再生組織培養(yǎng)的水稻第一在1968年報(bào)道

9/9建立一個(gè)高效率的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的水稻制水稻(OｒyzasatｉvaL.）作物耐冷性研究團(tuán)隊(duì)，國(guó)家農(nóng)業(yè)研究中心北海道地區(qū)，羊丘,豐平區(qū)，札幌，北海道062－8555，日本文章歷史：?收到200８年10月23日

修改稿１月14日收到２009年?接受九年一月十五日?可在線2009年1月31日?關(guān)鍵詞：水稻農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化液體介質(zhì)摘要：已開(kāi)發(fā)的技術(shù)用于水稻轉(zhuǎn)化,以滿足功能性的要求基因組中,以使生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因稻植物的有用的農(nóng)業(yè)字符。然而，許多水稻品種都不能有效地通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。我們已經(jīng)成功通過(guò)合作培育水稻愈傷組織在飯建立一個(gè)高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)?蘸有豐富Ｎ6orDKNｍｅdiains一個(gè)grobactｅｒiｕmon三濾論文tｅａｄo固融合媒體.水稻愈傷組織浸入農(nóng)桿菌懸浮液（EＨA1０1，農(nóng)桿菌濃度OD６０0=0。０４）共培養(yǎng)的3張濾紙(直徑９ｃm)蘸有5。5毫升N6orDKN液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加２，4－二(2毫克/升)，脯氨酸(10mM）的酪蛋白

e水解產(chǎn)物（30０毫克/升）,蔗糖(30克/Ｌ）,葡萄糖(５克/升），－半胱氨酸（１０0mg/L時(shí)）和乙酰丁香酮農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化液體介質(zhì)L（15毫克/升）在258℃于黑暗中３天。同的愈傷組織共轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行比較（15毫克／升）在258℃于黑暗中３天。同的愈傷組織共轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行比較cultivａｔeｄｏn固體介質(zhì),轉(zhuǎn)換效率提高了約5倍,通過(guò)使用過(guò)濾器紙的方法很多品種的大米，包括那些以前產(chǎn)生了許多窮人轉(zhuǎn)化率。2０09愛(ài)思唯爾愛(ài)爾蘭有限公司保留所有權(quán)利。1介紹在1968年第一次報(bào)道使用再生組織培養(yǎng)的水稻[1?4],而這種植物物種現(xiàn)在被廣泛使用轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。DNＡ通過(guò)電穿孔,原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化,根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移到水稻植株［5－7］。最近,已通過(guò)幾種方法，提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化效率，以產(chǎn)生一個(gè)IUＭ—介導(dǎo)轉(zhuǎn)化所需的Ｔ-DNA的轉(zhuǎn)化子，插入和FOX庫(kù)以及基因打靶技術(shù)的研究[８,9]。它已被認(rèn)為具有高度發(fā)展的高效,大規(guī)模改造系統(tǒng)，以處理更多超過(guò)103個(gè)轉(zhuǎn)化,將是一個(gè)基因目標(biāo)成功實(shí)現(xiàn)的前提條件［９].