實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的研究進(jìn)展及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用M140101006高金偉摘要：實(shí)時(shí)熒光定量PCR的是繼常規(guī)PCR之后分子生物學(xué)方法學(xué)研究的一大飛躍，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，在人類和動(dòng)物疾病的快速檢測(cè)、食品安全檢測(cè)、定量分析、基因分型、基因表達(dá)研究、以及疫苗效力測(cè)定中廣泛應(yīng)用，已成為分子生物學(xué)研究的重要工具。本文從實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理、熒光標(biāo)記技術(shù)、定量方法以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖研究領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀作了一個(gè)綜述。關(guān)鍵詞：熒光定量；PCR；熒光標(biāo)記；水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-timefluorescentquantitativePCR,real-timeFQ-PCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在普通PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。在熒光定量PCR技術(shù)發(fā)展的過程中，兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：一是TaqDNA多聚酶的5'端核酸外切酶活性被發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光標(biāo)記的探針，使得間接檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能；另一個(gè)是熒光雙標(biāo)記探針被使用在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過程。在1996年由美國AppliedBiosystems公司推出了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，它是利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析［1］。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量檢測(cè)的飛躍，而且所有反應(yīng)均在同一溶液中進(jìn)行，不需任何后處理過程，具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、定量結(jié)果具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)［2］。目前已得到廣泛應(yīng)用，包括對(duì)mRNA表達(dá)的研究、各種基因定量分析、點(diǎn)突變分析和等位基因分析、單核苷酸多態(tài)性分析、DNA甲基化的檢測(cè)及對(duì)各種傳染病進(jìn)行定量定性分析。1實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。工作原理在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加了熒光染料或熒光探針。而用于常規(guī)PCR的專門熱循環(huán)儀配備熒光檢測(cè)模塊，可監(jiān)測(cè)擴(kuò)增時(shí)的熒光。熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號(hào)，而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物增加完全同步。熒光探針法是指當(dāng)標(biāo)記在探針的5'端熒光報(bào)告基團(tuán)(reporterR)未被標(biāo)記在3’端淬滅基團(tuán)(quencherQ)抑制時(shí)，可檢測(cè)到報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)。檢測(cè)到的熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR反應(yīng)產(chǎn)物的量成正相關(guān)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。定量原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，使產(chǎn)物的數(shù)量與檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系，從而得出產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線。擴(kuò)增曲線有指數(shù)增長(zhǎng)期和非指數(shù)平臺(tái)期2個(gè)階段。在指數(shù)增長(zhǎng)階段，每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物量大約增加一倍。然而隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)體系組成成分的消耗，反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期(28~40個(gè)循環(huán))。