骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定,醫(yī)學(xué)工程論文

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定,醫(yī)學(xué)工程論文為探尋求索一種簡便有效的方式方法，本研究采用全骨髓貼壁法對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞〔BMSCs〕進(jìn)行分離培養(yǎng)及初步鑒定，以使其更好地服務(wù)于臨床應(yīng)用。本研究通過全骨髓分離法獲得大鼠BMSCs,化學(xué)藥物〔-ME〕誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，從細(xì)胞的強(qiáng)增殖能力、細(xì)胞的外表標(biāo)記物及分化潛能3方面對分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，在長時間的未進(jìn)行換液的體外細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)過中發(fā)現(xiàn)BMSCs可能存在自分化現(xiàn)象，筆者以為，自分化對于BMSCs的臨床治療機(jī)制的研究極為重要。當(dāng)前，國內(nèi)學(xué)者對BMSCs的研究牽涉較少。1材料與方式方法1.1實驗動物清潔級2周齡雄性大鼠一只〔體質(zhì)量75g,由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供〕.1.2試劑DMEM/F12和胎牛血清；胰蛋白酶；兔抗大鼠FITC-CD29、PE-CD90單克隆抗體；兔抗大鼠Nse單克隆抗體，SABC免疫組化試劑盒〔北京欣博盛生物科技有限公司〕.1.3BMSCs的分離、培養(yǎng)及傳代大鼠斷頸處死，無菌分離四肢長骨，暴露骨髓腔，用注射器汲取無血清培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔，收集沖洗液，離心〔800r/min6min〕,棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)后以109/ml密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶，記P0,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后半量換液，以后每3天換液一次。至10~13d左右，貼壁細(xì)胞80%~90%匯合時，0.125%胰酶消化，約1~2min,1傳2,記P1,以此類推，利用BMSCs易消化的特點到達(dá)純化目的，須嚴(yán)格控制酶的量和消化時間。每次傳代用新培養(yǎng)瓶，以棄去貼壁非常牢固的細(xì)胞，通太多次傳代對細(xì)胞進(jìn)行純化。1.4形態(tài)學(xué)觀察用倒置顯微鏡觀察并拍照1.5BMSCs細(xì)胞表型鑒定取生長良好的P3代細(xì)胞，制成細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛固定30min,10%BSA封閉30min,將適度稀釋的熒光標(biāo)記的單克隆抗體FITC-CD29、PE-CD90分別參加不同的切片上4℃過夜，熒光顯微鏡下觀察熒光分布，拍照。1.6BMSCs定向誘導(dǎo)分化取同一批P3代細(xì)胞，制成細(xì)胞爬片，適當(dāng)培養(yǎng)待貼壁后分為對照組和誘導(dǎo)劑組。誘導(dǎo)劑組采用1mmol/L-ME的10%FBS低糖DMEM預(yù)誘導(dǎo)，24h后用含2mmol/L-ME無血清低糖DMEM誘導(dǎo)6h,對照組中不加誘導(dǎo)劑，一直培養(yǎng)。1.7神經(jīng)元樣細(xì)胞的免疫組化鑒定采用SABC免疫組化法，用4%多聚甲醛固定30min,0.1%TritonX-100透膜30min,3%H2O2/甲醇消除內(nèi)源性過氧化物酶，封閉血清孵育20min,將一抗〔兔抗大鼠Nse〕按適當(dāng)比例加于玻片上，4℃濕盒內(nèi)過夜，次日加生物素化二抗后37℃下孵育30min,加SABC,DAB顯色，蘇木素復(fù)染，觀察，拍照，以PBS代替一抗作陰性對照。2結(jié)果2.1倒置顯微鏡觀察原代分離的細(xì)胞大小均一、圓形、折光性強(qiáng)，懸浮，紅細(xì)胞居多；48h后可見部分細(xì)胞貼壁，成短梭形；4~5d開場快速增殖；培養(yǎng)8~10d后細(xì)胞漸鋪滿培養(yǎng)瓶，成長梭形，漩渦狀生長〔圖A〕,此時結(jié)束原代培養(yǎng)，進(jìn)行傳代擴(kuò)增，以去除結(jié)節(jié)狀分布的小圓形細(xì)胞〔圖B〕和長梭形的貼壁性強(qiáng)的成纖維樣細(xì)胞〔圖C〕.傳代培養(yǎng)的細(xì)胞3~4h即貼壁，細(xì)胞增殖后以梭形為主，排列有明顯方向性〔圖D-F〕.不添加任何生長因子，細(xì)胞傳5~6代左右，老化現(xiàn)象嚴(yán)重。