茄子NAC1轉錄因子的分離及表達研究,園藝學論文

茄子NAC1轉錄因子的分離及表達研究,園藝學論文NAC〔NAM、ATAF和CUC〕轉錄因子是高等植物特有的一類數(shù)量較多的轉錄因子，其N端都包含一段約150個氨基酸殘基的保守序列，在植物生長發(fā)育、器官建成、脅迫應答以及品質改進經(jīng)過中發(fā)揮著重要作用〔邵鳳霞等，2008〕，已成為當下植物基因功能及表示出網(wǎng)絡調控研究中的熱門〔Zhengetal.，2018〕。第一個NAC基因NAM是Souer等在1996年從矮牽牛中克隆到的〔Soueretal.，1996〕，隨后1997年Aida等〔1997〕在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了NAM、CUC2和ATAF1/2等3種基因，CUC2功能類似于NAM，與植物的發(fā)育相關；ATAF1/2的功能與植物逆境應答相關。當前研究表示清楚：NAC轉錄因子在水稻基因組中有151個成員，煙草〔Rushtonetal.，2008〕和大豆〔Leetal.，2018〕中均有152個，擬南芥中有117個〔邢國芳等，2020〕。李雪林等〔2018〕根據(jù)水稻的SNAC1是抗逆性轉錄因子〔Huetal.，2006〕，且在非生物逆境脅迫〔干旱、鹽漬〕下SNAC1的表示出能夠提高抗逆性，將其導入棉花后通過NaCl脅迫挑選出了棉花轉化體系。李鵬〔2018〕研究了棉花中多種NAC基因及其受各種脅迫時的表示出，發(fā)現(xiàn)GhNAC1在棉花纖維中特異表示出，其它NAC轉錄因子在各個組織中均有表示出，且GhNAC12明顯受低溫脅迫的誘導，GhNAC20明顯受低溫、高鹽和PEG處理誘導，GhNAC16主要對高鹽處理敏感。玉米ZmNAC1能夠被低溫、PEG、高鹽和ABA誘導〔柳展基等，2018〕。細菌性斑點病菌侵染辣椒后CaNAC1被快速誘導，而在非寄主病菌侵染與抗病信號分子SA和ET處理辣椒后CaNAC1的誘導表示出也很強烈〔Ohetal.，2005〕。在中國北方地區(qū)，設施栽培中的低溫弱光是生產(chǎn)中最大的限制因素〔閆世江等，2018〕，土壤次生鹽漬化也較為嚴重〔史慶華等，2004；張海軍等，2020〕。茄子〔SolanummelongenaL.，2n=2x=24〕是設施栽培的主要蔬菜，當前關于茄子耐寒性〔高志奎等，2000；任國三等，2007；王鋒，2008〕、耐鹽性〔吳雪霞等，2018，2018〕已有一些報道，但主要是研究其對生長發(fā)育經(jīng)過中生理指標的影響，而有關茄子抗逆性基因分子育種的研究較少。作者從茄子中分離鑒定出NAC1轉錄因子全長，對其在逆境脅迫下時空表示出形式做出初步分析，以期為茄子抗逆性分子育種奠定基礎。1、材料與方式方法1.1材料及其處理選用北京農(nóng)學院蔬菜育種課題組選育茄子品系ETC01，于2020年7月中旬播種于塑料大棚，待幼苗長出2~3片真葉時摘取所有幼苗葉片，混合后每份1g，用錫紙包成若干份，液氮速凍，置于80℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?020年6月中旬將茄子種子播種于直徑15cm的營養(yǎng)缽內，營養(yǎng)基質為草炭︰蛭石=1︰1〔體積比〕。營養(yǎng)缽放置于北京農(nóng)學院農(nóng)業(yè)生物組織培養(yǎng)實驗室中培養(yǎng)，待幼苗長到2~3片真葉時進行不同因素處理。〔1〕配制濃度50mgL-1GA溶液，每個營養(yǎng)缽中參加200mL；〔2〕低溫4℃處理，每個營養(yǎng)缽中參加200mL蒸餾水后將整個營養(yǎng)缽置于4℃的培養(yǎng)箱中；〔3〕配制濃度為20gL-1的NaCl溶液，每個營養(yǎng)缽中參加200mL。每個因素處理3個營養(yǎng)缽〔每個營養(yǎng)缽20~25株幼苗〕，在0~12h內定時取各處理的根、莖、葉樣品，液氮速凍，置于80℃冰箱儲存?zhèn)溆?。各處理均設參加200mL蒸餾水的1個營養(yǎng)缽〔20~25株幼苗〕作為處理0h的對照。