醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)綜合實(shí)驗

第五章醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)綜合實(shí)驗一、實(shí)驗?zāi)康?．掌握利用系譜與DNA檢測所得到的信息相結(jié)合用于產(chǎn)前基因診斷的方法；2．了解DNA分析技術(shù)在遺傳病產(chǎn)前基因診斷中的應(yīng)。二、實(shí)驗原理（一）PCR-RFLP分析技術(shù)PCR-RFLP分析技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，根據(jù)限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)改變而導(dǎo)致的酶切位點(diǎn)增加或消失的特點(diǎn)，對DNA進(jìn)行鑒定；利用PCR特異擴(kuò)增的DNA片斷中包含某個堿基突變，經(jīng)特定限制酶切割后,通過凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物大小，比較分析與對照樣本的異同，判斷該DNA是否存在突變。應(yīng)用PCR-RFLP分析技術(shù)可以檢測已知的點(diǎn)突變，也可以在家系中連鎖分析進(jìn)行基因診斷。（二）F訓(xùn)基因F訓(xùn)基因位于人類染色體Xq28，長186kb，由26個外顯子及25個內(nèi)含子組成。根據(jù)F訓(xùn)基因序列，本實(shí)驗利用PCR結(jié)合RFLP設(shè)計了一對特異性引物，首先擴(kuò)增出F訓(xùn)基因長度為142bp的特異性片段，然后選擇BclI限制性核酸內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行消化，野生型基因擁有限制性核酸內(nèi)切酶BclI的酶切位點(diǎn)，可被切為99bp和43bp兩個片段；而突變型基因沒有限制性核酸內(nèi)切酶BclI的酶切位點(diǎn)，不會被BclI切斷，酶解后仍為142bp的片段；如果酶解后142bp、9bp和43bp片段均出現(xiàn)，說明是野生型基因與突變型基因的雜合子（圖5-1，圖5-2）。圖5-1PCR-RFLP分析FVIII基因原理圖

圖5-2PCR-RFLP分析FVIII基因結(jié)果示意三）血友病A病例姓名：李XX性別：男出生日期：1979年5月民族：漢現(xiàn)住址：XXXXXX就診日期：2000年7月（XX醫(yī)科大學(xué)XX臨床學(xué)院血液室）主訴：反復(fù)出血不止、關(guān)節(jié)腫痛15年，加重1年現(xiàn)病史：15年前，于輕微外傷后出血不止，外用凝血藥止血后未予治療。此后齒齦、舌、口腔、鼻經(jīng)常出血，而膝、踝、肘等部位常于輕微外傷后出現(xiàn)淤斑、關(guān)節(jié)腫痛，癥狀逐年加重。查體：神志清楚，語言流利，貧血貌，膝、踝、肘關(guān)節(jié)僵硬變形，肌肉萎縮。實(shí)驗室檢查：①凝血時間延長；②凝血活酶時間顯著延長；③血漿中抗血友病球蛋白減少；④出血時間、凝血酶源時間、纖維蛋白原含量、毛細(xì)血管脆性及血小板數(shù)均正常?！咀ⅲ貉獫{因子訓(xùn)活性的正常均值定為100%（范圍50%?200%）。甲型血友病血漿因子訓(xùn)活性水平低于5%，重型V2%?！考易迨罚杭蚁抵袃蓚€舅舅曾患類似病死亡，現(xiàn)有一同胞弟弟患有同病，同胞現(xiàn)年7歲，已出現(xiàn)出血時間延長，出血不止癥狀。三、實(shí)驗準(zhǔn)備（材料、試劑、儀器）（一）試劑1.模板DNA（50ng/pl）、引物I和11（20pM）、TaqDNA聚合酶（5u/pl）、10XPCR反應(yīng)緩沖液、dNTP（2.5mM）、滅菌蒸餾水、礦物油、限制性內(nèi)切酶Bell（20U/p1）、10X酶切緩沖液。2.30%非變性聚丙烯酰胺凝膠（29:1）、5XTBE、2%過硫酸銨、TEMED、6X上樣緩沖液、DNA分子量標(biāo)記、5mg/ml溴化乙錠（EB）染液、無水乙醇（三）儀器和設(shè)備PCR自動熱循環(huán)儀、紫外透射儀、微量加樣器、槍頭及離心管、容器盒、恒溫水浴箱、制膠玻璃板、制膠架、聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置、5ml注射器、12號針頭、25pl玻璃注射器、燒杯、脫脂棉、保鮮膜、染色盒、微波爐、250ml三角燒瓶、透明膠帶、稱藥盤、天平。

四、實(shí)驗方法與步驟（一）PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系20pl，其成分如下：模板DNA2pl10XPCR緩沖液2plTaqDNA聚合酶0.2pl2.5mMdNTP1pl20pMPrimerI0.5pl20pMPrimerII0.5plddHO213.8pl總體積20plPCR反應(yīng)循環(huán)溫度：95°C變性2min，94°C40s；55C30；72C50C30個循環(huán)，最后經(jīng)72°C延伸5min，反應(yīng)結(jié)束后置4°C冰箱保存（二）PCR產(chǎn)物的BelI酶切反應(yīng)體系30pl其成分如下：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物12pl10X酶解緩沖液3plBelI限制酶1plddHO214p總體積30pl置50°C水浴消化2小時，4°C保存。（三）聚丙烯酰胺凝膠電泳1.制備12%聚丙烯酰胺凝膠5ml。力口TEMED5pl和0.4ml過硫酸銨，混勻后灌膠，插入加樣梳子。待膠完全凝聚后，拔出加樣梳子，安裝電泳裝置，加入電泳緩沖液（1XTBE）,緩沖液應(yīng)高于加樣孔上緣，用注射器吸取緩沖液沖洗力樣孔，預(yù)電泳20分鐘。2?每份限制酶切產(chǎn)物取10ul，加2ul的6X載樣緩沖液，混勻后加入到樣品孔中，以100V電泳50分鐘。3．拆下電泳裝置，取出聚丙烯酰胺凝膠，切去左上角，作好標(biāo)記后放到一個朔料盤內(nèi)，加EB染液染色3分鐘。4．EB染色以后取出凝膠，放在紫外透射儀中觀察PCR-RFLP結(jié)果。五、注意事項.酶類試劑應(yīng)保存在or以下，以免失活，如TaqDNA聚合酶、BclI限制酶。.聚丙烯酰胺和溴化乙錠（EB）是有毒的，需戴手套操作，避免污染。3．每組有患者、患者父母和胎兒DNA樣本，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增．六、預(yù)期實(shí)驗結(jié)果與分析根據(jù)血