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Plantregenerationviasomaticembryogenesis

andshootorganogenesisfrom

immaturecotyledonsofCamellianitidissimaChi

金花茶未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生、芽器官發(fā)生及植株再生的研究

JournalofPlantPhysiology170(2013)

1202–1211報(bào)告人：摘要

金花茶（山茶科）是世界著名的經(jīng)濟(jì)觀賞植物，花為金黃色。在中國(guó)它屬于稀有和瀕危植物。本文的目的是誘導(dǎo)金花茶體細(xì)胞胚胎發(fā)生，芽器官發(fā)生并使植株再生。在改良的WPM培養(yǎng)基上附加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑得到三種類型的愈傷組織（白色，紅色和黃色）。在這些愈傷組織中，白色愈傷組織，是4.5μm2,4-D誘導(dǎo)的，紅色和黃色愈傷組織是由高濃度的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的，TDZ或6-BA單獨(dú)或結(jié)合弱活性的生長(zhǎng)素NAA。胚性愈傷組織可以分化成體細(xì)胞胚，球狀胚性結(jié)構(gòu)或不定芽，這取決于在WPM培養(yǎng)基上用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。6-BA是最好的芽誘導(dǎo)激素，ZT是最好的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的激素，KT是最好的誘導(dǎo)球狀胚性結(jié)構(gòu)形成的激素。三種再生途徑往往發(fā)生在同一塊胚性愈傷組織團(tuán)上。大多數(shù)芽（80%）在WPM添加IBA24.6μm和NAA0.3μm根系發(fā)達(dá)。而47.5%的體細(xì)胞胚能直接萌發(fā)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.9μm6-BA和0.1μmNAA。球狀胚性愈傷組織，可在兩個(gè)分化途徑：芽器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生，進(jìn)行周期性的培養(yǎng)。由芽生根獲得的植株和體細(xì)胞胚萌發(fā)得到的植株均移植到溫室土壤中；8周后，從芽培養(yǎng)得到的苗及體細(xì)胞胚發(fā)育的苗的存活率分別為66.7%和78.6%。概述

金花茶生長(zhǎng)分布范圍較窄，僅在海拔為50-650米的中國(guó)西南部和越南北部有分布（張任，1998），通常生長(zhǎng)在陰暗潮濕的山谷常綠闊葉林里?；ㄖ睆綖?–10厘米，色澤金黃，被譽(yù)為“茶皇后”和“植物王國(guó)的大熊貓”（梁，1993）。金花茶在全球作為一種重要的山茶物種和非常寶貴的品種選育資源已被介紹到日本、澳大利亞和美國(guó)北部作為遺傳資源進(jìn)行商業(yè)化種植。近年來(lái)，金花茶的花被鑒定出有多酚類抗氧化劑的存在引起了研究者的關(guān)注（Song等人，2011；萬(wàn)等人，2011）。由于人為破壞增加，自然更新緩慢，其自然種群數(shù)量近幾十年來(lái)已經(jīng)大大下降，現(xiàn)在列為中國(guó)一級(jí)瀕危植物（興，2005）。這種植物的瀕危機(jī)制和相關(guān)遺傳多樣性已被廣泛的研究（唐等人，2006；韋等人，2008a，2008b。；陳等人，2010；魏等人，2010）。

在自然環(huán)境中，金花茶唯一繁殖途徑是種子繁殖（楊等人，2008）雖然無(wú)性繁殖存在一些研究，包括扦插和嫁接（郭等人，2008；江等人，2010）。相同的山茶屬植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生也有報(bào)道（衛(wèi)特斯等人，1991；蒙代爾等人，2004；蒙道，2011）。最成功報(bào)道是山茶屬植物滇山茶的子葉誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生并獲得了再生植株。然而，關(guān)于金華茶的組織培養(yǎng)并成功獲得再生植株的報(bào)道，尚未存在。盡管我國(guó)的自然保護(hù)區(qū)已對(duì)金花茶進(jìn)行了保護(hù)，但用傳統(tǒng)的繁殖方法繁殖速度慢，對(duì)母樹(shù)有破壞，而相對(duì)的組織培養(yǎng)能夠解決這些問(wèn)題，因此本研究是要用未成熟合子胚的子葉為外植體，通過(guò)三種不同的途徑（芽器官發(fā)生，球形胚性結(jié)構(gòu)，體細(xì)胞胚）建立一個(gè)有效的高頻率的再生體系。材料與方法實(shí)驗(yàn)材料