1.2SmNAC1序列克隆采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒〔上海生工生物工程技術服務有限公司〕提取茄子總RNA，用DNaseⅠ〔TaKaRa〕去除總RNA中基因組DNA的污染，用RW1〔博邁德〕去除總RNA中的蛋白污染，最后用Thermo公司的NANODROP2000檢測其濃度并采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完好性。以提取的總RNA為模板合成cDNA，cDNA合成體系的總體積為20L，反響經(jīng)過為：總RNA和10molL-1Oligo〔dT〕18混合液于70℃水浴10min；然后參加ReverseTranscriptaseM-MLV反轉錄酶〔200UL-1〕、dNTP〔10mmolL-1〕、RNaseInhibitor〔40UL-1〕及滅菌的雙蒸水，置于42℃保溫60min，后于70℃變性15min，最后存于20℃冰箱作為基因擴增及實時熒光定量PCR〔Real-timequantitativePCR，RT-qPCR〕的模板備用。在NCBI中搜索，根據(jù)GenBank中已頒布的辣椒NAC〔AY714222〕、甘藍型油菜NAC1〔AY245879〕、番茄NAC〔AY573802〕、番茄NAC1〔NP_001234482.1〕設計兼并引物擴增SmNAC1的保守區(qū)。上游S1：CAYCCDACKGAYGAAGA，下游A1：TTCTTSTTGTADATTCGACA。采用Clontech的SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit分別克隆SmNAC1的3端和5端序列，用PrimerPrimier5.0設計特異引物3S：GCTGGAAAAGCACCAAGAGGAAT和5A：GGTTCCTGCTGCTCGGTTCGGC；UPM通用引物Long：5-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，Short：5-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，由RACE擴增試劑盒提供。94℃預變性4min；94℃30s，72℃3min，5個循環(huán)；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5個循環(huán)；94℃30s，68℃30s，72℃3min，25個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。利用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒〔上海生工〕將擴增產(chǎn)物回收，凝膠電泳檢測后，用北京全式金生物技術公司pEASY-T3CloningKit連接，轉化于Trans1-T1感受態(tài)細胞，藍白斑挑選，經(jīng)菌液PCR初步鑒定后送北京三博遠志生物技術有限責任公司測序。最后根據(jù)DNAMAN軟件拼接序列獲得茄子SmNAC1全長cDNA序列。根據(jù)拼接出的序列利用PrimerPremier5.0設計特異性引物QS：AAAATAAACAGCGAAGAGAGA；QA：CTACACCAAAAAACCAAGAAA擴增SmNAC1全長，同樣將擴增產(chǎn)物回收、連接、轉化、挑選后送測序。1.3實時熒光定量PCR采用SYBRGreen熒光染料法，用CFX96〔Bio-Rad〕實時熒光定量PCR儀對SmNAC1在不同處理下的時空表示出進行檢測分析〔FickoCernelc，2005〕。擴增目的基因SmNAC1的上游引物SmNAC1-S：CTTGAGGCTTGATGAATGG和下游引物SmNAC1-A：GTGGTAATTGTGTGGGTAAA。茄子內參基因〔宋琴，2018〕Sm-ACTIN〔GenBank登錄號：GU984779〕的引物Sm-S：GTCGGAATGGGACAGAAGG；Sm-A：CAGTCAGGAGAACAGGGTG。根據(jù)寶生物公司試劑盒RealMasterMix〔SYBRGreen〕PCR操作步驟進行，將反轉錄所得的cDNA分別進行梯度稀釋〔1、1︰10、1︰100、1︰1000、1︰100000〕進行熒光定量PCR反響，繪制相對標準曲線。