第2章 酶與細(xì)胞的固定化

第二章:酶與細(xì)胞的固定化第一節(jié)：酶的固定化固定化酶的定義及其特點酶的固定化:利用一定措施將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍能進行其特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)使用的一類技術(shù)。固定化酶:在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶,能連續(xù)地進行反應(yīng),反應(yīng)后的酶可以回收使用.(不一定是固體)固定化酶的形狀:

顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。顆粒狀占絕大多數(shù)，它和線條主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，薄膜主要用于酶電極。酶管機械強度較大，主要用于工業(yè)生產(chǎn)。固定化酶的優(yōu)勢：極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；可以在較長時間內(nèi)進行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)酶反應(yīng)過程能夠加以嚴(yán)格控制；較游離酶更適合于多酶反應(yīng)；在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性；可以增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；酶的使用效率提高、成本降低。固定化酶的缺點：固定化時，酶的活力有損失；只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對大分子底物不適宜；增加了生產(chǎn)的成本，工廠初始投資大；與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子的反應(yīng)；胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離手續(xù)

二：固定化酶的制備原則：必須注意維持酶的催化活性及專一性。酶活性中心不能受到破壞或與載體結(jié)合，盡量避免破壞酶高級結(jié)構(gòu)的條件，固定化的條件要溫和。固定化酶必須結(jié)合牢固，從而使固定化酶能回收貯藏，利于反復(fù)使用；所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。問題固定化技術(shù),固定化酶為什么要進行酶的固定化?固定化酶有何優(yōu)劣性?固定化酶技術(shù)的基本原則有哪些?固定化酶就是使酶從游離狀態(tài)變成固體?固定化酶的活力比游離酶高?固定化酶更有利于多酶反應(yīng)?固定化酶可以節(jié)省成本?固定化酶的應(yīng)用1.在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用：1）氨基?；福?969年，最早工業(yè)化應(yīng)用的固定化酶。DL－乙酰氨基酸L－氨基酸2）葡萄糖異構(gòu)化酶：3）天冬氨酸酶：1973日本，延胡索酸－－－－天冬氨酸4）青霉素酰化酶5）延胡索酸酶：生產(chǎn)蘋果酸6）B－半乳糖苷酶2.在酶傳感器方面的應(yīng)用：1）酶電極：葡萄糖電極；氰霉素電極；三：酶的固定化方法酶的固定化方法很多，但沒有普遍適應(yīng)的方法，必須根據(jù)不同酶及其不同的用途通過反復(fù)試驗選擇。常用的固定化方法有：(按化學(xué)反應(yīng)的類型分)

固定化方法分類固定化方法分類非共價結(jié)合法結(jié)晶法分散法物理吸附法離子結(jié)合法化學(xué)結(jié)合法交聯(lián)法，共價結(jié)合法包埋法微囊法，網(wǎng)格法固定化酶的模式圖（一）非共價結(jié)合法包括：結(jié)晶法；分散法；物理吸附法；離子結(jié)合法結(jié)晶法：

就是使酶結(jié)晶從而實現(xiàn)固定化的方法,它提供了非常高的酶濃度,從而提高了效率.剛性強,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定其局限性是:在不斷的重復(fù)循環(huán)中,酶會有所損耗.分散法：就是通過酶分散于水不溶相中從而實現(xiàn)固定化的方法。關(guān)鍵是解決酶在水不溶相中的分布以及酶在有機溶劑中的穩(wěn)定性.分散法：提高水不溶溶劑中酶反應(yīng)速率的途徑：正確的體系和貯存狀態(tài)使酶粉充分分散（加入有利于分散的化合物,如PEG）；通過與親脂化合物的共價連接能增加酶在有機相中的溶解度，包埋在膜體系中或通過多相反應(yīng)來實現(xiàn)酶的固定化；將酶吸附到多孔載體中；物理吸附法：酶被物理吸附于不溶性載體的一種固定化方法。優(yōu)點：酶活性中心不易被破壞，酶高級結(jié)構(gòu)變化少，因而酶活力損失很少。缺點：酶與載體相互作用力弱，酶易脫落等。離子結(jié)合法：

酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法。（DEAE-纖維素，DEAE-葡萄糖凝膠,CM-纖維素等）優(yōu)點：操作簡單，條件溫和，酶活性中心和高級結(jié)構(gòu)不易受到破壞，酶活回收率比較高。缺點：結(jié)合力弱，容易脫落，受溶液離子強度和pH影響較大（二）化學(xué)結(jié)合法包括：共價結(jié)合法；交聯(lián)法1．共價結(jié)合法：酶與載體以共價健結(jié)合的固定化方法，是載體結(jié)合法中最常用的方法。1．共價結(jié)合法：結(jié)合方法優(yōu)缺點：優(yōu)點：與酶結(jié)合牢固，不容易脫落；缺點：反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜，容易引起酶失活，酶活回收率低，甚至底物的專一性等也會發(fā)生變化。1．共價結(jié)合法：結(jié)合方法主要有二種：將載體有關(guān)基團活化，然后與酶有關(guān)基團發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；在載體上接上一個雙功能基團，然后將酶偶聯(lián)上去。EE直接結(jié)合法通過雙功能基團結(jié)合法載體雙功能基團1．共價結(jié)合法：所用載體包括：天然有機載體（如多糖，蛋白質(zhì)，細(xì)胞）、無機物（玻璃，陶瓷等）和合成聚合物（聚酯，聚胺，尼龍）合適的載體應(yīng)具有良好的親水性和一定的機械強度.天然高分子親水性較好,但機械強度較差,玻璃和尼龍等強度好但親水性較差.共價結(jié)合的方式有多種方式進行反應(yīng),取決于載體上的功能基團和酶分子上的非必需側(cè)鏈基團.載體上常用的功能基團包括:

芳香氨基,羥基,羧甲基,氨基等可以與載體結(jié)合的酶的功能基團包括：氨基,羧基,巰基,羥基,咪唑基,酚基等參與共價結(jié)合的氨基酸不應(yīng)是酶的必需基團結(jié)合基團常見的結(jié)合方法有10種結(jié)合方法：重點掌握溴化氰法活化基團最常見的方法:重氮偶聯(lián)法;溴化氰法結(jié)合方法：一.重氮反應(yīng)(diazatitation):適合水不溶性的帶芳香氨基的載體.載體在稀鹽酸或亞硝酸鈉中進行反應(yīng),成為重氮鹽衍生物,然后再在溫和的條件下和酶蛋白分子上相應(yīng)的基團如酚羥基,咪唑基或氨基進行共價結(jié)合,得到固定化酶重氮法是將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸處理成重氮鹽衍生物，再在中性偏堿(pH8—9)條件下與酶蛋白發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，得到固定化酶。

可能與酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在過量重氮鹽存在下還可與酶蛋白的N—端氨基或Lys的ε氨基形成雙偶氮化合物。常用載體及其反應(yīng)如下：a.多糖類的芳香族氨基衍生物。我國獨創(chuàng)的使用對-β-硫酸脂乙砜基胺(ABSE—)多糖(纖維素，葡聚糖，交聯(lián)瓊脂糖，交聯(lián)瓊脂及淀粉)屬于此類載體。在堿性條件下用對—β—硫酸脂乙砜基胺活化多糖，制得的醚鍵連接的乙砜基苯胺衍生物，經(jīng)重氮化后偶聯(lián)酶：b.氨基酸共聚體。如L—Leu和對氨基—DL—苯丙氨酸共聚物：待1mol/L的L—Leu和對氨基—DL—Phe的N—羧基酐的苯溶液在少量水存在及室溫下進行反應(yīng)制成。共聚物與亞硝酸作用轉(zhuǎn)變?yōu)橹氐}，可供酶固定用。用此法制備的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。c.聚丙烯酰胺衍生物。該類衍生物的商品名稱為bio—Gel或Enzacry。如EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，經(jīng)重氮化可固定酶。用此法制備的有氨基?；福矸勖傅裙潭ɑ?。d.苯乙酰樹脂。這是聚氨基苯乙烯(a)和一種異丁烯一間一氨基苯乙烯(b)的共聚物，通過重氮化后可固定酶．如胃蛋白酶、核糖核酸酶等。e.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。玻璃的化學(xué)改造物多孔玻璃在丙酮中與Y—氨基丙基三氧乙烷硅回流加熱，生成烷基胺玻璃:烷基氨玻璃用對硝基苯酚氯處理后，再還原，轉(zhuǎn)變?yōu)榉枷慊苌?此芳香基衍生物經(jīng)重氮化后與酶結(jié)合．產(chǎn)生固定化酶。結(jié)合方法：二.異硫氰酸(或異氰酸)反應(yīng)