連續(xù)三年在七月初（2009-2011年），金花茶的未成熟果實(shí)在5月左右從成年樹(shù)上采摘，地點(diǎn)是中國(guó)廣州，南方植物園。

除去果皮，取出未成熟的種子，在0.1％HgCl2（升汞）水溶液消毒8分鐘，在無(wú)菌蒸餾水中沖洗5-8次，然后用解剖刀剝?nèi)シN皮。

早期合子胚萌發(fā)是在改良WPM（麥科恩和勞埃德，1981年），不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。這種基本培養(yǎng)基里含有3％蔗糖和凝固劑用0.7％瓊脂（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，美國(guó)），溶解并分裝到高10厘米和直徑6厘米的培養(yǎng)瓶里。pH調(diào)整為5.9，在121℃的高壓滅菌鍋里滅菌15min。培養(yǎng)物放在14小時(shí)的光培養(yǎng)，溫度為25±2℃的培養(yǎng)箱里。這些培養(yǎng)條件同于所有的實(shí)驗(yàn)中，除非另有說(shuō)明。

2周培養(yǎng)后，由未成熟合子胚發(fā)育的子葉作為外植體。愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)過(guò)程中的褐化防治

培養(yǎng)期間，附加不同添加劑和光照條件下進(jìn)行比較愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)抑制褐變和評(píng)估褐變能否被更好的抑制。改良WPM培養(yǎng)基中附加2.3μmTDZ和活性炭（AC;0.5，3.0g/L）2或硝酸銀（AgNO3;5.0，10.0,15.0，20.0mg/L）。在黃色愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)，分別在高的光強(qiáng)度，自然光，或暗。每種處理有30個(gè)外植體，每個(gè)處理重復(fù)三次。培養(yǎng)物每周觀察，超過(guò)5周。選擇出最好的防褐變方法。子葉誘導(dǎo)愈傷組織

用解剖刀切下合子胚子葉產(chǎn)生的愈傷組織接種在改良WPM基本培養(yǎng)基里，附加20mg/LAgNO3和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)愈傷組織（表1）。TDZ、GA3、IAA、和ZT是過(guò)濾器（0.24μm）滅菌并加入滅菌冷卻的培養(yǎng)基里。而6-BA，IBA，KT，以及NAA高壓滅菌前就加入到培養(yǎng)基里。每組30個(gè)外植體，并且所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。每月觀察愈傷組織的誘導(dǎo)率，以百分比表示。9周培養(yǎng)后，對(duì)誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行了分析研究。

誘導(dǎo)胚性愈傷組織

附加9.0μm的6-BA和1.0μm的NAA產(chǎn)生的黃色胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到附加20mg/LAgNO3，NAA（0.3或

0.1μm）結(jié)合KT（2.3或9.0μm）、6-BA（2.3或9.0μm）、TDZ（2.3μm）和ZT（2.3或9.0μm）的改良的WPM基本培養(yǎng)基中（表2和3）觀察愈傷組織分化情況。

芽的伸長(zhǎng)與增殖

胚性愈傷產(chǎn)生的不定芽轉(zhuǎn)移到改良WPM培養(yǎng)基附加20mg/LAgNO3，6-BA(0.9,2.3,9.0,22.5μm),和NAA(0.1,0.3μm)里進(jìn)行芽伸長(zhǎng)和增殖試驗(yàn)（表4）。每個(gè)處理30個(gè)芽，重復(fù)3次。每月觀察并記錄數(shù)據(jù)，共16周。不定芽增殖系數(shù)為接種后不定芽數(shù)量/接種前芽數(shù)量。