只有在熒光信號(hào)擴(kuò)增期PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以在指數(shù)期的某一點(diǎn)上來檢測(cè)PCR產(chǎn)物的量，并由此推斷模板最初的含量。設(shè)定一定的熒光信號(hào)的域值(threshold)。如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過域值，就被認(rèn)為是真正的信號(hào)，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)Ct(C代表循環(huán)cycle,t代表域值threshold）［3］oCt值的含義是:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。公式表示：Ct=-klogX0+b（X0指原始模板數(shù)）。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。2實(shí)時(shí)熒光定量PCR熒光標(biāo)記技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。探針類熒光標(biāo)記物是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光染料是利用其它的一些理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。前者因增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高；后者的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行。熒光標(biāo)記探針按其基團(tuán)標(biāo)記和能量轉(zhuǎn)移的方式,目前已經(jīng)開發(fā)出幾種相關(guān)的技術(shù),大體可以分為水解探針和雜交探針兩類。TaqManTM探針（水解探針）、TaqManMGB（水解探針）、Dual-oligoFRETpairs（雙雜交探針）、MolecularBeacons（雜交探針）、ScorpionsTM/AmplifluorTM（雜交探針）、Universalprobelibrary-LNA（lockednucleicacids水解探針）、LUX（雜交探針）、Simpleprobe探針等［4］。水解探針TaqManTM及TaqMan系歹1」探針TaqManTM探針的長(zhǎng)度為20~24bp,在其5’末端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)，3’末端標(biāo)記一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，其序列與兩引物包含序列內(nèi)的一段DNA模板完全互補(bǔ)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收。TaqManMGB探針是在TaqMan探針的基礎(chǔ)上改進(jìn)的，長(zhǎng)度可縮短到13bp,在探針的3'端增加了MGB（minorgroovebinder）分子，能夠結(jié)合雙鏈DNA小溝部位，配對(duì)更容易，且節(jié)約了成本；MGB提高了探針的Tm值，能夠分辨1個(gè)堿基的差別（完全配對(duì)才有熒光信號(hào)）；連在MGB分子后的是非熒光物質(zhì)的淬滅基團(tuán)，這種探針淬滅效果更好、無背景熒光、熒光標(biāo)記靈活、提高熒光信號(hào)的信噪比等優(yōu)點(diǎn)。TaqMan-分子信標(biāo)（TaqMan-MB）是在分子信標(biāo)及TaqMan探針的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的一種更好、無背景熒光、熒光標(biāo)記靈活、提高熒光信號(hào)的信噪比等優(yōu)點(diǎn)。TaqMan-分子信標(biāo)（TaqMan-MB）是在分子信標(biāo)及TaqMan探針的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的一種均相熒光檢測(cè)探針，該探針保留了分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu),有效解決了背景熒光的問題,不同在于除環(huán)部序列外,其5’端的臂序列有基因識(shí)別位點(diǎn)［4］。當(dāng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步［3］。常用的熒光基團(tuán)是FAM、TET、HEX、TAMRA等［5］。Universalprobelibrary-LNA探針Universalprobelibrary-LNA（lockednucleicacids）是一種雙RNA聚合的類似物，其2’-O,4’-C形成亞甲基的橋鍵,這個(gè)連接限制了呋喃核糖環(huán)的靈活性,因而將其結(jié)構(gòu)鎖定成一個(gè)剛性的雙環(huán)模式,因此而提高雜交效率和優(yōu)越的穩(wěn)定性。在5’端和3’端分別標(biāo)記上熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán),單體摻入寡核苷序列可以增加形成體的Tm值,其穩(wěn)定性比PNA高（PNAS2000,97:563325638）因LNA與DNA雜交較DNA與DNA、DNA與RNA甚至PNA與DNA雜交有更高的親和性,故這種探針穩(wěn)定性最好；而且探針實(shí)現(xiàn)了設(shè)計(jì)迅速簡(jiǎn)單、低成本的水解探針特點(diǎn)［6］。cycling探針cycling探針是一種由DNA、RNA構(gòu)成的雜合探針，與RNaseH組合使用，內(nèi)部含有RNA堿基,5’端和3’端分別標(biāo)記熒光物質(zhì)與淬滅物質(zhì)。探針完整時(shí),熒光淬滅作用抑制熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。