羅氏診斷二代測(cè)序技術(shù)在HBV耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用

羅氏診斷二代測(cè)序技術(shù)在HBV耐藥檢測(cè)中的應(yīng)用

羅氏診斷應(yīng)用科學(xué)市場(chǎng)部劉璐璐HBV耐藥性產(chǎn)生病毒每天高速復(fù)制，并在復(fù)制時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤，這些自發(fā)突變導(dǎo)致突變株出現(xiàn)。突變株增殖能力通常低于野生型，因而在未用藥的群體中占少數(shù)。但在病毒藥物作用下，藥物對(duì)于耐藥性的突變有選擇作用，導(dǎo)致了耐藥菌株成為優(yōu)勢(shì)株，導(dǎo)致藥物治療的失敗。耐藥是核苷酸類藥物的共性耐藥檢測(cè)的意義治療前檢測(cè)，有助于臨床判斷用藥是否有效；治療中每3~6個(gè)月檢測(cè)，有助于觀察療效，及時(shí)調(diào)整用藥EASLClinicalPracticeGuidelines：ManagementofchronichepatitisB.EuropeanAssociationfortheStudyoftheLiver.JHepatol,2009,50:227-242.用藥后出現(xiàn)耐藥拉米夫定阿德福韋酯恩替卡韋替比夫定替諾福韋測(cè)序用于病毒耐藥檢測(cè)

深度測(cè)序可檢出低頻準(zhǔn)種超深焦磷酸測(cè)序可檢測(cè)低于1%的準(zhǔn)種普通焦磷酸測(cè)序僅限5%及以上的準(zhǔn)種毛細(xì)管電泳測(cè)序僅限20%及以上的準(zhǔn)種提早判斷準(zhǔn)種組成，在劣勢(shì)菌種未發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)菌種之前，即調(diào)整用藥策略；降低治療失敗可能性，減少對(duì)身體傷害。454高深度測(cè)序優(yōu)勢(shì)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)對(duì)于RT基因區(qū)段1%突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，比目前常用的一代測(cè)序及線性探針反向雜交法更加靈敏進(jìn)行相對(duì)定量，對(duì)于病毒群體中突變數(shù)量改變進(jìn)行跟蹤深度測(cè)序的運(yùn)用將較傳統(tǒng)方法提前3-6個(gè)月檢測(cè)出突變，因此能夠更好的抓住治療的時(shí)機(jī)并給出治療的方案—454測(cè)序系統(tǒng)發(fā)展

測(cè)序通量及讀長(zhǎng)不斷增加，大小測(cè)序平臺(tái)齊備—GS20GSFLXStandard20Mb~100Mb200520072008—FutureEvenLongerReadsHigherDensityLaterGSFLXTitanium~500MbGSJuniorTitaniumGSFLX+2011獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室適用型

精巧型二代測(cè)序平臺(tái)

GSJuniorGSJunior測(cè)序步驟概覽MixssDNA&capturebeads454測(cè)序流程

文庫構(gòu)建1.454文庫構(gòu)建：ShotgunPaired-end300bp~1Kb,3Kb,8Kb,20Kb*PCR產(chǎn)物可直接測(cè)序傳統(tǒng)文庫構(gòu)建：BAC克隆->Shotgun/PCR一個(gè)片段=一個(gè)反應(yīng)珠454測(cè)序流程

emPCR2.emPCR每個(gè)DNA分子獨(dú)立進(jìn)行PCR反應(yīng)后獨(dú)立測(cè)序擴(kuò)增效果好，適應(yīng)高GC含量片段、甚至FFPE樣本一個(gè)反應(yīng)珠=一個(gè)讀長(zhǎng)單克隆測(cè)序的價(jià)值

通過emPCR實(shí)現(xiàn)單克隆直接閱讀每一種分子結(jié)果突變比例的計(jì)算（低頻）基于實(shí)際的序列信息每個(gè)DNA分子獨(dú)立進(jìn)行PCR反應(yīng)后獨(dú)立測(cè)序擴(kuò)增效果好，適應(yīng)高GC含量片段、甚至FFPE樣本Sanger流程-混合測(cè)序454流程-單克隆測(cè)序454測(cè)序流程

測(cè)序

特異的測(cè)序引物和單鏈DNA模板結(jié)合,加入一種dNTP

DNA聚合酶的作用下，單個(gè)dNTP與模板的下一個(gè)堿基配對(duì)，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)