日本的水稻品種Ｎiｐponbaｒe已被廣泛用于轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，由于其良好的再生能力,從愈傷組織中高效率的介導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)變。以標(biāo)準(zhǔn)的水稻轉(zhuǎn)化方式,用于產(chǎn)生大量的轉(zhuǎn)化，但是,只有有限的幾個(gè)品種,這表明實(shí)驗(yàn)水稻轉(zhuǎn)化的參數(shù)沒(méi)有經(jīng)過(guò)充分的優(yōu)化．經(jīng)常使用細(xì)菌分離出抗生素耐藥性和抗除草劑基因，選擇轉(zhuǎn)化的植物組織，由于在高效率選擇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶,潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和草丁膦從細(xì)菌中分離出的乙?；D(zhuǎn)移酶經(jīng)常用于選擇轉(zhuǎn)化植物組織［10，11]。他們的可能存在于糧食作物，但是,這引得全球公眾關(guān)注.在這些公眾關(guān)注的問(wèn)題中，使用分離自細(xì)菌的抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記物的轉(zhuǎn)基因生物(GMOs)可以避免的。一些新的系統(tǒng)，利用原生植物基因在最近幾年得到實(shí)驗(yàn)。這些包括鄰基苯甲酸合成酶α-亞基基因正選擇系統(tǒng)，如芐基腺嘌呤N—３-葡糖苷酸，甘露糖和亞硝酸鹽還原酶基因［10?17]。然而，使用這些的陽(yáng)性篩選系統(tǒng)選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞,相比使用的抗生素抗性基因效率較低。這是一個(gè)高效多產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物在實(shí)際應(yīng)用中的障礙.為了優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化的效率，許多研究人員已經(jīng)嘗試了不同的媒介和不同條件的接種，介導(dǎo)培養(yǎng)農(nóng)桿菌.一些研究人員報(bào)告說(shuō),在根據(jù)通過(guò)使用了含還原劑如抗壞血酸或L—半胱氨酸共培養(yǎng)介質(zhì)，組織壞死(褐變)被減少，轉(zhuǎn)化的頻率增加.[18?2０］。褐變被認(rèn)為是農(nóng)桿菌過(guò)量增殖引起的，從而降低了頻率的轉(zhuǎn)變。因此，如果擴(kuò)散細(xì)菌可以被控制,以最大限度地提高細(xì)菌感染和T-DNA整合到植物基因組,并盡量減少組織壞死，它應(yīng)該有可能顯著增加轉(zhuǎn)化期間共培養(yǎng)頻率.2．0材料與方法２．1水稻轉(zhuǎn)化過(guò)程從遺傳資源中心獲得的水稻種子，,日本國(guó)立農(nóng)業(yè)生物科學(xué)研究所。農(nóng)桿菌兩種文化的基礎(chǔ)上對(duì)水稻的轉(zhuǎn)化條件[８，16]。成熟的種子的日本晴，Sirｙo３08北海,Ｄuｌar和越光1０%次氯酸鈉溶液中滅菌為30分鐘，然后留在1％的過(guò)氧化氫溶液3小時(shí)。他們?cè)俅芜M(jìn)行滅菌２0分鐘，在10％的次氯酸鈉.三個(gè)用無(wú)菌水沖洗后,他們被安置在堅(jiān)實(shí)的N6介質(zhì)[2１］，補(bǔ)充了2，4—D（２毫克／升），脯氨酸（10毫摩爾），酪蛋白水解物（3００毫克／升),蔗糖(30克/升）,和介爾雷特(3克／升)Ｎ6D介質(zhì))。種子越光被轉(zhuǎn)移到DKN介質(zhì)［22］含2，4-D(2毫克／升）,脯氨酸（１0毫摩爾)的補(bǔ)充,酪蛋白水解物（3０0毫克／升），蔗糖(３０克/升）,和介爾雷特（3克/升)（DＫND介質(zhì)）,1周后上N6媒體文化。培養(yǎng)物在２8使用16小時(shí)光照(５０毫摩爾米２秒１）和圖8C8小時(shí)黑暗周期。3周后,小,大力除以直徑2-4MMＩＮ愈傷組織進(jìn)行傳代培養(yǎng)上的相同的新鮮培養(yǎng)基ｆoｒ3天，然后用于轉(zhuǎn)化的愈傷組織.甲plaｓｔｉcpｅtｒi培養(yǎng)皿的直徑9厘米的用于誘導(dǎo)和