2.2BMSCs表型鑒定P3代細(xì)胞免疫熒光顯示BMSC的外表標(biāo)記物CD29、CD90陽性〔圖G-H〕.2.3BMSCs的神經(jīng)元誘導(dǎo)結(jié)果倒置顯微鏡觀察，BMSCs在1h左右開場，即發(fā)生形態(tài)變化，扁平、梭形的細(xì)胞胞漿回縮，向核集中，1~3d后出現(xiàn)多個延長的胞體突起，類似于神經(jīng)元樣細(xì)胞的假足〔圖I〕;而空白組始終未變化〔圖J〕.免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，實驗組神經(jīng)元樣細(xì)胞的胞體及部分突起成棕黃色，Nse陽性表示出〔圖K-M〕;與誘導(dǎo)組同時間點的空白組幾乎全為陰性〔圖N〕.2.4未加任何誘導(dǎo)劑組空白組培養(yǎng)30d左右時BMSCs的自分化觀察，可見神經(jīng)樣細(xì)胞和圓形透亮的凋亡細(xì)胞?！矆DO-Q〕。3討論BMSCs是骨髓中除造血干細(xì)胞以外的非造血性干細(xì)胞，正常時只要極少數(shù)在增殖期，在骨髓中的豐度很低，約占骨髓有核細(xì)胞的0.001%~0.01%,但取材方便，易于體外分離和擴(kuò)增，具有多向分化的潛能.當(dāng)前獲取BMSCs的方式方法主要有貼壁挑選法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞分選法、免疫磁珠法4種.本實驗通過全骨髓貼壁法，利用細(xì)胞不同的貼壁特性，隨傳代完成對BMSCs的純化，并通過誘導(dǎo)證實了其分化能力，為今后進(jìn)一步的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的尚未分化的原始細(xì)胞，具有經(jīng)培養(yǎng)不定期的分化并產(chǎn)生特化細(xì)胞的能力，根據(jù)來源不同可分為造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等。間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于機(jī)體的多種組織〔骨髓、臍帶血、脂肪組織等〕中，BMSCs是骨髓中胚層未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，正常時只要極少數(shù)處于增殖期，在骨髓中的豐度很低，約占骨髓細(xì)胞總數(shù)的0.001%~0.1%,是由形態(tài)、增殖能力及分化潛能各不一樣的不同亞型的異型性細(xì)胞群構(gòu)成.由于當(dāng)前尚缺乏特異的干細(xì)胞標(biāo)記物，也難以通過分化或增殖能力的不同，將一種亞型同另一種亞型區(qū)分開來，因而無統(tǒng)一的獲取高純度BMSCs的方式方法。對于BMSCs的體外分離培養(yǎng)主要有下面4種：密度梯度離心法、全骨髓貼壁法、流式細(xì)胞分選法、免疫磁珠法?！?〕密度梯度離心法利用骨髓細(xì)胞成分的比重不同采用細(xì)胞分離液有效的將骨髓細(xì)胞分層且對細(xì)胞活性影響小，但缺點在于毀壞BMSCs相應(yīng)的微環(huán)境，丟失大量可能促進(jìn)BMSCs生長的細(xì)胞因子；〔2〕免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀挑選技術(shù)法在分選經(jīng)過中，對細(xì)胞的活性影響十分大，可導(dǎo)致提取的細(xì)胞活性喪失、增殖能力消失，而且消耗損費(fèi)宏大，因而應(yīng)用也普遍較少；〔3〕全骨髓貼壁法作為一種簡單、經(jīng)濟(jì)、高效的方式方法，被越來越多的應(yīng)用.研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs介入構(gòu)成造血干細(xì)胞的生存和分化的微環(huán)境，通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分對造血干細(xì)胞的分化成熟進(jìn)行調(diào)控，體外培養(yǎng)條件下可跨胚層多向分化，具有很強(qiáng)的可塑性.當(dāng)前大多數(shù)實驗室通過BMSCs不表示出造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD14、CD34、CD11b和白細(xì)胞外表標(biāo)記物CD45,而表示出CD29、CD44、CD71、CD90和CD106等標(biāo)記物進(jìn)行初步鑒定；階段特異性胚胎干細(xì)胞抗原-4〔SSEA-4〕和神經(jīng)節(jié)苷酯〔Ganglioside〕可用于準(zhǔn)確鑒定BMSCs,以及如今正在研制的用特異性單克隆抗體分離BMSCs類群。與胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞相比，BMSCs有著難以比較的優(yōu)勢:〔1〕取材、移植方便、安全、損傷小、來源豐富，骨髓穿刺便可獲得；〔2〕短期內(nèi)可大量擴(kuò)增：體外培養(yǎng)時，起始生長速度緩慢，約6~7d開場，增長速度明顯加快；〔3〕低免疫原型：因細(xì)胞處于原始狀態(tài)，不易被辨別，所以不存在免疫排擠的特性，沒有血型匹配問題；〔4〕具有較強(qiáng)的分化潛能、可塑性和跨胚層分化能力，其分化表現(xiàn)出明顯的組織特異性，BMSCs所到達(dá)的組織微環(huán)境決定其分化方向；〔5〕歸巢性：損傷信號能夠刺激干細(xì)胞向受損器官、組織遷移分化，能夠歸巢到受損病灶，對受損的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)；〔6〕易被外源基因轉(zhuǎn)染并且能高效、穩(wěn)定表示出多種治療性外源基因；〔7〕能在宿主體內(nèi)長期存活。