在ATP硫酸化酶的作用下，PPi和APS結(jié)合形成ATP在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光，被CCD捕捉Apyrase降解剩余的dNTP和殘留的少量ATP加入另一種dNTP重復(fù)2-5步驟在每一個(gè)測(cè)序循環(huán)里，堿基以同樣的次序(TACG)流過PicoTiterPlate板當(dāng)模板鏈的互補(bǔ)核苷酸加入延伸鏈時(shí)，會(huì)產(chǎn)生了熒光信號(hào)熒光信號(hào)強(qiáng)度與所加入的核苷酸數(shù)目成比例熒光信號(hào)被CCD照相機(jī)記錄熒光素酶ATP硫酸化酶氧化熒光素可見光3.基于焦磷酸反應(yīng)的邊合成邊測(cè)序13SequencingBySynthesisAATCGGCATGCTAAAAGTCACTARepeateddNTPflowsequence:GGTCAGTCAGTTTTCAGGATCCCGATTGCTAAnnealPrimerProcesscontinuesuntiluser-definednumberofnucleotideflowcyclesarecompleted.邊合成邊測(cè)序?qū)嶒?yàn)體系的不斷優(yōu)化使得當(dāng)前可獲得Junior平均為400bp的讀長(zhǎng)并將繼續(xù)以提升讀長(zhǎng)為技術(shù)的發(fā)展方向之一454測(cè)序流程

數(shù)據(jù)獲取

圖像處理信號(hào)處理454測(cè)序流程

數(shù)據(jù)分析

測(cè)序與分析同時(shí)進(jìn)行，10小時(shí)完成10小時(shí)產(chǎn)出10萬條以上的序列自帶4套軟件，滿足多數(shù)應(yīng)用需求軟件自動(dòng)過濾，高質(zhì)量序列比例高400bp的位置仍可保持Q20的準(zhǔn)確性GSJunior在德國(guó)大腸桿菌事件中

NicholasJLomanetal.,Performancecomparisonofbenchtophigh-throughputsequencingplatforms,NatureBiotechnology,2012[DOI:10.1038/nbt.2198]454GSJunior擁有最長(zhǎng)的讀長(zhǎng)，平均讀長(zhǎng)在522個(gè)堿基，99%的序列可以用于基因組拼接6月3日收到樣本，6月5日完成全部測(cè)序與機(jī)制確認(rèn)工作數(shù)據(jù)分析僅由HPA的非專業(yè)生信團(tuán)隊(duì)，不到半天時(shí)間即得到結(jié)果序列讀長(zhǎng)分布圖

Junior測(cè)序系統(tǒng)運(yùn)行產(chǎn)生的讀長(zhǎng)范圍為50-600bp，甚至更長(zhǎng)shotgun實(shí)驗(yàn)將利用幾乎全部數(shù)據(jù)平均讀長(zhǎng)為400bp典型讀長(zhǎng)在450-550bp范圍Amplion實(shí)驗(yàn)將主要根據(jù)典型讀長(zhǎng)進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)NumberofreadsReadlength(bases)SimplesimpleCGTAGGCTAGATGCATGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATATAGCGATCTCGACATGCTComplex454longreadsShortreadtechnology?????454長(zhǎng)測(cè)序能夠帶來什么

emPCR保證樣本的獲得，長(zhǎng)焦磷酸確保閱讀

長(zhǎng)讀長(zhǎng)的價(jià)值

一條reads通讀一個(gè)目標(biāo)序列，無需拼接，避免錯(cuò)誤產(chǎn)生與時(shí)間消耗通過一條reads判斷突變的連鎖關(guān)系更少引物獲得更多目標(biāo)引物設(shè)計(jì)的區(qū)間更靈活Junior1條reads既可通讀HBV耐藥相關(guān)基因的PCR產(chǎn)物HBV耐藥RT基因(1032nt)檢測(cè)有overlap的4個(gè)片段Fragment1(372nt)9Fragment2(401nt)9Fragment3(396nt)9Fragment4(314nt)9TheJournalofInfectiousDisease,May2009;199(9):1275-85.PCR擴(kuò)增子文庫的設(shè)計(jì)