當(dāng)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列雜交，RNaseH切斷探針的RNA部分，淬滅作用解除,熒光物質(zhì)發(fā)出熒光［7］。雜交探針分子信標(biāo)技術(shù)分子信標(biāo)(molecularbeacon)技術(shù)是一種在游離狀態(tài)下呈莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loopstructure)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針，是TaqMan探針的衍生形式。環(huán)形部分可與靶DNA序列互補(bǔ)，一般為15~30bp；莖部核苷酸互補(bǔ)，但與靶DNA無序列同源性，一般5~7bp。在3'和5‘端即莖環(huán)結(jié)構(gòu)兩條臂的末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。探針游離時(shí)呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，兩端的熒光基團(tuán)緊密相鄰熒光信號(hào)被淬滅；在PCR變性后復(fù)性階段，分子信標(biāo)與模板雜交，從而打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成FRET，淬滅基團(tuán)的抑制作用被解除，釋放出熒光信號(hào)，熒光的強(qiáng)度與溶液中分子信標(biāo)的量成正比，也與被擴(kuò)增的模板量相對(duì)應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的定量檢測(cè)［8］。該方法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、特異性強(qiáng)、熒光背景低，其缺點(diǎn)是設(shè)計(jì)要求高、雜交探針不能完全與模板結(jié)合、穩(wěn)定性較差、探針合成的時(shí)候標(biāo)記較復(fù)雜。常用的熒光基團(tuán)有FAM和TexasRed。2.1.2.2雙雜交探針雙雜交探針(Dual-oligoFRETpairs)又稱為FRET探針或者LightCycle探針，采用兩條相鄰(距離1~5bp)、與模版互補(bǔ)的特異探針和一對(duì)序列特異性引物。第一個(gè)探針3’端帶有熒光供體，第二個(gè)探針的5’端帶有熒光受體。在3’端用熒光激發(fā)供體基團(tuán),在毗鄰探針5’端受體基團(tuán)處實(shí)施熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)。在PCR反應(yīng)變性后退火，探針頭尾相連地雜交在靶標(biāo)序列上，因此兩基團(tuán)靠近，從供體到受體產(chǎn)生FRET發(fā)出熒光，受體熒光信號(hào)的增加與擴(kuò)增子出現(xiàn)的量成比例［9］。檢測(cè)時(shí)只檢測(cè)受體基團(tuán)發(fā)出的熒光；變性時(shí)，兩探針游離，兩基團(tuán)距離遠(yuǎn)，不能檢測(cè)到熒光。該方法淬滅效率高，兩條探針均與目的基因特異性結(jié)合才能檢測(cè)到受體基團(tuán)發(fā)出的熒光，檢測(cè)的特異性增加。熒光淬滅的程度與起始模板的量成反比，以此可以進(jìn)行PCR定量分析。但兩個(gè)探針結(jié)合于模板上影響擴(kuò)增效率，合成兩個(gè)探針，成本相對(duì)較高。常用的熒光基團(tuán)：LC-Red640和LC-Red705［10］。復(fù)合探針法該法結(jié)合了分子信標(biāo)和LightCycler兩種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，為使用非熒光淬滅劑，本底低，對(duì)擴(kuò)增效率影響小，探針設(shè)計(jì)、合成、標(biāo)記、純化方便，是我國研究和開發(fā)的一種新型定量PCR技術(shù)。該技術(shù)的特點(diǎn)是先合成熒光探針后合成淬滅探針，熒光探針(25bp)5’端標(biāo)以熒光報(bào)告基團(tuán)，而淬滅探針(15bp)3'端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)，淬滅探針能與熒光探針5’端雜交，吸收熒光信號(hào)［8］。當(dāng)反應(yīng)中無模板時(shí)，兩探針結(jié)合形成復(fù)合探針，熒光探針發(fā)出的熒光被淬滅探針吸收，無熒光產(chǎn)生；當(dāng)反應(yīng)溶液中有模板時(shí)，在PCR復(fù)性階段熒光探針優(yōu)先與模板結(jié)合，兩探針分離，產(chǎn)生熒光，其強(qiáng)度與PCR體系中模板數(shù)量成正比，可進(jìn)行PCR定量［9］。2.1.3熒光標(biāo)記引物熒光引物法是從分子信標(biāo)的概念變化而產(chǎn)生的一種聯(lián)合分子探針系統(tǒng)，它是把熒光基團(tuán)標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列直接與PCR引物相結(jié)合，從而使熒光標(biāo)記基團(tuán)直接摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中。目前主要有Amplifluor,Sunrise,Amplisensor,Scorpion,LUX(lightuponextent-ion)等。2.1.4其他探針Simple探針和神標(biāo)熒光探針。Simple探針只在5’端標(biāo)有報(bào)告熒光，在報(bào)告熒光和5’端之間連接一種“l(fā)inker”結(jié)構(gòu)，當(dāng)在高溫條件下，"linker”結(jié)構(gòu)改變，釋放熒光。