手工提取基因組DNA

手工提取基因組DNA法本方法是一種簡(jiǎn)單、快速的基因組DNA(GenomicDNA)提取方法，可以從動(dòng)物組織、植物材料、各種微生物、培養(yǎng)細(xì)胞中提取基因組DNAo樣品在DNA裂解液中能夠充分被裂解,在加入乙醇后，會(huì)出現(xiàn)白色絮狀的基因組DNA沉淀，收集并洗滌沉淀即可得到基因組DNAo適用于各種樣品的基因組DNA提取。提取過(guò)程簡(jiǎn)單、快速，整個(gè)操作可以在30分鐘內(nèi)完成。本制品采用的是傳統(tǒng)的纏繞法提取DNA，所獲得的基因組DNA純度高、完整性好。(1)準(zhǔn)備試劑無(wú)水乙醇和75%乙醇；8mMNaOHo低濃度NaOH溶液在空氣中很容易被C02中和，NaOH一般配制成2?4M的儲(chǔ)存液，使用時(shí)再稀釋?zhuān)浔４鏁r(shí)間不超過(guò)6個(gè)月，而8mMNaOH的保存期限不超過(guò)一個(gè)月。(2)實(shí)驗(yàn)操作1.各種組織材料的DNAiso使用量及裂解方法如下。實(shí)驗(yàn)材料種類(lèi)DNAiso使用量裂解方法貼壁培養(yǎng)細(xì)胞1.0ml/10cm2培養(yǎng)皿移液槍輕輕吹打懸浮培養(yǎng)細(xì)胞1.0ml/1?3X107細(xì)胞移液槍輕輕吹打動(dòng)物組織1.0ml/25?50mg組織勻漿器勻漿或液氮研磨少量動(dòng)物軟組織(如脾臟和腦等)1.0ml/5?10mg組織移液槍輕輕吹打Yeast或革蘭氏陽(yáng)性菌1.0ml/1?3X108細(xì)胞先用溶菌酶裂解細(xì)胞壁，再加DNAiso吹打裂解或使用液氮研磨革蘭氏陰性菌1.0ml/1X109細(xì)胞移液槍輕輕吹打2.實(shí)驗(yàn)樣品的研磨和勻漿。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞倒出培養(yǎng)液，用1XPBS清洗一次。每10cm2生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞中加入1ml的DNAisoReagent,水平放置片刻，使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面并輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞裂解，然后使用移液槍吹打細(xì)胞使其脫落(對(duì)于貼壁牢固的培養(yǎng)細(xì)胞可使用細(xì)胞刮勺剝離細(xì)胞)。將含有細(xì)胞的裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，用移液槍反復(fù)吹打直至裂解液中無(wú)明顯沉淀。室溫靜置5分鐘。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（或革蘭氏陰性菌）將懸浮培養(yǎng)細(xì)胞連同培養(yǎng)液一起倒入離心管中，8,000Xg4°C離心2分鐘，棄上清。加入1ml（IX107個(gè)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或IX109個(gè)革蘭氏陰性菌細(xì)胞的使用量）的DNAisoReagent。用移液槍反復(fù)吹打直至裂解液中無(wú)明顯沉淀。室溫靜置5分鐘。動(dòng)物組織將動(dòng)物組織放入勻漿器中，每25?50mg組織中加入1mlDNAisoReagent。使用勻漿器反復(fù)勻漿，直至沒(méi)有明顯塊狀組織沉淀。對(duì)于特殊樣品，如心臟、肌肉及軟骨組織等，可以將其迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無(wú)明顯的可見(jiàn)顆粒，如果沒(méi)有研磨徹底會(huì)影響DNA的收率和質(zhì)量）。加入適量的DNAisoReagent,將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。對(duì)于量少的一些軟組織（5?10mg）,例如脾臟、腦等，可以直接剪成小塊放到離心管中加入DNAisoReagent,再使用移液槍反復(fù)吹打，使軟組織破碎，直至看不到明顯的沉淀為止。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中。植物材料（或革蘭氏陽(yáng)性菌）將植物材料（或革蘭氏陽(yáng)性菌）稱(chēng)重后，放入研缽中加入液氮速凍，用研杵將植物材料（或革蘭氏陽(yáng)性菌）研磨成粉末狀。加入適量的DNAiso將粉末狀樣品完全覆蓋，室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中。除雜質(zhì)。離心：組織裂解液經(jīng)10,000Xg4C或室溫離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。此步驟可以除去裂解液中大部分的組織碎片、RNA和多糖類(lèi)成份。（對(duì)于大量的動(dòng)物組織、植物材料以及其他纖維或RNA含量較多的材料，推薦使用此操作，其他材料可酌情省略。）本步驟選擇使用（僅在提取植物材料時(shí)使用，可以除去大量葉綠素）：向組織裂解液中加入等體積的氯仿，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，12,000Xg室溫離心10分鐘，將上層溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管中?；蚪MDNA的提取。向上述裂解液中加入DNAisoReagent1/2體積量的無(wú)水乙醇。反復(fù)顛倒混勻1?3分鐘，會(huì)出現(xiàn)云霧狀的DNA沉淀，使用槍頭將DNA纏繞出來(lái)轉(zhuǎn)移至新的離心管中，或者將上清液輕輕倒出，將DNA沉淀留在離心管底部。若沒(méi)有出現(xiàn)DNA沉淀或沉淀量較少且分散時(shí)，可以4,000Xg室溫離心2分鐘沉淀DNA。5?基因組DNA沉淀的清洗。緩慢地沿離心管壁加入1ml75％的乙醇（切勿觸及沉淀），輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12,000Xg4°C離心5分鐘后小心棄去乙醇（為了更好地控制DNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇）。6.基因組DNA的溶解。將除去乙醇后的基因組DNA沉淀在室溫下干燥5?15秒（如果基因組DNA在空氣中干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)很難溶解），緩慢加入適量的TEBuffer（pH8.0）或滅菌水溶解基因組DNA。一般從107個(gè)細(xì)胞或10?20mg動(dòng)物組織中提取的基因組DNA加入200?300pl溶液溶解,濃度可以達(dá)到200?300ng/pl。從一些動(dòng)物組織如肝臟、肌肉和植物中提取的基因組DNA通常會(huì)含有一些不溶的成份（多為多糖多酚類(lèi)物質(zhì)），可以通過(guò)12,000Xg離心10分鐘除去。7?使用8mMNaOH促進(jìn)DNA完全溶解。當(dāng)基因組DNA量較多時(shí)，在TEBuffer或滅菌水中不易完全溶解。此時(shí)可以使用8mMNaOH來(lái)溶解基因組DNA。經(jīng)8mMNaOH溶解的基因組DNA溶液因pH值較高，可能會(huì)影響長(zhǎng)期儲(chǔ)存及后續(xù)