繼代培養(yǎng)的愈傷組織,和陪替氏培養(yǎng)皿密封surgicaｌtaｐe（外科膠帶-21Ｎ，ニチバン株式會(huì)社日本。農(nóng)桿菌菌株EＨA101窩藏pＣAMBIＡ１３01(包含菊花/CAＭBＩＡ/ｈｏme．html的ＡB)培養(yǎng)培養(yǎng)基［２３］含硫酸卡那霉素（50毫克/升)，潮霉素（50毫克/升)和瓊脂（１5克/升）(瓊脂，粉末，和光有限公司,日本)3天在288Ｃ在黑暗中。收集和懸浮bａｃteｒiawerｅ［7]在AＡM培養(yǎng)基中含有乙酰丁香酮(0,１,15和40毫克/升）。農(nóng)桿菌感染,細(xì)菌的密度調(diào)節(jié)(OD６00=０.02,０.4和0。2）和水稻愈傷組織浸在細(xì)菌懸浮液２分鐘.除去過(guò)量的細(xì)菌印跡的的愈傷組織ｏnfilter紙.的愈傷組織（的２—4mmｉｎ直徑)分別為轉(zhuǎn)移到一個(gè)單一的滅菌的濾紙(直徑9CMIＮ號(hào)2,ＡDＶAＮTEC，日本，可比至Whatman等級(jí)２號(hào)過(guò)濾器紙）放置在9厘米直徑的陪替氏培養(yǎng)皿含有約30毫升固體（4克/Ｌ介爾雷特）Ｎ6D培養(yǎng)基(日本晴,北海Siryo308杜拉爾）或DＫND介質(zhì)(粳米)或三消毒過(guò)濾器含有５-６毫升液體N6D或DKND介質(zhì)。N６D和DＫＮD媒體補(bǔ)充與葡萄糖(５克／L)，L-半胱氨酸(10０毫克／升）,和乙酰丁香酮（０－4０毫克/升）。密封板用封口膜（佩希內(nèi)PｌasticＰackagｉｎgＣomｐany，USA），防止蒸發(fā)的介質(zhì),并進(jìn)行3天的共培養(yǎng)在黑暗中在２5或288C.愈傷組織，然后在無(wú)菌洗滌兩次洗滌一次水，然后在無(wú)菌水中含有Ｍｅrｏpｅｎ(大日本住友制藥,日本）（50毫克/升)以除去農(nóng)桿菌介導(dǎo)。共培養(yǎng)愈傷組織濾紙吸干和鍍上N６Ｄ或ＤKND介質(zhì)補(bǔ)充有Mｅropeｎ（25毫克/升）,潮霉素B（50毫克／升)和介爾雷特（３克/升)。該板用醫(yī)用膠帶密封，并使用一個(gè)1６小時(shí)的溫育在288C光（50mmｏlm?2選1）,和8小時(shí)黑暗周期。增殖的潮霉素抗性（嗯抗性）的愈傷組織轉(zhuǎn)移到相同的新鮮培養(yǎng)基.1周后，嗯抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移MS(（日本晴，北海Sｉｒｙｏ308和Dular）[24］或ＤKN（粳米）再生培養(yǎng)基中含有萘基乙酸（0．1毫克/升）,激動(dòng)素(２。５毫克／升）,酪蛋白水解產(chǎn)物(2克/升)，sucｒｏｓeＬ）ａndgeｌriｔe(４克/升）,并用石蠟?zāi)っ芊猓苑乐拐舭l(fā)的介質(zhì)。使用1６小時(shí)，將培養(yǎng)物孵育２８8C光（50毫米ＯLＭ2選１)，和8小時(shí)黑暗周期。（30克/升),山梨糖醇(２0克/升）,Meｒopen（２5毫克／升)，潮霉素（50毫克/再生芽轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的MS培養(yǎng)基含有蔗糖（30克/升），Meropeｎ（２５毫克/升）和介爾雷特(３克/升),并培養(yǎng)在２８8C灌封。所有的媒體進(jìn)行了調(diào)整，共培養(yǎng)介質(zhì)pH值至5.7，而不并高壓滅菌１5分鐘，在1218Ｃ在15psi。