iso(thio)cyanatereaction適合含芳香氨基的載體.芳香氨基先用硫光氣處理成異硫氰酸(或異氰酸)鹽的衍生物,然后在極溫和的條件下和酶分子的氨基反應(yīng).在中性pH下優(yōu)先與a-氨基反應(yīng),因此有一定的選擇性結(jié)合方法：三.溴化氰法:活化固相載體最早的方法之一,是活化多糖類載體的最盛行的方法,也是實驗室和工業(yè)規(guī)模經(jīng)常選用的方法溴化氰—亞胺碳酸基反應(yīng)含有羥基的載體(如纖維素、葡聚糖、瓊脂等)在堿性條件下，載體的羥基與CNBr反應(yīng)，生成活潑的亞胺碳酸基，在弱堿條件下，可與酶分子的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生固定化酶。異脲型亞氨碳酸酯型氨基甲酸型最主要方式溴化氰法的優(yōu)缺點:優(yōu)點:適用于多種載體的活化,不僅是多糖類,而且也適用于許多其他合成的含羥基的聚合物.其活化的載體可用于偶聯(lián)小配基,以及含伯氨基的高分子聚合物操作簡單重復(fù)性好.用于酶的固定條件特別溫和.缺點:少量的持續(xù)不斷的配基的脫落;有比較明顯的非特異性吸附溴化氰法實驗方法:NaOH滴定的傳統(tǒng)方法:用1L無離子水在玻璃漏斗中洗滌Sepharose4B,抽干成濕餅狀并轉(zhuǎn)移到500ml燒環(huán)中;膠懸浮在100ml無離子水中,并輕輕攪拌(不要使用磁力攪拌器)加入20gCNBr到凝膠懸浮液中,逐滴加入20%的NaOH,保持反應(yīng)混合物的pH值在11,不時加入冰塊到反應(yīng)混合物中,保持溫度在25℃當(dāng)全部CNBr溶解時(10-15min),NaOH消耗速度將減少,此時,反應(yīng)混合物傾入含冰的砂芯玻璃漏斗中,用1L冰冷的水和500ml冰冷的偶聯(lián)緩沖液(pH8.5,0.1mol/LNa2CO3)快速地洗滌凝膠,由于活化載體不穩(wěn)定,凝膠必須立即偶聯(lián)蛋白質(zhì)或其他配基.必須在通風(fēng)櫥中進行四,芳香烴化反應(yīng):含羥基的載體可在堿性條件下和均三氯三嗪(triazinyl)等反應(yīng),引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、酚羥基或巰基等偶聯(lián)。五，疊氮反應(yīng)：適用于含羥基，羧甲基等的載體，如CM-纖維素，葡聚糖，聚氨基酸等，可在酸等作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榀B氮衍生物，然后在pH7.5-8.5和酶的氨基直接偶聯(lián)。六，酰氯?；磻?yīng)：含羧基載體酸樹脂可通過氯化亞砜處理后生成活潑的酰氯衍生物，再與酶共價結(jié)合。七,酸酐反應(yīng):乙烯等和順丁烯二酸酐的共聚物，可通過其活潑的酸酐基直接和酶的氨基偶聯(lián)，生成固定化酶。八，縮合反應(yīng)：利用羰二亞胺的活化作用，使氨基和羧基直接偶聯(lián)縮合形成肽鍵的反應(yīng)九，巰基-二硫基交換反應(yīng)：帶巰基和二硫基的載體可通過巰基-二硫基交換反應(yīng)和酶分子上的非必需巰基偶聯(lián)。十，直接法或涂層法交聯(lián)法：