標準樣cDNA和待測樣均設3次重復。RT-qPCR擴增的反響體系為20L，包括10LRealMasterMix混合液、2LcDNA、0.5LSmNAC1-F〔10molL-1〕、0.5LSmNAC1-R〔10molL-1〕、7LddH2O。反響程序為：94℃預變性2min，94℃變性20s，53℃退火25s，72℃延伸20s，每次循環(huán)第3步進行熒光采集，40次循環(huán)。內參基因的PCR擴增的反響體系為20L：10LRealMasterMix混合液、2LcDNA、0.5LSm-S〔10molL-1〕、0.5LSm-A〔10molL-1〕、7LddH2O。其反響程序與SmNAC1的反響程序一樣。2、結果與分析2.1SmNAC1序列的獲得對擴增產(chǎn)物分別進行回收、克隆、鑒定后測序，得到長426bp的中間序列，Blast在線比照后初步證實是NAC基因家族，含有NAC家族保守構造域。根據(jù)上述保守序列設計的特異性引物，最終獲得794bp長的3端cDNA片段序列〔圖1，a〕、長396bp的5端cDNA片段〔圖1，b〕。利用引物QS和QA特異性擴增出茄子SmNAC1全長基因〔圖1，c〕，測序結果顯示cDNA全長序列為1279bp，NCBI在線分析同源性后，命名該基由于SmNAC1〔登錄號：KF668813〕。該基因含有1個編碼302個氨基酸的完好開放閱讀框，序列如此圖2，起始密碼子ATG位于124bp，終止子TAG位于1032bp處。利用DNAMAN揣測氨基酸序列與其他物種NAC家族序列進行多重序列比對〔圖3〕：茄子SmNAC1含有NAC家族共有特點，即N端都包含一段保守的氨基酸序列，約150個氨基酸殘基，保守域包含A、B、C、D、E等5個亞構造域。2.2SmNAC1蛋白的序列分析及構造預測Protparam在線分析顯示：茄子SmNAC1蛋白由20種基本的氨基酸組成，其分子式為C1570H2376N430O461S12，華而不實含量最高的氨基酸是Lys〔7.6%〕、Pro〔7.6%〕，含量最低的氨基酸是Cys〔1.3%〕，酸性氨基酸〔Asp+Glu〕總數(shù)為38個，堿性氨基酸〔Arg+Lys〕總數(shù)為40個，預測相對分子量約為35.04kD，理論等電點為8.18，總平均親水性〔GRAVY〕為0.858，不穩(wěn)定指數(shù)37.02，揣測其屬于穩(wěn)定蛋白。利用NPSA中的MLRC方式方法預測其二級構造：SmNAC1蛋白包含有63處螺旋〔Alphahelix〕，占20.86%，41處延伸鏈〔Extendedstrand〕，占13.58%；198處無規(guī)則卷曲〔Randomcoil〕，占65.56%。運用TMHMMServerv.2.0預測此蛋白無跨膜區(qū)域，PSORTWWWServer中PSORTPrediction工具預測細胞定位于細胞質中。在蛋白質構造數(shù)據(jù)庫中搜索到其同源模型，利用網(wǎng)站Expasy中SwissModel程序同源建模，揣測蛋白的三維構造模型如此圖4。2.3SmNAC1與其他物種NAC的同源性及系統(tǒng)進化樹分析將SmNAC1蛋白序列通過NCBI中BLAST在線分析同源性，結果表示清楚SmNAC1與番茄NAC1〔NP_001234482.1〕、馬鈴薯〔CAC42087.1〕、番茄NAC2〔ADL60119.1〕、甜椒〔AAW48094.1〕、煙草〔ADQ08688.1〕的同源性分別為90%、90%、89%、84%和82%。進一步通過DNAMAN軟件將SmNAC1與GenBank數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)登錄的14種NAC氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹〔圖5〕，可見茄子SmNAC1與番茄、馬鈴薯、煙草親緣關系近期，與擬南芥ATAF2在進化上有一樣的起源，與矮牽牛、擬南芥CUC2、CUC1親緣關系較遠，揣測茄子SmNAC1同樣具有ATAF2與植物逆境應答相關的功能。