生根及馴化

芽的高度達(dá)到3-4厘米時(shí),切下，轉(zhuǎn)移到附加20mg/LAgNO3和和附加單一植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，IBA(5.0、49.2μm)和NAA(0,2.5μm),誘導(dǎo)生根。培養(yǎng)5-7周后，根形成。在培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周后，植株達(dá)到4-6片葉和5-7厘米，從培養(yǎng)瓶中取出，把瓊脂清洗干凈，60個(gè)植株移植到花盆里，黃土：泥炭：蛭石=1:1:1?；ㄅ璺旁谡诠饴蕿?0%的棚內(nèi)。每天澆水。8周后，統(tǒng)計(jì)存活率。體細(xì)胞胚萌發(fā)為完整植株

體細(xì)胞胚的培養(yǎng)和萌發(fā)是在附加20mg/LAgNO3,0.9μm

6-BA和0.1μmNAA的培養(yǎng)基里。培養(yǎng)13周后，研究植株再生率。60個(gè)植株移植到花盆里，黃土：泥炭：蛭石=1:1:1?；ㄅ璺旁谡诠饴蕿?0%的棚內(nèi)。每天澆水。8周后，統(tǒng)計(jì)存活率。球狀胚性結(jié)構(gòu)組織學(xué)研究

研究球狀胚性結(jié)構(gòu)的個(gè)體發(fā)生和發(fā)育過(guò)程，球狀胚性結(jié)構(gòu)是在培養(yǎng)基里附加2.3μmKT產(chǎn)生的，將培養(yǎng)物暗培養(yǎng)三十天后，轉(zhuǎn)移到弱光照條件下培養(yǎng)。將培養(yǎng)2、4、6、8、10、12周的愈傷團(tuán)用FAA固定液固定，在室溫下放置超過(guò)24小時(shí)。然后將樣品轉(zhuǎn)移到酒精中進(jìn)行一系列的脫水處理，用蘇木精著色，用石蠟包埋。用旋轉(zhuǎn)式薄片切片機(jī)切成8-10μm的薄片，壓片，在顯微鏡下觀察并拍照。不同基本培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷分化的影響

比較MS培養(yǎng)基和改良WPM培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷組織分化的影響，在培養(yǎng)基里加入相同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和AgNO320mg/L做對(duì)比試驗(yàn),觀察并記錄結(jié)果。包括不定芽，體細(xì)胞胚的發(fā)生數(shù)量。數(shù)據(jù)分析

所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每隔兩周重復(fù)一次。每種試驗(yàn)處理有五個(gè)培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶里有六個(gè)外植體。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為正交試驗(yàn)，數(shù)據(jù)用SPSS軟件分析處理。

在愈傷組織誘導(dǎo)期間會(huì)產(chǎn)生褐化現(xiàn)象，光照強(qiáng)度大，增加褐化現(xiàn)象，隨光照強(qiáng)度的減弱，褐化現(xiàn)象會(huì)減弱。在繼代增殖和分化階段AgNO3能夠抑制褐化現(xiàn)象。硝酸銀的最佳抑制褐化的濃度為15-20mg/L?；钚蕴繚舛仍?.5-3.0mg/L范圍，不能抑制褐化現(xiàn)象，每種濃度的現(xiàn)象無(wú)明顯區(qū)別。結(jié)果與分析不同方法對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)過(guò)程中的褐化現(xiàn)象的影響

不同濃度激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響由第2類型愈傷組織誘導(dǎo)獲得的三種再生途徑球形胚性結(jié)構(gòu)的次生分化不同濃度6-BA和NAA對(duì)芽分化的影響經(jīng)過(guò)九周培養(yǎng)胚性愈傷組織在改良WPM培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基上的分化比較討論