就是利用雙功能或多功能試劑使酶與酶，酶與蛋白，或微生物與微生物細(xì)胞之間交聯(lián)的固定化方法，該法也是利用共價健固定酶的，所不同的是它不使用載體。最常用的交聯(lián)劑是戊二醛。參與交聯(lián)的基團有:a-氨基,-NH2（Lys）,-SH(cys),咪唑基(His),酚基（Tyr),等交聯(lián)反應(yīng)可發(fā)生在分子間或分子內(nèi)；其比例在一定程度上和酶的濃度與交聯(lián)試劑的濃度有關(guān)，也與pH、離子強度有關(guān)。一般而言：低酶濃度下主要形成分子內(nèi)交聯(lián)，交聯(lián)后的酶仍呈溶解狀態(tài)；高濃度下分子間交聯(lián)增加，形成的固定化酶往往變?yōu)椴蝗軕B(tài)。交聯(lián)劑與酶的最適比為10%左右（w/w)，但并不是適用于一切的。交聯(lián)法優(yōu)缺點及措施：

優(yōu)點：操作簡便缺點：反應(yīng)條件比較激烈，固定化的酶活回收率一般較低對策：盡可能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時間將有利于固定化酶比活力的提高。采取某些保護措施：利用可逆抑制劑或底物保護活性中心。或添加惰性蛋白。（三）包埋法可分為網(wǎng)格型和微囊型兩種，將酶或微生物包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱為網(wǎng)格型；將酶或微生物包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。通常采用惰性材料的載體優(yōu)點：包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活回收率較高。缺點：包埋時可能發(fā)生化學(xué)聚合反應(yīng)使酶失活，只適合小分子底物和產(chǎn)物，不適合大分子底物和產(chǎn)物。1.網(wǎng)格型:

將酶或微生物包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的稱為網(wǎng)格型。是固定化微生物中用得最多,最有效的方法.載體主要有丙烯酰胺、聚乙烯醇、和光敏樹脂等合成高分子化合物以及淀粉、明膠、膠原、海藻酸等天然高分子化合物。合成高分子化合物包埋通常采用單體或預(yù)聚物在酶或微生物存在下聚合的方法；對天然高分子化合物則采用于溶膠狀的高分子化合物中加入酶和微生物再將之凝膠化的方法。例如:瓊脂糖包埋法是，將1％一2.5％的瓊脂糖加熱溶解后冷至37—38℃,與一定量動物細(xì)胞混合后．分布于石蠟油中.使溫度由37℃降至10℃左右，可得到直徑為0.1—0.3mm的微球狀固定化細(xì)胞，用于單克隆抗體、白細(xì)胞介素等的生產(chǎn)。2．微囊型：將酶或微生物包埋在高分子半透膜中的稱為微囊型。其顆粒比網(wǎng)格型小得多，有利于底物和產(chǎn)物的擴散，但是反應(yīng)條件要求高，制備成本也比較高例如：先用海藻酸鈣包埋動物細(xì)胞制成膠粒后，再在外面包一層聚Lys膜，然后放入檸檬酸鈉溶液中去除海藻酸鈣，便可獲得由多聚Lys包埋的動物細(xì)胞。(3)脂質(zhì)體（liposome)包埋法脂質(zhì)體：具有雙層結(jié)構(gòu)和一定包裹空間的微球體，它具有多層囊胞結(jié)構(gòu)（MLV），單層小囊泡（SUV），單層大囊泡（LUV）等三種類型。特點：一定的機械性能，能定向?qū)⒚傅劝镔|(zhì)攜帶到一定部位然后釋放，具有更大的定向性；比較安全，回收率高。缺點：在包埋過程發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)同樣會導(dǎo)致酶的失活。問題1固定化酶有哪些方法?它們各有什么特點?利用結(jié)晶法固定化酶需要載體?不需要載體的固定化方法包括哪些?非共價固定化酶的方法一般不改變酶的共價結(jié)構(gòu).共價法固定化酶一定改變酶的共價結(jié)構(gòu)?分散法固定化酶就是將酶分散于水溶液中進行催化反應(yīng)?問題2如何提高分散法固定化酶的催化效率?吸附法固定酶,離子交換法固定化酶?離子交換法所采用的載體應(yīng)該帶有與蛋白質(zhì)相反的電荷?pI6.5的酶在pH8.3環(huán)境中應(yīng)該與什么載體結(jié)合(DEAE或CM纖維素?)可以進行共價固定化的載體基團主要包括?可以進行共價固定化的蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團主要包括?問題3共價固定化就是將酶直接通過某種方式共價連接到載體的功能基團上?針對芳香氨基有哪些固定化方法?描述重氮偶聯(lián)法的過程.重氮偶聯(lián)法基團活化時利用了鹽酸,在很酸條件下進行,哪么為什么酶不會大部分失活?可以與重氮衍生物結(jié)合的基團有哪些?含有芳香氨基的載體包括哪些?重氮偶聯(lián)法具有比較高的專一性?問題4異硫氰酸法是針對什么基團的載體進行的?基本過程?能與蛋白質(zhì)上的什么基團連接?對多糖類的載體,一般采用什么方法進行固定化?溴化氰法的原理?基本過程如何進行?溴化氰法的優(yōu)缺點?溴化氰法為什么要加入NaOH?溴化氰法與酶結(jié)合時以什么方式為主?問題5包埋法屬于共價還是非共價固定化?有什么優(yōu)劣?包埋法的原理及基本種類?舉例說明各種包埋法?交聯(lián)法常用的交聯(lián)劑是什么?交聯(lián)法由于不需要活化基團,所以條件比較溫和,酶活的回收率比較高?四．固定化酶的性質(zhì)酶的性質(zhì)?（一）固定化后酶活力的變化：固定化酶的活力一般比天然酶小，專一性也有所變化。原因可能有：固定化過程中，酶分子空間構(gòu)象會有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸；固定化后，酶分子空間自由度受到限制（空間位阻），影響到活性中心與底物的定位作用；內(nèi)擴散阻力使底物分子與活性中心接近受阻；包埋時酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物不能透過膜與酶接觸。問題固定化后酶的活力一定下降?一般會下降?原因是什么?（二）固定化對酶穩(wěn)定性的影響：在大多數(shù)情況下酶經(jīng)過固定化后其穩(wěn)定性都有所提高；表現(xiàn)在：熱穩(wěn)定性提高；對各種有機試劑及酶抑制劑的穩(wěn)定性提高；對不同pH穩(wěn)定性、蛋白酶穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性都有影響。有報道有些固定化酶經(jīng)過貯藏后，其活性提高了問題固定化后酶的活力上升了?固定化后酶的穩(wěn)定性上升了?也可能下降?為什么?（三）固定化酶的最適溫度變化：

由于固定化后酶的熱穩(wěn)定性提高，因此其最適溫度也提高了，這對于生產(chǎn)上非常有利。問題固定化后酶的最適溫度上升的主要原因是什么?（四）固定化酶的最適pH變化：固定化酶的最適pH值常常發(fā)生偏離,主要是微環(huán)境表面的電荷性質(zhì)的影響.如何變化?載體帶正電荷則最適pH上上升偏低?（五）固定化酶的米氏常數(shù)(Km)的變化:

固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km值隨載體的帶電性能變化.當(dāng)酶結(jié)合于中性載體時,由于擴散限制造成表觀Km值的上升;與載體電荷相反的底物在固定化酶微環(huán)境中濃度比整體溶液高,則固定化酶的表觀Km值下降;(一定降低嗎?)而載體電荷與底物相同,就會造成固定化酶的表觀Km值顯著增加.問題固定化酶的Km值必定大于游離酶?固定化后Km值上升意味著酶的性質(zhì)發(fā)生了變化?固定化酶性質(zhì)發(fā)生變化的原因：固定化改變了酶的結(jié)構(gòu)或構(gòu)象；固定化后酶催化反應(yīng)的空間障礙、擴散限制效應(yīng)；載體性質(zhì)引起的分配效應(yīng)及其對酶和反應(yīng)體系性質(zhì)的影響。五.影響固定化酶性能的因素:包括：質(zhì)量傳遞效應(yīng)和支持物產(chǎn)生的（靜態(tài)的）和反應(yīng)產(chǎn)生的（動態(tài)的）質(zhì)子梯度：(一)質(zhì)量傳遞效應(yīng):