2.4SmNAC1在不同處理下的時空表示出分析通過RT-qPCR對內參基因引物〔Sm-S、Sm-A〕和SmNAC1基因特異性引物〔SmNAC1-S、SmNAC1-A〕進行鑒定，熔點曲線圖顯示內參基因和SmNAC均只要1個峰，Tm值分別為82℃和76℃，表示清楚內參基因和SmNAC1所用引物都具有高度特異性，制作標準曲線顯示內參基因的PCR擴增效率和相關系數(shù)分別為90.8%和0.997；SmNAC1的擴增效率和相關系數(shù)分別為112.5%和0.997，表示清楚試驗具有較高的重復性和擴增效率。最后將熒光定量PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測均是目的片段，無引物二聚體。用50mgL-1的GA處理茄子幼苗，實時熒光定量PCR檢測根、莖、葉中SmNAC1的相對表示出量〔圖6〕可見：隨著時間的變化SmNAC1在根、莖、葉中均有表示出，同時在短時間內表示出量都上升到達最大值，處理后0.5h，在根和莖中的表示出量與0h時相比，大約分別增長4倍和8倍，隨后下降到較低水平，甚至低于0h時表示出量后又有所恢復；而葉片中在處理1h時到達最高，與0h時相比約為其2倍，整體表示出量隨時間變化波動趨勢較小，約在0.8~1.5間波動。4℃低溫脅迫下，SmNAC1在根、莖、葉中都有表示出〔圖7〕；0.5h時根中的相對表示出量下降到最低，莖和葉中都較0h升高；整體上都隨時間的延長而升高，講明在不同器官中低溫脅迫處理對SmNAC1的表示出都有一定的誘導作用，如在根和葉片中，脅迫9h時其相對表示出量到達最大值，在莖中處理6h時表示出量水平最高。由圖8可知，在20gL-1的NaCl脅迫下，茄子根、莖、葉中SmNAC1都有表示出，根中的表示出量變化較大，莖和葉中波動較平緩。在根中處理1h時SmNAC1的相對表示出量由0h的0.95到達峰值4.26，可見SmNAC1在根中短時間迅速的誘導表示出，隨后處理時間延長其相對表示出量降低；在莖中處理1h時相對表示出量有所升高，6h時到達最大值1.95，隨后降低；在葉片中9h時達最大值1.32，其整體在0.59~1.32范圍波動。由上述結果可見：在茄子根、莖、葉中SmNAC1均能表示出，講明此基因編碼的蛋白是一種在茄子根、莖、葉各器官普遍存在的轉錄因子；外源GA和非生物脅迫處理后表示出量均發(fā)生變化，基本呈先增后降的趨勢，初步認定SmNAC1是一個可誘導表示出的轉錄因子；而在這些不同器官中SmNAC1表示出的水平不同，根中的表示出水平整體相對高于莖和葉片中，顯示在根中優(yōu)勢表示出，而葉片中表示出水平相對穩(wěn)定，可見該轉錄因子在不同器官發(fā)育經(jīng)過中所起的作用有一定差異。3、討論NAC作為植物中最大一類轉錄因子，不僅介入植物生長發(fā)育經(jīng)過的調控、激素調控，而且在植物抗病、抗非生物脅迫應答中也具有重要的生物調控功能。本研究中從茄子中克隆出全長1279bp的SmNAC1基因，編碼含有302個氨基酸的完好開放閱讀框，含有NAC家族經(jīng)典保守區(qū)域，包括A、B、C、D、E亞構造域，可能負責與DNA及其它蛋白結合〔Ernstetal.，2004〕，軟件預測相對分子量約為35.04kD，理論等電點為8.18，揣測其為穩(wěn)定蛋白。綜合氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)進化樹分析，SmNAC1與番茄、馬鈴薯、煙草親緣關系近期，與擬南芥ATAF2在進化上有一樣的起源，可能具有ATAF2與植物逆境應答相關的功能。有研究顯示，擬南芥中NAC1特異介導其側根發(fā)生經(jīng)過中的生長素信號，表示出強度與生長素濃度、側根原基的發(fā)生量呈高度正相關，并發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)上游lkb范圍內含有3個赤霉素反響元件〔GAresponsecomplex〕，存在受赤霉素作用的特征〔Xieetal.，2000〕。煙草NAC1也在根尖、側根原基特異性表示出，王友華〔2005〕驗證了該基因的表示出受生長素誘導并且進一步量化了生長素和赤霉素對其的表示出的誘導效應。