DNA的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)

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通過(guò)本試驗(yàn)學(xué)習(xí)DNA的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)的基本原理與試驗(yàn)技術(shù)。

[試驗(yàn)原理]

1.限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其四周的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依靠于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成:一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識(shí)別序列。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列:5-GAATTC-3),有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中,有的在對(duì)稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如Sma:5-CCCGGG-3);有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端,如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。5GAATTC35GAATTC3；3CTTAAG53CTTAAG5

2.DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí),會(huì)影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí),每次都要用新的吸管頭。假如采納兩種限制性內(nèi)切酶,必需要留意分別供應(yīng)各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必需首先使用,隨后調(diào)整鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第一個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/LNaAc和2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后置于-70℃低溫冰箱內(nèi)30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行其次個(gè)酶切反應(yīng)。

3.DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有很多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過(guò)綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性片段大小來(lái)確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對(duì)位置。酶切圖譜的使用價(jià)值依靠于它的精確?????性和精確程度。在酶切圖譜制作過(guò)程中，為了獲得條帶清楚的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.5-1g。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37℃)。對(duì)質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言,限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1gDNA加1單位酶,消化1-2小時(shí)。但要完全酶解則必需增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。

[試驗(yàn)儀器與設(shè)備]

水平式電泳裝置,電泳儀,臺(tái)式高速離心機(jī),恒溫水浴鍋,微量移液槍,微波爐,紫外透射儀,照相系統(tǒng)

[試驗(yàn)材料]

DNA;重組pBS質(zhì)料或pUC19質(zhì)粒;EcoRI酶及其酶切緩沖液;HindⅢ酶及其酶切緩沖液;瓊脂糖(Agarose)。

附試劑的配制：

1、5TBE電泳緩沖液：見(jiàn)試驗(yàn)二。

2、6電泳載樣緩沖液：見(jiàn)試驗(yàn)二。

3、溴化乙錠：見(jiàn)試驗(yàn)二。

[試驗(yàn)步驟]

1.將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管(最好0.5ml)編號(hào),用微量移液槍分別加入DNA1g和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10緩沖液2l,再加入重蒸水使總體積為19l,將管內(nèi)溶液混勻后加入1l酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機(jī)甩一下,使溶液集中在管底。

2.混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37℃水浴保溫2-3小時(shí),使酶切反應(yīng)完全。

3.每管加入2l0.1mol/LEDTA(pH8.0),混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

4.制備瓊脂糖凝膠分析內(nèi)切酶酶切反應(yīng)結(jié)果

配制1.5%瓊脂糖凝膠，取10l酶解液與2l6載樣液混勻電泳。保持電壓在60-80V，電流在40mA.電泳結(jié)束后，用EB染色20-25min,紫外燈下觀看結(jié)果