由于空間位阻、離子強度變化或其他因素導(dǎo)致溶質(zhì)在反應(yīng)體系中運動性能受到影響，這種現(xiàn)象稱質(zhì)量傳遞效應(yīng)。對于固定化酶，由于質(zhì)量傳遞效應(yīng)能引起反應(yīng)速率的降低，因此和天然酶相比，其催化效率有所降低。增強催化效率的一些方法：降低顆粒大?。粚τ诒然盍Ω叩拿笐?yīng)降低酶的負(fù)載量；使酶在載體的外部優(yōu)先結(jié)合。(二)支持物產(chǎn)生的（靜態(tài)的）和反應(yīng)產(chǎn)生的（動態(tài)的）質(zhì)子梯度：

靜態(tài)質(zhì)子梯度：由于溶質(zhì)分子的帶電基團和載體上的靜電荷相互作用（分配作用）所引起的在固定化酶周圍空間和整個反應(yīng)體系之間形成的質(zhì)子梯度。動態(tài)質(zhì)子梯度：固定化酶所催化的反應(yīng)釋放質(zhì)子或吸收質(zhì)子，可造成酶周圍環(huán)境中質(zhì)子濃度和反應(yīng)體系中質(zhì)子濃度的差異，這種梯度隨著反應(yīng)的進行而不斷變化，受反應(yīng)體系中酸堿緩沖系統(tǒng)的緩沖能力和質(zhì)量傳遞效應(yīng)的影響。動態(tài)質(zhì)子梯度對固定化酶催化的反應(yīng)效率有重要的影響。建議縮小反應(yīng)產(chǎn)生的動態(tài)pH梯度的作用，可以通過下面幾種方法達到：對于底物介導(dǎo)的擴散控制，分別或同時減少酶濃度或顆粒大小；使用足夠容量的緩沖液來減少動態(tài)pH梯度；采用比該酶最適pH高的外部pH進行操作；共固定一個質(zhì)子消耗酶，它能原位形成氨并中和產(chǎn)生的質(zhì)子；復(fù)習(xí)問題概念:固定化;固定化酶;結(jié)晶法；分散法；物理吸附法；離子結(jié)合法;交聯(lián)法;包埋法為什么要進行酶的固定化?固定化酶有什么優(yōu)缺點(相對游離酶)?固定化酶的方法有哪些分類?共價法和非共價法的比較?常見非共價法?常見共價法?固定化酶的制備原則?常見固定化酶的載體可以活化的基團包括哪些?針對這些基團的相應(yīng)活化方法?掌握重氮反應(yīng)法\異硫氰酸法\溴化氰法:針對的載體基團,可以結(jié)合的酶的基團,關(guān)鍵結(jié)構(gòu),選擇性?溴化氰法的基本過程.什么叫溴化氰法？其原理是什么？其應(yīng)用的優(yōu)缺點？舉例說明一個典型利用溴化氰法進行共價固定的實驗。掌握包埋法,交聯(lián)法的概念?主要關(guān)聯(lián)劑,關(guān)聯(lián)的程度與濃度的關(guān)系?包埋法的主要種類.可以用于固定化的蛋白質(zhì)上的基團包括什么?固定化引起酶的性質(zhì)發(fā)生變化的原因?固定化后酶的哪些主要性質(zhì)發(fā)生了變化?變化的趨勢及原因分析.第三節(jié):輔酶的固定化一、輔酶的定義及分類：輔因子:有些酶的催化作用必須在一些非蛋白質(zhì)成分的物質(zhì)的參與才能進行,這些小分子物質(zhì)統(tǒng)稱輔因子.為什么輔酶要固定化?酶的作用往往需要輔酶輔酶一般價格比較昂貴輔酶不容易回收（二）固定化難題及措施：輔酶分子量小，難以包埋在半透膜中，若固定化在不溶性載體上，則會影響其在多個酶之間的傳遞作用，目前都是將輔酶結(jié)合于水溶性高分子載體，使其高分子化來解決輔酶的固定化難題：1）引入功能團和間隔臂；（主要功能團有氨基和羧基）2）高分子化；（碳亞二胺法）。二、載體和方法最常用的載體是瓊脂糖，其次還有纖維素、玻璃珠及合成高分子載體等。常用共價偶聯(lián)法固定化輔酶或輔基，一般采用溴化氰法、碳亞二胺法以及重氮偶聯(lián)法。二、輔酶的固定化方法（一）輔基輔酶固定化的一般步驟：