長(zhǎng)讀長(zhǎng)給予更多引物設(shè)計(jì)空間，1條reads通讀熱點(diǎn)突變區(qū)域454B-primer(19bp)LocusspecificPCRamplificationemPCR&雙向測(cè)序Targetspecificsequence(ca.25bp)454A-primer(19bp)ABSequenceofinterest200–400bp通過MID序列，可以混合多個(gè)樣本測(cè)序同時(shí)測(cè)序DataanalysisRT基因可設(shè)計(jì)3個(gè)PCR產(chǎn)物片段S基因可設(shè)計(jì)2個(gè)PCR產(chǎn)物片段C基因可設(shè)計(jì)1個(gè)PCR產(chǎn)物片段X基因可設(shè)計(jì)1個(gè)PCR產(chǎn)物片段Pre-C基因可設(shè)計(jì)1個(gè)PCR產(chǎn)物片段454測(cè)序在HBV耐藥基因測(cè)序的應(yīng)用方案Day1DNA提取Day1PCR產(chǎn)物的獲取Day1PCR產(chǎn)物純化Day1PCR產(chǎn)物樣品定量(Agilent2100,qPCR儀)Day1PCR產(chǎn)物樣品均一化Day1PCR產(chǎn)物混樣Day1454測(cè)序建庫加接頭(10min)Day2emPCR擴(kuò)增(2h手工操作+6h機(jī)器運(yùn)行)Day3454Junior測(cè)序(10h)Day4數(shù)據(jù)分析454測(cè)序步驟

HBV耐藥檢測(cè)應(yīng)用emPCR(乳滴PCR)擴(kuò)增每一帶有MID與測(cè)序引物的HBV耐藥突變高發(fā)DNA片段在其各自的微乳滴中進(jìn)行獨(dú)立擴(kuò)增，排除了其它競(jìng)爭(zhēng)性或污染性序列對(duì)PCR反應(yīng)的影響。焦磷酸測(cè)序?qū)⑺薪Y(jié)合有DNA片段的磁珠置于PicoTiterPlate(PTP板)中進(jìn)行測(cè)序。PTP板的孔徑恰好僅能容納一顆磁珠。將PTP板置于GS測(cè)序儀中，單個(gè)核苷酸依次流經(jīng)孔洞和DNA捕獲磁珠間。當(dāng)所加入的核苷酸與模板互補(bǔ)時(shí)，便產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，進(jìn)而被GS系統(tǒng)的CCD相機(jī)記錄。454的分析結(jié)果呈現(xiàn)

可檢測(cè)單點(diǎn)突變454的分析結(jié)果呈現(xiàn)

可關(guān)注已知突變MultipleMutationsinaCodonAssociatedwithNRTIResistanceT69ConfidentialMultipleMutationsinaCodonAssociatedwithNRTIResistanceThr6935%Alanine,42%Asparagine,and1.2%SerineConfidential454的分析結(jié)果呈現(xiàn)

可檢測(cè)有意義的連鎖突變位點(diǎn)已有RT基因突變數(shù)據(jù)庫

StandfordHBVSeq

StandfordHBVSeq結(jié)果展示近兩年使用454發(fā)表HBV耐藥檢測(cè)文獻(xiàn)AnalysisofhepatitisBvirusdrug-resistantmutanthaplotypesbyultra-deeppyrosequencing.KoSY,OhHB,ParkCW,LeeHC,LeeJE.(2012)ClinMicrobiolInfectePub:Ultra-deeppyrosequencingdetectsconservedgenomicsitesandquantifieslinkageofdrug-resistantaminoAcidchangesinthehepatitisBvirusgenome.Rodriguez-FríasF,TaberneroD,QuerJ,EstebanJI,OrtegaI,DomingoE,CuberoM,CamósS,Ferrer-CostaC,SánchezA,JardíR,SchaperM,HomsM,Garcia-CehicD,GuardiaJ,EstebanR,ButiM.(2012)PLoSOne7(5):e37874.Long-termmonitoringdrugresistancebyultra-deeppyrosequencinginachronichepatitisBvirus(HBV)-infectedpatientexposedtoseveralunsuccessfultherapyschemes.SedeM,OjedaD,CassinoL,WestergaardG,VazquezM,BenettiS,FayF,TannoH,QuarleriJ.(2012)AntiviralResearchePub:Ultra-deeppyrosequencinganalysisofthehepatitisBviruspreCoreregionandmaincatalyticmotifoftheviralpolymeraseinthesameviralgenome.HomsM,ButiM,QuerJ,JardíR,SchaperM,TaberneroD,O