共同培養(yǎng)媒體調(diào)節(jié)pH至5.4，和在15psｉ下高壓滅菌1５分鐘，在1218C。Ｌ-半胱氨酸，硫酸卡那霉素,潮霉素B，乙酰丁香酮和Meropen過(guò)濾滅菌。２。2。變換的頻率和測(cè)量再生能力強(qiáng)經(jīng)過(guò)7天??Ｎ6Hy介質(zhì)，每愈傷組織轉(zhuǎn)移到X—GLUC解決方案［25］.計(jì)算的轉(zhuǎn)化效率作為細(xì)胞灶,示出GUS染色的平均數(shù)目(GUＳ+）在每個(gè)愈傷組織。此外，２周后的培養(yǎng)N6Hｙ介質(zhì)中，轉(zhuǎn)化效率表示為ＨM－抗性和GUS陽(yáng)性愈傷組織數(shù)/初始數(shù)愈傷組織接種？１00％。再生植物的葉子嗯抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到X—GLUC溶液。再生效率計(jì)算作為再生數(shù)HM-耐藥和耐HＭ—ＧUS陽(yáng)性植株數(shù)/

愈傷組織接種？100%。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。2。３.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織共培養(yǎng)后的數(shù)量共培養(yǎng)后的愈傷組織，３０件(約3毫米)在１０ml的無(wú)菌水沖洗,然后讓1mL稀釋?zhuān)保?倍。10微升,然后接種到ＬB培養(yǎng)基中[2６]含有硫酸卡那霉素(５0毫克/升）,潮霉素B(50毫克/升）和瓊脂(15克/升）。將板孵育2天，在28℃和單獨(dú)的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。對(duì)于計(jì)數(shù)的初始數(shù)目農(nóng)桿菌介導(dǎo)的細(xì)胞，感染后的愈傷組織,30件（約3毫米），立即在10毫升無(wú)菌水沖洗，并然后讓?zhuān)眒Ｌ稀釋10倍。?。?μl接種的ＬB培養(yǎng)基上。每個(gè)值是三個(gè)獨(dú)立的平均值實(shí)驗(yàn)２。4。Ｓoutｈｅrn雜交(印跡雜交)分離總ＤNA，從嗯抗性和GUS陽(yáng)性植物改良的CTAB法［27］。約１0毫克的用SaｃⅠ消化的DNＡ,并進(jìn)行電泳0.8％瓊脂糖凝膠.然后將ＤＮＡ轉(zhuǎn)移到尼龍膜(使用Hybｏnd－N＋，Ameｒｓｈam公司有限公司，ＮJ,USA)。PC引物的GＵS基因的擴(kuò)增的時(shí)間分別為５０—ｇtatｃaｃcgtｔtｇtgｔgaacaacｇ3０和50-gtａｔｃggtｇｔgagcgtｃgｃａｇaaｃ-３０。擴(kuò)增條件下用5分鐘的一個(gè)周期的隨后的３5個(gè)在9４８C周期的在94℃,3０秒，２0秒，在56℃和在72℃的１分鐘和最后一個(gè)周期的5分鐘，７2８Ｃ。擴(kuò)增的片段（９７9ｂp）的純化，使用WiｚａrdSＶ凝膠和PCR清理系統(tǒng)(Promｅgａ,UＳA）和３２P-標(biāo)記的隨機(jī)引物,并用作探針Ｓouthernblot分析。所有Souｔheｒn雜交分析和雜交進(jìn)行利用快速HYB緩沖器根據(jù)制造商的說(shuō)明(Ａmersham公司有限公司，NＪ,USA）。在６0℃進(jìn)行雜交在快速ＨYB緩沖液加變性探針。洗滌液在60℃,并進(jìn)行最后的洗滌液進(jìn)行0．2?ＳSC／0.1％SDS.3。結(jié)果與討論?水稻種子，因?yàn)樗玫倪^(guò)氧化氫溶液處理在一些品種，這可能是由于過(guò)氧化氫處理，打破了愈傷組織的誘導(dǎo)頻率增加休眠的種子（數(shù)據(jù)未示出)。過(guò)氧化氫促進(jìn)種子萌發(fā)的谷類(lèi)植物和幾種機(jī)制已經(jīng)被提出了它的作用[28].對(duì)于該處理,水稻殼小心地除去，以避免受傷的果皮.當(dāng)水稻愈傷組織共培養(yǎng)在固體上的單張紙岐等人的方法，所述的媒體。(圖1A－C）[8］，的轉(zhuǎn)換效率是高的時(shí)潮霉素Ｂ磷酸轉(zhuǎn)移酶基因作為可選擇標(biāo)記。?然而，褐變?nèi)杂^察到的表面上的一些愈傷組織在這些條件下（圖1B）。這些觀察結(jié)果表明:愈傷組織損壞接種農(nóng)桿菌介導(dǎo)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率下降.因此，我們

