性劑60第六十頁，共七十一頁，2022年，8月28日RNA提取注意事項體內(nèi)RNase樣品取材要新鮮，并且在液氮或-70℃冰箱中凍存。RNA提取試劑的選擇，TRIzolReagent或試劑盒。勻漿器或是研缽；破碎細(xì)胞要快速；盡量在低溫下進行。體外RNase空氣中的RNase試劑中帶有的RNase實驗耗材實驗者本身61第六十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日解決辦法：

外源RNase—高溫，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理所有溶液，（Tris·HCl除外）和器皿，操作者帶手套

內(nèi)源RNase—高溫抽提，強蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶K等

62第六十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日DEPC有刺激性，對眼睛氣道粘膜有強刺激，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進行，DEPC毒性并不是很強，但吸入的毒性是最強的，使用時戴口罩，不小心占到手上注意立即沖洗。高溫高壓121℃，15min，DEPC即降解成二氧化碳和水63第六十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日總RNA的提取與純化

一般流程：

1、樣本前處理2、細(xì)胞裂解釋放RNA

3、RNA的純化及獲得4、RNA質(zhì)量檢測

64第六十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日樣品前處理新鮮血液，不超過4小時新鮮的幼嫩組織生長旺盛期的細(xì)胞生長旺盛的新鮮組織65第六十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日細(xì)胞裂解釋放RNA異硫氰酸胍/酚－TRIzol總RNA提取試劑胍鹽/β-巰基乙醇—RNAprep系列RNA提取試劑盒獨特配方--RNApla