本實驗采取的全骨髓貼壁法主要是通過利用BMSCs貼壁而造血干細(xì)胞懸浮的方式方法以及BMSCs與成纖維細(xì)胞等貼壁細(xì)胞對胰酶消化反響〔包括胰酶的用量和消化時間〕的不同，利用消化的時間差，并通過傳代，到達(dá)分離純化BMSCs的目的，華而不實BMSCs較成纖維細(xì)胞，單核細(xì)胞更易被消化，此法操作簡單，對細(xì)胞微環(huán)境和細(xì)胞活性影響都很小，使其易于保持在類似于骨髓內(nèi)生長時的微環(huán)境，經(jīng)過2~3次傳代，便可得到相對純化的BMSCs.在整個機(jī)械分離大鼠骨髓的經(jīng)過中，應(yīng)注意嚴(yán)格的無菌操作，在剝離皮膚、游離四肢肌肉及分離骨髓的各個經(jīng)過完成后，要注意及時更換無菌器械，不能存在僥幸心理，避免污染。另外，由于BMSCs生長時的密度依靠性，在傳代時應(yīng)注意適當(dāng)?shù)谋壤?傳2為宜，在傳代經(jīng)過中一定要注意消化時間，以消化1~2min,梭形細(xì)胞變圓時加含血清培養(yǎng)液終止消化為宜，切忌消化時間過久。實驗發(fā)現(xiàn)盡管BMSCs具有向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的能力，但誘導(dǎo)體系和培養(yǎng)體系仍需改善，由于細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)過中存在不同程度老化現(xiàn)象，表現(xiàn)為本來梭形的細(xì)胞呈寬大的噗狀，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡和顆粒。誘導(dǎo)后構(gòu)成的細(xì)胞由于一些原因尚無法在功能上進(jìn)一步確定能否為神經(jīng)元細(xì)胞，所以只能暫時稱之為神經(jīng)元樣細(xì)胞。本實驗最主要的意義是在一定程度上證明了BMSCs在無誘導(dǎo)條件下發(fā)生了自分化現(xiàn)象構(gòu)成了神經(jīng)元樣細(xì)胞，由于對細(xì)胞本身的干涉很少，使得后續(xù)研究的精到準(zhǔn)確性得以保證。以往的研究和本實驗均表示清楚，在特定的誘導(dǎo)條件下BMSCs能夠分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。BMSCs移植已開場在臨床上用于治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，獲得了相對不錯的效果,但是對治療機(jī)制尚不特別清楚，研究發(fā)現(xiàn)移植后的BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的比例較低，以為可能是通過其分泌營養(yǎng)因子、生成血管、釋放激素和抑制炎性反響來發(fā)揮治療作用，而并非發(fā)生真正意義上的細(xì)胞取代.既然這樣，筆者以為能夠另辟思路，去繁就簡，先去掉藥物誘導(dǎo)這一環(huán)節(jié)，通過分析比擬BMSCs的直接移植和自分化為神經(jīng)樣細(xì)胞后再移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效果，這樣可排除藥物誘導(dǎo)對BMSCs的相應(yīng)基因表示出的干擾，使機(jī)制或通路的研究盡可能簡單，以便進(jìn)一步說明，而一旦確定相應(yīng)治療機(jī)制后，再通過藥物誘導(dǎo)，熒光定量PCR技術(shù)和Western技術(shù)分析通路中相關(guān)基因和蛋白分子水平的改變。與傳統(tǒng)的直接藥物誘導(dǎo)比擬，這樣可大大提高有效誘導(dǎo)藥物的挑選和藥物有效成分提取的效率，避免不必要的研究。為了盡可能減少眾多因素對BMSCs的干擾，其自分化就顯得至關(guān)重要。本實驗在形態(tài)學(xué)上初步證明了BMSCs在10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，5%CO2,37℃培養(yǎng)條件時，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)30d左右時，可見明顯的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞，與此同時其余的細(xì)胞均發(fā)生凋亡并逐步消失〔圖o-q〕,但是自分化后構(gòu)成的神經(jīng)元樣細(xì)胞的數(shù)目少，單個分布，無法進(jìn)行下一步的表型鑒定和相關(guān)的細(xì)胞電生理功能研究，這一缺陷應(yīng)該能夠通過接種75cm