這種探針的優(yōu)點(diǎn)是不用淬滅基團(tuán)，無背景熒光。神標(biāo)熒光探針是AlleLogic公司新發(fā)明的一種熒光探針。該探針操作簡(jiǎn)單、成本低，效果比常規(guī)TaqMan探針增加60%，試驗(yàn)設(shè)備無需更換。它不需要熒光淬滅基團(tuán)，是在單一鏈DNA序列上多重標(biāo)記恰當(dāng)?shù)?、易處理的熒光染料?1］。雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合染料目前用于實(shí)時(shí)PCR的主要dsDNA結(jié)合染料SYBRGreenI是一種非飽和菁類熒光素，可以嵌合于DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的小溝中，發(fā)射熒光信號(hào)；而不摻入鏈中的染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。結(jié)合dsDNA后熒光強(qiáng)度的增加與初始模板量相關(guān)，可以進(jìn)行定量DNA分析。SYBRGreenI染料法與探針法相比，其檢測(cè)方法更簡(jiǎn)便，同時(shí)降低了成本。但該染料能夠結(jié)合任何dsDNA分子，特異性差；對(duì)PCR有一定的抑制性，且熒光強(qiáng)度低，穩(wěn)定性差。目前已針對(duì)SYBRGreenI的缺點(diǎn)開發(fā)了一些改進(jìn)染料，如SYBRGreenER、PowerSYBR等可以通過優(yōu)化PCR的反應(yīng)條件，減少或去除非特異性產(chǎn)物和引物二聚體的產(chǎn)生，另外，也可以借助融解曲線分析法來區(qū)分非特異性產(chǎn)物和引物二聚體而進(jìn)行定性診斷。3實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的幾種定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法的絕對(duì)定量絕對(duì)定量FQ-PCR一般用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在相同的條件下目的基因測(cè)得的熒光信號(hào)量同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而得到目的基因的量［12］。該標(biāo)準(zhǔn)品可以是純化的質(zhì)粒DNA、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、體外轉(zhuǎn)錄的RNA或者是化學(xué)合成的目的基因。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光值并用DNA或RNA的分子量來轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)確定。將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，并以此為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測(cè)得的CT值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過此標(biāo)準(zhǔn)曲線與被測(cè)樣品的CT值，即可對(duì)樣品進(jìn)行定量。該法優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定、準(zhǔn)確。如果想要明確得到樣本的初始濃度或病毒載量，則使用絕對(duì)定量法最佳。無參照基因法的相對(duì)定量在該方法同時(shí)擴(kuò)增待測(cè)靶基因片段和一個(gè)內(nèi)源性管家基因片段，測(cè)得兩者的CT值之差。CT)，不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線，而是運(yùn)用數(shù)學(xué)公式來計(jì)算相對(duì)量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到CT值來反映起始模板的量，1個(gè)循環(huán)(CT=1)的不同相當(dāng)于起始模板數(shù)2倍的差異。比較不同待測(cè)標(biāo)本的△CT值與正常標(biāo)本的△CT值的變化，即可對(duì)待測(cè)標(biāo)本靶基因的原始拷貝數(shù)作出判斷，進(jìn)而診斷出待測(cè)標(biāo)本的病理狀況。該法得出的結(jié)果也是目的基因同管家基因的比值。但是此方法以靶基因和管家基因的擴(kuò)增效率基本一致為前提，效率的偏移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì)。以參照基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)的相對(duì)定量該法能準(zhǔn)確的量化初始材料的載量，檢測(cè)的結(jié)果是目的基因與參照基因的比值，只要參照基因恒定，比值的變化也就反映了目的基因的變化。由于結(jié)果是一個(gè)相對(duì)值，所以只需知道標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋梯度即可。此法的關(guān)鍵是選取參照基因，由于管家基因通常恒定表達(dá)且表達(dá)水平不易受外界實(shí)驗(yàn)條件影響，所以常作為參照基因，來衡量不同來源基因的表達(dá)量。常用的管家基因有B-actin、B2-微球蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶等(GAPDH)、18SrRNA等。該管家基因主要是用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較、顯示反應(yīng)體系內(nèi)是否存影響PCR擴(kuò)增的因素以及彌補(bǔ)樣本組織量的差異。