茄子NAC1轉(zhuǎn)錄因子的分離及表達(dá)研究,園藝學(xué)論文

茄子NAC1轉(zhuǎn)錄因子的分離及表達(dá)研究,園藝學(xué)論文NAC〔NAM、ATAF和CUC〕轉(zhuǎn)錄因子是高等植物特有的一類(lèi)數(shù)量較多的轉(zhuǎn)錄因子，其N(xiāo)端都包含一段約150個(gè)氨基酸殘基的保守序列，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、器官建成、脅迫應(yīng)答以及品質(zhì)改進(jìn)經(jīng)過(guò)中發(fā)揮著重要作用〔邵鳳霞等，2008〕，已成為當(dāng)下植物基因功能及表示出網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究中的熱門(mén)〔Zhengetal.，2018〕。第一個(gè)NAC基因NAM是Souer等在1996年從矮牽牛中克隆到的〔Soueretal.，1996〕，隨后1997年Aida等〔1997〕在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了NAM、CUC2和ATAF1/2等3種基因，CUC2功能類(lèi)似于NAM，與植物的發(fā)育相關(guān)；ATAF1/2的功能與植物逆境應(yīng)答相關(guān)。當(dāng)前研究表示清楚：NAC轉(zhuǎn)錄因子在水稻基因組中有151個(gè)成員，煙草〔Rushtonetal.，2008〕和大豆〔Leetal.，2018〕中均有152個(gè)，擬南芥中有117個(gè)〔邢國(guó)芳等，2020〕。李雪林等〔2018〕根據(jù)水稻的SNAC1是抗逆性轉(zhuǎn)錄因子〔Huetal.，2006〕，且在非生物逆境脅迫〔干旱、鹽漬〕下SNAC1的表示出能夠提高抗逆性，將其導(dǎo)入棉花后通過(guò)NaCl脅迫挑選出了棉花轉(zhuǎn)化體系。李鵬〔2018〕研究了棉花中多種NAC基因及其受各種脅迫時(shí)的表示出，發(fā)現(xiàn)GhNAC1在棉花纖維中特異表示出，其它NAC轉(zhuǎn)錄因子在各個(gè)組織中均有表示出，且GhNAC12明顯受低溫脅迫的誘導(dǎo)，GhNAC20明顯受低溫、高鹽和PEG處理誘導(dǎo)，GhNAC16主要對(duì)高鹽處理敏感。玉米ZmNAC1能夠被低溫、PEG、高鹽和ABA誘導(dǎo)〔柳展基等，2018〕。細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌侵染辣椒后CaNAC1被快速誘導(dǎo)，而在非寄主病菌侵染與抗病信號(hào)分子SA和ET處理辣椒后CaNAC1的誘導(dǎo)表示出也很強(qiáng)烈〔Ohetal.，2005〕。在中國(guó)北方地區(qū)，設(shè)施栽培中的低溫弱光是生產(chǎn)中最大的限制因素〔閆世江等，2018〕，土壤次生鹽漬化也較為嚴(yán)重〔史慶華等，2004；張海軍等，2020〕。茄子〔SolanummelongenaL.，2n=2x=24〕是設(shè)施栽培的主要蔬菜，當(dāng)前關(guān)于茄子耐寒性〔高志奎等，2000；任國(guó)三等，2007；王鋒，2008〕、耐鹽性〔吳雪霞等，2018，2018〕已有一些報(bào)道，但主要是研究其對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)過(guò)中生理指標(biāo)的影響，而有關(guān)茄子抗逆性基因分子育種的研究較少。作者從茄子中分離鑒定出NAC1轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)，對(duì)其在逆境脅迫下時(shí)空表示出形式做出初步分析，以期為茄子抗逆性分子育種奠定基礎(chǔ)。1、材料與方式方法1.1材料及其處理選用北京農(nóng)學(xué)院蔬菜育種課題組選育茄子品系ETC01，于2020年7月中旬播種于塑料大棚，待幼苗長(zhǎng)出2~3片真葉時(shí)摘取所有幼苗葉片，混合后每份1g，用錫紙包成若干份，液氮速凍，置于80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?020年6月中旬將茄子種子播種于直徑15cm的營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)，營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)為草炭︰蛭石=1︰1〔體積比〕。營(yíng)養(yǎng)缽放置于北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)到2~3片真葉時(shí)進(jìn)行不同因素處理。〔1〕配制濃度50mgL-1GA溶液，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中參加200mL；〔2〕低溫4℃處理，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中參加200mL蒸餾水后將整個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽置于4℃的培養(yǎng)箱中；〔3〕配制濃度為20gL-1的NaCl溶液，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中參加200mL。每個(gè)因素處理3個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽〔每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽20~25株幼苗〕，在0~12h內(nèi)定時(shí)取各處理的根、莖、葉樣品，液氮速凍，置于80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。