1．首先，選擇合適的載體；2．其次，選擇合適的間隔臂；3．引入適當(dāng)?shù)墓δ芑鶊F或利用輔基本身合適的功能基團將輔基偶聯(lián)到載體上。（二）輔酶的固定化實例：輔酶的固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法、碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后用在超濾器中。NAD+通過通過共價偶聯(lián)法在瓊脂糖上的固定化步驟：用碘乙酸使NAD+/NADH腺嘌呤中的1位氮原子烷基化;在堿性條件下分子發(fā)生重排得到6位碳上的氨基氮被修飾的衍生物N-羧甲基NAD+;通過碳二亞胺法使長鏈接臂分子已二胺-1,6與NAD+衍生物的羧基偶聯(lián);長臂上另一端的氨基再與經(jīng)過溴化氰CNBr活化了的瓊脂糖偶聯(lián),從而得到固定化的輔酶.溴化氰法活化載體可直接與輔基偶聯(lián)。復(fù)習(xí)問題為什么要進行輔酶固定化?進行輔酶固定化與酶固定化的主要差別?應(yīng)該注意的關(guān)鍵問題是什么?難點及解決方式?常見固定輔酶的方法有哪些?第四節(jié)：細(xì)胞的固定化固定化細(xì)胞就是被限制自由移動的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。固定化細(xì)胞相對固定化酶的優(yōu)勢在于：固定化細(xì)胞保持了細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)的天然環(huán)境，因而更加穩(wěn)定；固定化細(xì)胞保持了胞內(nèi)原有的多酶系統(tǒng)，這對于多步催化轉(zhuǎn)換，其優(yōu)勢更加明顯；無需輔酶的再生。固定化細(xì)胞有利于提高基因工程菌的穩(wěn)定性、生物量和克隆基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。成本低適合多酶反應(yīng)環(huán)境天然活性保持好穩(wěn)定性固定得率高固定化細(xì)胞的局限性：僅利用胞內(nèi)酶；可能形成不需要的副產(chǎn)物；細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴散限制作用，載體形成的孔隙大小影響底物分子的通透性。一．固定化細(xì)胞的分類、形態(tài)特征和生理生態(tài)狀態(tài)1．固定化細(xì)胞的分類：按細(xì)胞類型分為固定化植物、動物和微生物細(xì)胞三大類；按細(xì)胞生理狀態(tài)可分為固定化死細(xì)胞和固定化活細(xì)胞。固定化生長細(xì)胞（固定化增殖細(xì)胞）：是將活細(xì)胞固定化在載體上使其在連續(xù)反應(yīng)過程中保持旺盛的生長、繁殖能力的一種固定化方法。其優(yōu)點是：反應(yīng)所需的酶可以不斷更新；而且反應(yīng)酶處于天然環(huán)境中，更加穩(wěn)定，因此更適合多酶順序連續(xù)使用。固定化死細(xì)胞:比較適合于單酶催化反應(yīng),可以增加細(xì)胞的通透性.固定化增殖細(xì)胞發(fā)酵具有顯著的優(yōu)勢：固定化細(xì)胞密度大，可增殖，因而可獲得高度密集而體積縮小的工程菌集合體，不需要微生物菌體的培養(yǎng)、擴大，從而縮短了發(fā)酵生產(chǎn)周期，可提高生產(chǎn)能力；發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長時間反復(fù)使用或連續(xù)使用；發(fā)酵液中含菌體少，有利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量等2．固定化細(xì)胞的形狀：顆粒狀、塊狀、條狀或不規(guī)則狀。目前多制成顆粒狀珠體。二．固定化細(xì)胞的制備：固定化細(xì)胞和固定化酶的制備方法基本相同;固定化細(xì)胞的方法有多種,但沒有一種理想的通用方法;高的活力保留和操作的穩(wěn)定性是固定化生物催化劑的評價先決條件.