目前有2-A△CT(Livak)方法、用參照基因的△CT法進(jìn)行相對(duì)定量的方法。4Real-timePCR技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中的應(yīng)用病原體定量檢測(cè)Real-timePCR技術(shù)最有價(jià)值的應(yīng)用領(lǐng)域就是臨床診斷。該技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出高至101低至100個(gè)拷貝的病原體，定量檢測(cè)范圍極寬。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病(包括細(xì)菌、病毒等)的診斷，為預(yù)防和控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的疾病提供了重要的技術(shù)支持。王忠發(fā)等［13］應(yīng)用TaqMan探針技術(shù)建立了一種快速、特異、靈敏的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)對(duì)蝦WSSV的方法。其靈敏度超過標(biāo)準(zhǔn)方法的101-105倍，特異性與標(biāo)準(zhǔn)方法100%吻合。檢測(cè)時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)方法的1/24。張利峰等［14］運(yùn)用探針技術(shù)建立了快速檢測(cè)鯉春病病毒癥(SpringViraemiaofCarp,SVC)的熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)，并應(yīng)用該技術(shù)對(duì)病魚的組織臟器中的病毒分布和病毒量進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該病毒在腸、腎和鰓組織的含量最高，肌肉、腦組織次之?；虮磉_(dá)研究Real-timePCR技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的另一個(gè)重要的應(yīng)用就是特定基因表達(dá)水平的研究，即水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物生理變化相關(guān)的細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平的評(píng)估。目前檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)變化的方法很多，但是由于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法（如ELISA）靈敏度較低，常規(guī)PCR方法檢測(cè)mRNA無法定量的缺點(diǎn)，Real-timePCR技術(shù)以其敏感、準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)在檢測(cè)各組織細(xì)胞mRNA表達(dá)水平，特定基因在不同組織中的表達(dá)水平及特定基因在不同時(shí)期的表達(dá)差異、比較正常組織與病理組織中各種mRNA表達(dá)量差異等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［15］。Johansen等［16］利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)彩虹鮭魚新陳代謝相關(guān)的基因及肌肉特異性基因的表達(dá)水平的變化，研究了其在經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間的饑餓再恢復(fù)喂食過程中的新陳代謝情況，及恢復(fù)喂食后鯉魚肌肉的生長(zhǎng)速度。藥物及疫苗功效考核針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物感染性疾?。ú《静?、細(xì)菌病等）和其他特定生理方面的需要而研制的疫苗和藥物，在開發(fā)過程中，快速了解疫苗和藥物的功效，可以為其開發(fā)節(jié)約大量的人力、時(shí)間和資金。因此對(duì)于藥物及疫苗的療效的評(píng)估就顯得很重要。Real-timePCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確定量、靈敏地測(cè)定特定免疫蛋白的基因表達(dá)水平來間接的評(píng)價(jià)疫苗和藥物的功效。宋艷等［17］運(yùn)用TaqMan探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究了GnRH-A及其配伍對(duì)魚卵成熟、受精相關(guān)基因ZP3的調(diào)控。研究結(jié)果顯示，LHRH-A2+DOM組合既能使ZP3基因表達(dá)達(dá)峰時(shí)間顯著提前，又能顯著提高表達(dá)峰值，可能是較好的魚類催產(chǎn)藥物配伍。水產(chǎn)品的快速商檢江河、湖泊、近海等水源的污染是導(dǎo)致水產(chǎn)品不安全的一個(gè)重要因素。而利用這樣的水源生產(chǎn)的水產(chǎn)品常常會(huì)受到細(xì)菌、病毒等病原微生物的污染，嚴(yán)重影響到了水產(chǎn)品的安全性，給人體造成潛在的威脅。如軟體類、蝦類、魚類等是重要的水產(chǎn)品，同時(shí)也是多種人類病原微生物的中間宿主。Real-timePCR技術(shù)在水產(chǎn)品快速商檢上的應(yīng)用無疑為水產(chǎn)品安全提供了關(guān)鍵技術(shù)。