試圖找到抑制細(xì)胞增殖的條件，接種時(shí)期，以農(nóng)桿菌共培養(yǎng)期間減少損壞愈傷組織。細(xì)菌不生長(zhǎng)良好過(guò)度的干板大量的膠凝劑，這表明的程度干燥的表面上的固體培養(yǎng)基影響細(xì)菌增長(zhǎng)。然而，這是很難控制的電平上的干燥表面上的固體培養(yǎng)基。紙橋和紙燈芯在培養(yǎng)基中使用的細(xì)胞或組織的替代方法的支持增長(zhǎng).我們認(rèn)為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的增殖通過(guò)以下來(lái)控制介質(zhì)的量調(diào)節(jié)在紙張上過(guò)濾.三層過(guò)濾器(直徑9厘米,第2號(hào)）,能夠約5.5毫升的介質(zhì)。水稻愈傷組織后農(nóng)桿菌懸浮液中浸漬約30條的愈傷組織(２-直徑４毫米）放置在一個(gè)塑料為９厘米的陪替氏培養(yǎng)皿直徑含有固體N６Ｄ共同培養(yǎng)基中（圖１A）或三塊潤(rùn)濕濾紙用5-6毫升液體N6共培養(yǎng)介質(zhì)（圖１Ｄ）.過(guò)濾紙的表面的蘸用5ｍl介質(zhì)是干燥的，而過(guò)濾紙蘸有6毫升的培養(yǎng)基中是濕的。愈傷組織的濾紙含有5ｍL的介質(zhì)是無(wú)水的,而過(guò)濾器文件,其中載有6毫升培養(yǎng)基中的愈傷組織上是濕的.共培養(yǎng)后,30個(gè)愈傷組織塊（約３毫米)沖洗在10毫升無(wú)菌水中，并稀釋水和鍍的ＬB培養(yǎng)基上進(jìn)行量化農(nóng)桿菌細(xì)胞的數(shù)目（表1）。0D共培養(yǎng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)細(xì)胞的初始數(shù)目是32？11。在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)相比條件下,農(nóng)桿菌介導(dǎo)沒(méi)有增長(zhǎng)以及在液體介質(zhì)中條件下，和褐變的共培養(yǎng)的愈傷組織,沒(méi)有檢測(cè)到（圖1E）。因此，我們成功地控制擴(kuò)散農(nóng)桿菌介導(dǎo)抑制組織壞死.轉(zhuǎn)化效率通常表示為數(shù)量ＨM-抗性和GUS陽(yáng)性愈傷組織的外植體數(shù)/初始

接種。然而,我們計(jì)算的數(shù)字顯示灶后7天的增長(zhǎng)對(duì)N６Ｈy介質(zhì)作為在每個(gè)愈傷組織的GＵＳ＋轉(zhuǎn)化效率的研究。當(dāng)水稻愈傷組織共培養(yǎng)三塊潤(rùn)濕濾紙用Ｎ6液體共培養(yǎng)介質(zhì)中，轉(zhuǎn)化效率的研究是非常高的每個(gè)條件（表１和表２），并且它是難以檢測(cè)數(shù)數(shù)有多少轉(zhuǎn)化效率差異嗯抗性和ＧUS陽(yáng)性的愈傷組織由于高轉(zhuǎn)化效率。此外，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體的數(shù)目是遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于實(shí)際的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的數(shù)事件,因?yàn)閮蓚€(gè)以上的獨(dú)立HM—抗性愈傷組織經(jīng)常產(chǎn)生的愈傷組織（圖１C和F).Hieｉ等人。