各處理均設(shè)參加200mL蒸餾水的1個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽〔20~25株幼苗〕作為處理0h的對(duì)照。1.2SmNAC1序列克隆采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒〔上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司〕提取茄子總RNA，用DNaseⅠ〔TaKaRa〕去除總RNA中基因組DNA的污染，用RW1〔博邁德〕去除總RNA中的蛋白污染，最后用Thermo公司的NANODROP2000檢測(cè)其濃度并采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完好性。以提取的總RNA為模板合成cDNA，cDNA合成體系的總體積為20L，反響經(jīng)過(guò)為：總RNA和10molL-1Oligo〔dT〕18混合液于70℃水浴10min；然后參加ReverseTranscriptaseM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶〔200UL-1〕、dNTP〔10mmolL-1〕、RNaseInhibitor〔40UL-1〕及滅菌的雙蒸水，置于42℃保溫60min，后于70℃變性15min，最后存于20℃冰箱作為基因擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光定量PCR〔Real-timequantitativePCR，RT-qPCR〕的模板備用。在NCBI中搜索，根據(jù)GenBank中已頒布的辣椒NAC〔AY714222〕、甘藍(lán)型油菜NAC1〔AY245879〕、番茄NAC〔AY573802〕、番茄NAC1〔NP_001234482.1〕設(shè)計(jì)兼并引物擴(kuò)增SmNAC1的保守區(qū)。上游S1：CAYCCDACKGAYGAAGA，下游A1：TTCTTSTTGTADATTCGACA。采用Clontech的SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit分別克隆SmNAC1的3端和5端序列，用PrimerPrimier5.0設(shè)計(jì)特異引物3S：GCTGGAAAAGCACCAAGAGGAAT和5A：GGTTCCTGCTGCTCGGTTCGGC；UPM通用引物L(fēng)ong：5-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，Short：5-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，由RACE擴(kuò)增試劑盒提供。94℃預(yù)變性4min；94℃30s，72℃3min，5個(gè)循環(huán)；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5個(gè)循環(huán)；94℃30s，68℃30s，72℃3min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。利用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒〔上海生工〕將擴(kuò)增產(chǎn)物回收，凝膠電泳檢測(cè)后，用北京全式金生物技術(shù)公司pEASY-T3CloningKit連接，轉(zhuǎn)化于Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑挑選，經(jīng)菌液PCR初步鑒定后送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。最后根據(jù)DNAMAN軟件拼接序列獲得茄子SmNAC1全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)拼接出的序列利用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)特異性引物QS：AAAATAAACAGCGAAGAGAGA；QA：CTACACCAAAAAACCAAGAAA擴(kuò)增SmNAC1全長(zhǎng)，同樣將擴(kuò)增產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、挑選后送測(cè)序。1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBRGreen熒光染料法，用CFX96〔Bio-Rad〕實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)SmNAC1在不同處理下的時(shí)空表示出進(jìn)行檢測(cè)分析〔FickoCernelc，2005〕。擴(kuò)增目的基因SmNAC1的上游引物SmNAC1-S：CTTGAGGCTTGATGAATGG和下游引物SmNAC1-A：GTGGTAATTGTGTGGGTAAA。茄子內(nèi)參基因〔宋琴，2018〕Sm-ACTIN〔GenBank登錄號(hào)：GU984779〕的引物Sm-S：GTCGGAATGGGACAGAAGG；Sm-A：CAGTCAGGAGAACAGGGTG。