三、固定化細(xì)胞的性質(zhì)：以固定化基因工程菌為例,固定化細(xì)胞具有高細(xì)胞濃度、高效克隆產(chǎn)物表達和良好的穩(wěn)定性等特征：（一）目的產(chǎn)物的產(chǎn)量提高；（二）克隆基因產(chǎn)物高效表達并且穩(wěn)定性也明顯提高；（三）質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性明顯提高；復(fù)習(xí)問題為什么要進行細(xì)胞固定化?細(xì)胞固定化相對固定化酶有什么優(yōu)缺點及其應(yīng)用領(lǐng)域?第五節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的表征評價固定化酶（細(xì)胞）的指標(biāo)固定化酶（細(xì)胞）的活力測定：應(yīng)注明反應(yīng)溫度、pH、底物外，還應(yīng)流注明攪拌速度、攪拌時間、測定系統(tǒng)類型活力單位定義及表示方法:μmol.min-1.mg-1;或μmol.min-1.cm-1(酶板、酶管、酶膜）固定化酶活力的測定方法與游離酶不同,要做適當(dāng)?shù)母倪M之后才能用于固定化酶的測定;目前有二種基本的測定系統(tǒng):填充床和均勻懸浮保溫系統(tǒng).第五節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的表征測定方法分為間歇測定和連續(xù)測定兩種:間歇測定:在攪拌或振蕩反應(yīng)器中,間隔一定時間取樣,過濾后按常規(guī)進行測定.此法簡單,但受反應(yīng)器形狀、大小及反應(yīng)液量影響，必須固定條件下測定；盡可能在達到最高反應(yīng)速度的振蕩或攪拌條件下進行。連續(xù)測定：固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過底物，測定酶柱流出液，根據(jù)流速與酶活力的關(guān)系算出酶活力。測定條件要盡量與工程條件相同。第五節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的表征2.偶聯(lián)率及相對活力的測定:活力回收:指固定化后固定化酶(或細(xì)胞)所顯示的活力占被固定的等當(dāng)量游離酶(細(xì)胞)總活力的百分比.即:固定化酶總活力/加入酶總活力*100%偶聯(lián)率:載體上固定的蛋白量占加入蛋白總量的百分比（加入蛋白活力-上清液蛋白活力）/加入蛋白總活力*100%相對活力：固定化酶總活力/（加入酶總活力-上清液中末偶聯(lián)的酶活力）*100%第五節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的表征3.固定化酶(細(xì)胞)的半衰期固定化酶(細(xì)胞)在連續(xù)測定條件下,活力下降為最初活力一半時所經(jīng)歷的時間,稱為半衰期.半衰期是衡量固定化酶(細(xì)胞)穩(wěn)定性的指標(biāo).T1/2=0.696/KDKD(衰減常數(shù)）=(-2.303/t)(lgE/E0)第五節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的表征二、載體活化程度和固定化配基密度的測定（一）活化程度的測定：常用茚三酮法測定載體活化的程度：茚三酮與伯胺反應(yīng)生成一種帶色的復(fù)合物，叫赫曼紫，這種反應(yīng)能用于測量結(jié)合到不溶性載體上的自由伯胺的數(shù)量，載體的活化程度可通過測定伯胺的數(shù)量來衡量。第五節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的表征二、載體活化程度和固定化配基密度的測定（二）固定化的蛋白質(zhì)測定：1.雙辛可寧酸法(BCA)2.考馬斯亮藍法第五節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的表征二、載體活化程度和固定化配基密度的測定（三)氨基、酰肼或巰基的定量測定利用2，4，6-三硝基磺酸鹽（TNBS）與不同基團的顯色反應(yīng)的不同判斷固定化程度，或活化程度。第五節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的表征二、載體活化程度和固