蔡潭溪等［18］應(yīng)用TaqMan探針的Real-timePCR方法，定量檢測(cè)海產(chǎn)品中副溶性弧菌（Vibrioparahaemolyticus），與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法和生化鑒定相比，具有更加省時(shí)、操作簡(jiǎn)便和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)水產(chǎn)品中存在的副溶性弧菌的監(jiān)控有著重要的實(shí)際意義。4.5養(yǎng)殖水環(huán)境的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生物標(biāo)志物Biomarker作為指示污染物危害效應(yīng)的早期生物信號(hào)，對(duì)其研究有助于早期識(shí)別外來污染物對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的影響，從而有利于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的危險(xiǎn)度評(píng)估。目前國內(nèi)外已經(jīng)有很多學(xué)者報(bào)道了實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于定量檢測(cè)生物標(biāo)記物。CYP450基因的表達(dá)可受許多因素的影響，體外許多化學(xué)物質(zhì)（如氟甲氧氟烷、二乙醚、三氯乙烯、氯仿等）對(duì)CYP450基因表達(dá)有誘導(dǎo)作用，上調(diào)CYP450基因的表達(dá)［19］。因此，可以把CYP450基因作為三氯乙烯、氯仿、苯、對(duì)乙酰氨基酚等有機(jī)物污染的生物標(biāo)記物。Rees等建立了SYBRgreen實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)直接定量檢測(cè)經(jīng)B-萘黃銅誘導(dǎo)后大西洋鮭魚Salmosalar各組織CYP1A基因的表達(dá)水平，并應(yīng)用于評(píng)估米羅河中多氯化聯(lián)苯的含量［20］。5展望Real-timePCR技術(shù)是核酸檢測(cè)和定量技術(shù)的一次飛躍，對(duì)現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究過程中起到了重要的作用。隨著Real-timePCR技術(shù)的不斷改進(jìn)與完善以及新的熒光化學(xué)物質(zhì)的不斷開發(fā)，Real-timePCR技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，已逐漸成為科研的重要工具。隨著Real-timePCR技術(shù)與微解剖技術(shù)、肽核酸技術(shù)和生物芯片技術(shù)等先進(jìn)技術(shù)的整合，水產(chǎn)養(yǎng)殖中遇到的一些技術(shù)難題很容易得到解決，其未來的應(yīng)用前景是令人鼓舞的，對(duì)水產(chǎn)分子生物學(xué)的發(fā)展有著深遠(yuǎn)的影響，必將在水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究中發(fā)揮巨大的作用。參考文獻(xiàn)：RajeevanMS,RanamukhaarachchiDG,VernonSD,etal.Useofreal-timequantitativePCRtovalidatetheresultsofcDNAarrayanddifferentialdisplayPCRtechnologies[J].Methods,2001,25:443-451.KeLD,ChenZ,YungWK.Areliabilitytestofstandard-basedquantitativePCR:Exogenousvsendogenousstandards[J].MolecularandCellularProbes,2000,14(2):127-135.⑶李文濤，王俊東，楊利峰，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用J].生物技術(shù)通訊,2006,17(1):112-114.MarisaL,WongandJuanF.Medrano.Real-timePCRformRNAquantitation[J].BioTechniques,2005,39:75-85.[5]蔣春燕，王泰健，王琴等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,26(12):97-101.⑹趙煥英，包金風(fēng).實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志.2007,16(4):90-93.[7]鄧文星，張映.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)綜述J].生物技術(shù)通報(bào),2007(5):94-95.⑻胡騎，程安春，汪銘書.熒光定量技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine,2006(11):32-34.[9]郭楊，陳世界，郭萬柱，等.熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(2):78-82.[10]袁媛，陳強(qiáng)，陳思祗，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其在生命科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2006,12(5):18-20.[11]葛忠源，熊東艷，張啟勇.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及應(yīng)用J].中國牧業(yè)通訊，2008(13):12-14.ThomasDSchmittgen1&KennethJLivak,Analyzingreal-timePCRdatabythecomparativeCTmethod[J]