根據(jù)寶生物公司試劑盒RealMasterMix〔SYBRGreen〕PCR操作步驟進(jìn)行，將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA分別進(jìn)行梯度稀釋〔1、1︰10、1︰100、1︰1000、1︰100000〕進(jìn)行熒光定量PCR反響，繪制相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)樣cDNA和待測(cè)樣均設(shè)3次重復(fù)。RT-qPCR擴(kuò)增的反響體系為20L，包括10LRealMasterMix混合液、2LcDNA、0.5LSmNAC1-F〔10molL-1〕、0.5LSmNAC1-R〔10molL-1〕、7LddH2O。反響程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min，94℃變性20s，53℃退火25s，72℃延伸20s，每次循環(huán)第3步進(jìn)行熒光采集，40次循環(huán)。內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增的反響體系為20L：10LRealMasterMix混合液、2LcDNA、0.5LSm-S〔10molL-1〕、0.5LSm-A〔10molL-1〕、7LddH2O。其反響程序與SmNAC1的反響程序一樣。2、結(jié)果與分析2.1SmNAC1序列的獲得對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行回收、克隆、鑒定后測(cè)序，得到長(zhǎng)426bp的中間序列，Blast在線(xiàn)比照后初步證實(shí)是NAC基因家族，含有NAC家族保守構(gòu)造域。根據(jù)上述保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物，最終獲得794bp長(zhǎng)的3端cDNA片段序列〔圖1，a〕、長(zhǎng)396bp的5端cDNA片段〔圖1，b〕。利用引物QS和QA特異性擴(kuò)增出茄子SmNAC1全長(zhǎng)基因〔圖1，c〕，測(cè)序結(jié)果顯示cDNA全長(zhǎng)序列為1279bp，NCBI在線(xiàn)分析同源性后，命名該基由于SmNAC1〔登錄號(hào)：KF668813〕。該基因含有1個(gè)編碼302個(gè)氨基酸的完好開(kāi)放閱讀框，序列如此圖2，起始密碼子ATG位于124bp，終止子TAG位于1032bp處。利用DNAMAN揣測(cè)氨基酸序列與其他物種NAC家族序列進(jìn)行多重序列比對(duì)〔圖3〕：茄子SmNAC1含有NAC家族共有特點(diǎn)，即N端都包含一段保守的氨基酸序列，約150個(gè)氨基酸殘基，保守域包含A、B、C、D、E等5個(gè)亞構(gòu)造域。2.2SmNAC1蛋白的序列分析及構(gòu)造預(yù)測(cè)Protparam在線(xiàn)分析顯示：茄子SmNAC1蛋白由20種基本的氨基酸組成，其分子式為C1570H2376N430O461S12，華而不實(shí)含量最高的氨基酸是Lys〔7.6%〕、Pro〔7.6%〕，含量最低的氨基酸是Cys〔1.3%〕，酸性氨基酸〔Asp+Glu〕總數(shù)為38個(gè)，堿性氨基酸〔Arg+Lys〕總數(shù)為40個(gè)，預(yù)測(cè)相對(duì)分子量約為35.04kD，理論等電點(diǎn)為8.18，總平均親水性〔GRAVY〕為0.858，不穩(wěn)定指數(shù)37.02，揣測(cè)其屬于穩(wěn)定蛋白。利用NPSA中的MLRC方式方法預(yù)測(cè)其二級(jí)構(gòu)造：SmNAC1蛋白包含有63處螺旋〔Alphahelix〕，占20.86%，41處延伸鏈〔Extendedstrand〕，占13.58%；198處無(wú)規(guī)則卷曲〔Randomcoil〕，占65.56%。運(yùn)用TMHMMServerv.2.0預(yù)測(cè)此蛋白無(wú)跨膜區(qū)域，PSORTWWWServer中PSORTPrediction工具預(yù)測(cè)細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中。在蛋白質(zhì)構(gòu)造數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到其同源模型，利用網(wǎng)站Expasy中SwissModel程序同源建模，揣測(cè)蛋白的三維構(gòu)造模型如此圖4。2.3SmNAC1與其他物種NAC的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析將SmNAC1蛋白序列通過(guò)NCBI中BLAST在線(xiàn)分析同源性，結(jié)果表示清楚SmNAC1與番茄NAC1〔NP_001234482.1〕、馬鈴薯〔CAC42087.1〕、番茄NAC2〔ADL60119.1〕、甜椒〔AAW48094.1〕、煙草〔ADQ08688.1〕的同源性分別為90%、90%、89%、84%和82%。進(jìn)一步通過(guò)DNAMAN軟件將SmNAC1與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)登錄的14種NAC氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)〔圖5〕，可見(jiàn)茄子SmNAC1與番茄、馬鈴薯、煙草親緣關(guān)系近期，與擬南芥ATAF2在進(jìn)化上有一樣的起源，與矮牽牛、擬南芥CUC2、CUC1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，揣測(cè)茄子SmNAC1同樣具有ATAF2與植物逆境應(yīng)答相關(guān)的功能。