報(bào)告說(shuō)，以上７個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化通過(guò)劃分從一個(gè)單一的未成熟胚產(chǎn)生胚胎成多達(dá)3０個(gè)，在水稻[2９]。岐等。報(bào)道骨痂生長(zhǎng)和GFP信號(hào)檢測(cè)第６天來(lái)自穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻［30］.因此，共培養(yǎng)7天，增長(zhǎng)N6Ｈy介質(zhì),每個(gè)愈傷組織培養(yǎng)在X-ＧLUC溶液和在每個(gè)愈傷組織數(shù)灶示出GＵS染色活性(GＵＳ＋)進(jìn)行計(jì)數(shù)。小型球狀GUＳ陽(yáng)性愈傷組織出現(xiàn)從表面的愈傷組織,并增長(zhǎng)（圖1C和F）在N6Hy介質(zhì)。轉(zhuǎn)化效率的改善顯著（>2倍)一個(gè)９厘米的塑料陪替氏培養(yǎng)皿中含有三塊濾紙上蘸有5．5毫升液體培養(yǎng)基中(表１）,而5。0和6．0毫升的媒體條件下使用無(wú)明顯差異使用固體介質(zhì)。在表1所示的結(jié)果表明有一個(gè)最優(yōu)的所需濃度的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)型。如果細(xì)菌濃度過(guò)低時(shí)，轉(zhuǎn)換減少因細(xì)菌感染的效率，減少水稻細(xì)胞.另一方面,過(guò)高的細(xì)菌濃度降低的整體轉(zhuǎn)化效率;雖然感染的數(shù)量增加時(shí)，增加細(xì)菌對(duì)細(xì)胞造成損害。Ｈｏwe等人的一項(xiàng)研究表明，胚胎放置在四個(gè)無(wú)菌過(guò)濾器,放置在一個(gè)1０0毫米之內(nèi)？20毫米共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中,用４.2毫升飽和的培養(yǎng)皿高粱的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化,但是,他們沒(méi)有討論濾紙和量的影響液體介質(zhì)效率的轉(zhuǎn)變［31]。參數(shù)接種與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的,包括溫度，根癌農(nóng)桿菌濃度，Lｃysteine濃度和濃度的乙酰丁香酮，在媒體進(jìn)行了分析.堅(jiān)實(shí)的合作種植水稻愈傷組織的最佳條件介質(zhì)是25℃的溫度下與根癌農(nóng)桿菌ＯD＝0。2和２00mM濃度的乙酰丁香酮［9］.我們首先研究了Ｌ－半胱氨酸的濃度（0—100毫克/升)與農(nóng)桿菌濃度OＤ600=0。０2和乙酰丁香酮（1５毫克/升）。的轉(zhuǎn)換效率略提高L—半胱氨酸時(shí),被添加到液體介質(zhì)中的（表2）,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。共同培養(yǎng)的外植體的存在下用農(nóng)桿菌乙酰丁香酮,vｉｒ基因誘導(dǎo)劑，已成為一個(gè)例行演習(xí)改造頑固的作物，如水稻,玉米，大麥的和小麥[32]。Terada等人。報(bào)告說(shuō)，20０毫米乙酰丁香酮似乎是最好的水稻遺傳轉(zhuǎn)化的濃度.何時(shí)?乙酰丁香酮被省略，轉(zhuǎn)化效率低（表2)。有一個(gè)統(tǒng)計(jì)上不顯著的區(qū)別76ｍM的濃度(15毫克/升）的轉(zhuǎn)化效率和200mM(４0毫克/升）。Hiei等人。報(bào)道稱(chēng)的轉(zhuǎn)換效率非常低時(shí)，乙酰丁香酮被省略［33］?？赡軙?huì)對(duì)水稻細(xì)胞能夠產(chǎn)生一定程度的信號(hào)分子誘導(dǎo)ｖｉr基因的表達(dá)［34］。我們認(rèn)為信號(hào)分子沒(méi)有愈傷組織培養(yǎng)基中擴(kuò)散，因?yàn)檫M(jìn)行共培養(yǎng)三塊濾紙蘸有只５.5毫升的液體培養(yǎng)基中的愈傷組織在我們的文化系統(tǒng),所以可能具有足夠的電平的信號(hào)分子的濃度為０和76毫米（15毫克/升）。