山茶科植物進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，其體內(nèi)有大量的苯酚滲出，它經(jīng)歷酶促氧化反應(yīng)，形成一些有毒化合物釋放到培養(yǎng)基里（蒙達(dá)爾等人,2004）。相同的現(xiàn)象在金花茶培養(yǎng)過(guò)程中也有出現(xiàn)。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物，如酚和氫醌已被檢測(cè)出可能妨礙組織培養(yǎng)中的外植體的生長(zhǎng)和分化（衛(wèi)等人,2008;宋等人,2011）。一些方法常用來(lái)克服褐變?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程中的有害影響，包括使用各種化學(xué)品，如抗壞血酸，吸附劑，如活性炭或?qū)⑼庵搀w轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基里，這些方法都獲得了不同程度的成功（Agarwal等人,1992;Pandidurai等人,1996）。在這項(xiàng)研究中，AgNO3加入到培養(yǎng)基中成功地控制了褐變。這是山茶科組織培養(yǎng)中使用AgNO3作為抗褐變劑的首次報(bào)告。

山茶科組織培養(yǎng)最常用的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，而WPM培養(yǎng)基很少使用（蒙達(dá)爾等人,2004;蒙代爾,2011），這項(xiàng)研究中，我們比較了MS和WPM培養(yǎng)基在金花茶胚性愈傷組織的分化中的影響，結(jié)果表明WPM培養(yǎng)基效果是顯著好于MS培養(yǎng)基的。在培養(yǎng)基中添加6-BA（1-6mg/L）和IBA（0.01-2.0mg/L），是非常適合于芽誘導(dǎo)和增殖（蒙達(dá)爾等人,2004）。體細(xì)胞胚胎發(fā)生被認(rèn)為是山茶科的最有效的再生途徑（Jain,1990）。一般情況下，高細(xì)胞分裂素結(jié)合低生長(zhǎng)素或只單獨(dú)使用細(xì)胞分裂素被發(fā)現(xiàn)在山茶科中的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)是必要的。在隨后的繼代培養(yǎng)中，分裂素要減少或不添加（蒙達(dá)爾等人,2004）。

我們的研究結(jié)果表明，以子葉為外植體，單獨(dú)使用2,4-D（4.5bM）可誘導(dǎo)小的白色的愈傷組織，它在任何培養(yǎng)基上從未出現(xiàn)分化現(xiàn)象。本研究中，所有的細(xì)胞分裂素（TDZ，6-BA，KT，和ZT），單獨(dú)或與NAA組合使用，均可以誘導(dǎo)胚性愈傷組織。其中，TDZ誘導(dǎo)的酒紅色愈傷組織有很強(qiáng)的活性，也可以分化成不定芽或體細(xì)胞胚。但是，不能分化為不定芽和體細(xì)胞胚的愈傷組，經(jīng)過(guò)11周的培養(yǎng)，會(huì)逐漸變成褐色，最終壞死。

細(xì)胞分裂素（TDZ，6-BA，KT，和ZT），單獨(dú)或與NAA組合使用，可以同時(shí)誘導(dǎo)芽器官發(fā)生，體細(xì)胞胚胎發(fā)生和球狀胚性結(jié)構(gòu)。然而，他們出現(xiàn)的頻率一定的差異：

6-BA是最好的不定芽誘導(dǎo)激素，ZT是最適合誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的激素，而KT是最好的誘導(dǎo)球狀胚性結(jié)構(gòu)形成的激素。

本研究通過(guò)金花茶的未成熟子葉誘導(dǎo)愈傷組織并獲得再生植株過(guò)程進(jìn)行了研究。通過(guò)器官發(fā)生和體細(xì)胞胚發(fā)生，直接或間接地再生，顯然可能的（圖6）。胚性愈傷組織誘導(dǎo)需要加入強(qiáng)烈活性的細(xì)胞分裂素，TDZ或6-BA，單獨(dú)使用或與弱活性生長(zhǎng)素，萘乙酸，IAA或IBA的組合。胚性愈傷組織可以分化成體細(xì)胞胚，球狀胚性愈傷結(jié)構(gòu)，或