2.4SmNAC1在不同處理下的時(shí)空表示出分析通過(guò)RT-qPCR對(duì)內(nèi)參基因引物〔Sm-S、Sm-A〕和SmNAC1基因特異性引物〔SmNAC1-S、SmNAC1-A〕進(jìn)行鑒定，熔點(diǎn)曲線(xiàn)圖顯示內(nèi)參基因和SmNAC均只要1個(gè)峰，Tm值分別為82℃和76℃，表示清楚內(nèi)參基因和SmNAC1所用引物都具有高度特異性，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)顯示內(nèi)參基因的PCR擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)分別為90.8%和0.997；SmNAC1的擴(kuò)增效率和相關(guān)系數(shù)分別為112.5%和0.997，表示清楚試驗(yàn)具有較高的重復(fù)性和擴(kuò)增效率。最后將熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)均是目的片段，無(wú)引物二聚體。用50mgL-1的GA處理茄子幼苗，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)根、莖、葉中SmNAC1的相對(duì)表示出量〔圖6〕可見(jiàn)：隨著時(shí)間的變化SmNAC1在根、莖、葉中均有表示出，同時(shí)在短時(shí)間內(nèi)表示出量都上升到達(dá)最大值，處理后0.5h，在根和莖中的表示出量與0h時(shí)相比，大約分別增長(zhǎng)4倍和8倍，隨后下降到較低水平，甚至低于0h時(shí)表示出量后又有所恢復(fù)；而葉片中在處理1h時(shí)到達(dá)最高，與0h時(shí)相比約為其2倍，整體表示出量隨時(shí)間變化波動(dòng)趨勢(shì)較小，約在0.8~1.5間波動(dòng)。4℃低溫脅迫下，SmNAC1在根、莖、葉中都有表示出〔圖7〕；0.5h時(shí)根中的相對(duì)表示出量下降到最低，莖和葉中都較0h升高；整體上都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，講明在不同器官中低溫脅迫處理對(duì)SmNAC1的表示出都有一定的誘導(dǎo)作用，如在根和葉片中，脅迫9h時(shí)其相對(duì)表示出量到達(dá)最大值，在莖中處理6h時(shí)表示出量水平最高。由圖8可知，在20gL-1的NaCl脅迫下，茄子根、莖、葉中SmNAC1都有表示出，根中的表示出量變化較大，莖和葉中波動(dòng)較平緩。在根中處理1h時(shí)SmNAC1的相對(duì)表示出量由0h的0.95到達(dá)峰值4.26，可見(jiàn)SmNAC1在根中短時(shí)間迅速的誘導(dǎo)表示出，隨后處理時(shí)間延長(zhǎng)其相對(duì)表示出量降低；在莖中處理1h時(shí)相對(duì)表示出量有所升高，6h時(shí)到達(dá)最大值1.95，隨后降低；在葉片中9h時(shí)達(dá)最大值1.32，其整體在0.59~1.32范圍波動(dòng)。由上述結(jié)果可見(jiàn)：在茄子根、莖、葉中SmNAC1均能表示出，講明此基因編碼的蛋白是一種在茄子根、莖、葉各器官普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子；外源GA和非生物脅迫處理后表示出量均發(fā)生變化，基本呈先增后降的趨勢(shì)，初步認(rèn)定SmNAC1是一個(gè)可誘導(dǎo)表示出的轉(zhuǎn)錄因子；而在這些不同器官中SmNAC1表示出的水平不同，根中的表示出水平整體相對(duì)高于莖和葉片中，顯示在根中優(yōu)勢(shì)表示出，而葉片中表示出水平相對(duì)穩(wěn)定，可見(jiàn)該轉(zhuǎn)錄因子在不同器官發(fā)育經(jīng)過(guò)中所起的作用有一定差異。3、討論NAC作為植物中最大一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，不僅介入植物生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)過(guò)的調(diào)控、激素調(diào)控，而且在植物抗病、抗非生物脅迫應(yīng)答中也具有重要的生物調(diào)控功能。本研究中從茄子中克隆出全長(zhǎng)1279bp的SmNAC1基因，編碼含有302個(gè)氨基酸的完好開(kāi)放閱讀框，含有NAC家族經(jīng)典保守區(qū)域，包括A、B、C、D、E亞構(gòu)造域，可能負(fù)責(zé)與DNA及其它蛋白結(jié)合〔Ernstetal.，2004〕，軟件預(yù)測(cè)相對(duì)分子量約為35.04kD，理論等電點(diǎn)為8.18，揣測(cè)其為穩(wěn)定蛋白。綜合氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，SmNAC1與番茄、馬鈴薯、煙草親緣關(guān)系近期，與擬南芥ATAF2在進(jìn)化上有一樣的起源，可能具有ATAF2與植物逆境應(yīng)答相關(guān)的功能。有研究顯示，擬南芥中NAC1特異介導(dǎo)其側(cè)根發(fā)生經(jīng)過(guò)中的生長(zhǎng)素信號(hào)，表示出強(qiáng)度與生長(zhǎng)素濃度、側(cè)根原基的發(fā)生量呈高度正相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)上游lkb范圍內(nèi)含有3個(gè)赤霉素反響元件〔GAresponsecomplex〕，存在受赤霉素作用的特征〔Xieetal.，2000〕。煙草NAC1也在根尖、側(cè)根原基特異性表示出，王友華〔2005〕驗(yàn)證了該基因的表示出受生長(zhǎng)素誘導(dǎo)并且進(jìn)一步量化了生長(zhǎng)素和赤霉素對(duì)其的表示出的誘導(dǎo)效應(yīng)。