然后,我們檢查農(nóng)桿菌的溫度和濃度與L—半胱氨酸(0．02?0。2ＯD60０）（100毫克/升)和乙酰丁香酮(15mg/Ｌ的＝７6毫摩爾）。共培養(yǎng)的最佳條件為被認(rèn)為是25℃的溫度下和農(nóng)桿菌濃度OＤ600=0。04或0.2(表2)。有一個(gè)統(tǒng)計(jì)上不顯著的差異之間的轉(zhuǎn)換濃度OD６00=０．04的效率，并OD600＝0。2（t-檢驗(yàn)中，a=0。05)，在258C。在２８圖8C，變換效率使用農(nóng)桿菌的濃度OD6００＝0。04顯著高于在較高的獲得農(nóng)桿菌濃度OD60０=０。2（t-檢驗(yàn)中，a＝0。0５），這可能是因?yàn)檫^(guò)量的農(nóng)桿菌介導(dǎo)損壞愈傷組織.潮霉素抗性和GUＳ陽(yáng)性的一些

日本晴證實(shí)了植物基因組印跡分析具有ＧUS基因（圖2）。從隨機(jī)的總DＮA

選擇嗯抗性和GUS陽(yáng)性的植株被消化的ＳacＩ和允許與GUS基因的探針雜交。“pCAMBIＡ13０1在多克隆位點(diǎn)有一個(gè)SacＩ位點(diǎn)，泳道2，第3和４有兩個(gè)以上的雜交條帶，這意味著的GＵS基因的多拷貝整合。結(jié)果表明進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因植物,轉(zhuǎn)基因的多個(gè)拷貝。然后,我們檢查時(shí)轉(zhuǎn)化率和再生嗯抗性愈傷組織的頻率,使用不同的品種(表3及圖3）:越光，領(lǐng)先的品種,在日本,北海Siryo308，在北海道,最新的品種和Dulａｒ，一個(gè)流行的不同的秈稻。變換的頻率提高每一個(gè)品種，尤其是，在北海Ｓiryo3０8和Duｌar,表現(xiàn)為低頻率的變換,固體共培養(yǎng)媒體。幾個(gè)倍的轉(zhuǎn)換效率在我們的文化系統(tǒng)實(shí)現(xiàn).有趣的是，我們的系統(tǒng)增強(qiáng)有效選擇轉(zhuǎn)化的愈傷組織。轉(zhuǎn)化的愈傷組織早在14天觀察到轉(zhuǎn)移到Ｎ6Ｈy介質(zhì)后（圖3A)。布朗寧和隨后的細(xì)胞死亡已報(bào)告頻繁的現(xiàn)象在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的相互作用與單子葉植物。，杜拉爾也具有顯著的褐變固體培養(yǎng)基上（圖3B）。然而,褐變程度杜拉爾愈傷組織在我們的系統(tǒng)的效率降低轉(zhuǎn)化顯著增加（表3及圖３A）.獨(dú)立ＨM—抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生介質(zhì)和再生植株的葉片的GUＳ組織化學(xué)溶液中浸泡。再生效率計(jì)算的數(shù)目的再生嗯抗性和GUS陽(yáng)性植物/HM-抗性愈傷組織接種數(shù)量?１0０%。再生能力近90%，在所有品種（表3)。據(jù)報(bào)道Ｔeradａ等人,以高效率的大規(guī)模轉(zhuǎn)換系統(tǒng),處理超過(guò)1０3個(gè)轉(zhuǎn)化,建立基因打靶，和轉(zhuǎn)化效率的研究為30－80％在他們的系統(tǒng)。在我們的系統(tǒng)的效率的愈傷組織的轉(zhuǎn)化幾乎是１0０％和再生效率是所有品種的近90％。結(jié)果表明，四個(gè)品種的整體轉(zhuǎn)化效率非常高的。因此，我們已經(jīng)使用T－DＮA插入庫(kù)，ＦOX庫(kù)和基因打靶技術(shù)成功地在許多水稻品種建立一種高度高效轉(zhuǎn)化體系的.參考文獻(xiàn)：[1］S。田村，拍攝形成的愈傷組織源自米胚，PROC。JPN。ACAＤ.?4４（196８）544—548.

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