實驗二細菌的革蘭氏染色及芽孢染色法

實驗二細菌的革蘭氏染色及芽孢染色法第一頁，共二十五頁，2022年，8月28日

實驗一存在問題1、香柏油要加適量2、涂完菌后接種環(huán)一定要灼燒滅菌3、無菌操作4、擦鏡紙浪費5、載玻片要洗干凈6、畫圖不符合要求第二頁，共二十五頁，2022年，8月28日細菌個體微小半透明

未染色細菌大致形態(tài)大小單染色法復(fù)染色法能看清形態(tài)大小但是無鑒別意義能看清形態(tài)大小又有鑒別意義顯微鏡細菌的染色第三頁，共二十五頁，2022年，8月28日（一）實驗?zāi)康模?、學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色法和芽孢染色法。

2、鞏固顯微鏡油鏡的使用技術(shù)和無菌操作技術(shù)。第四頁，共二十五頁，2022年，8月28日革蘭氏染色法：是1884年由丹麥病理學(xué)家所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G—）兩大類，該染色法所以能將細菌分為G+菌和G—菌，是由這兩類菌的細胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。（二）實驗原理——革蘭氏染色原理第五頁，共二十五頁，2022年，8月28日革蘭陽性菌細胞壁的化學(xué)組成肽聚糖（15-50層）細胞膜（雙層脂質(zhì)

蛋白嵌鑲）脂質(zhì)蛋白質(zhì)β-1,4糖苷鍵N-乙酰葡萄糖胺N-乙酰胞壁酸四肽鏈五肽橋第六頁，共二十五頁，2022年，8月28日革蘭陰性菌細胞壁的化學(xué)組成外膜肽聚糖（1-3層）細胞膜脂質(zhì)蛋白質(zhì)脂質(zhì)雙層脂蛋白脂多糖第七頁，共二十五頁，2022年，8月28日G+菌細胞壁較厚，肽聚糖含量較高，網(wǎng)格結(jié)構(gòu)緊密，含脂量低，當(dāng)被酒精脫色時，引起了細胞壁肽聚糖層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的孔徑縮小以至關(guān)閉，從而阻止了不溶性結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的逸出，還是原來的顏色。

Gˉ肽聚糖層較薄，交聯(lián)度低，含較多類脂質(zhì)，故用乙醇處理后，類脂質(zhì)被溶解，細胞壁孔徑變大，通透性增加，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，細胞被脫色，經(jīng)沙黃復(fù)染呈紅色。結(jié)晶紫初染碘液媒染乙醇脫色番紅復(fù)染涂片固定（二）實驗原理——革蘭氏染色原理第八頁，共二十五頁，2022年，8月28日

芽孢（內(nèi)生孢子）及其研究芽孢的重要性芽孢是某些G+菌形成的圓形或橢圓形的休眠體，抗熱性和折光性較強。芽孢的大小、形態(tài)、位置可做分類依據(jù)。

（二）實驗原理——芽孢染色法原理第九頁，共二十五頁，2022年，8月28日中央芽孢偏端芽孢游離芽孢末端芽孢第十頁，共二十五頁，2022年，8月28日（二）實驗原理——芽孢染色法原理芽孢壁厚、透性低，著色和脫色均較困難；但當(dāng)用弱堿性染料（孔雀綠）在加熱的情況下進行染色時，染料可進入菌體和芽孢；進入菌體的染料經(jīng)水洗后可被脫色；當(dāng)用對比度大、淺色的復(fù)染色劑（番紅）染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色（綠色），而菌體呈復(fù)染劑顏色（紅色）。第十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日1、活材料：革蘭氏染色：培養(yǎng)12h-16h枯草桿菌（Bacillussubtilis）和培養(yǎng)24h大腸桿菌（Escherichiacoli）芽孢染色：培養(yǎng)28-36小時的蠟狀芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis）2、染色液和試劑：革蘭氏染色染色液：結(jié)晶紫、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅；芽孢染色液：5%孔雀綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液；二甲苯、香柏油。3、器材：載玻片、接種杯、木夾子、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。（三）實驗器材第十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日1.細菌涂片標(biāo)本的制作（1）涂片載玻片1張，加1滴生理鹽水，取菌研磨均勻。（2）干燥室溫干燥，或置酒精燈高處慢慢烘烤。（3）固定干燥后的涂片，在酒精燈火焰中通過3次。（四）實驗步驟——革蘭氏染色第十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日第十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日2.革蘭法染色（1）初染結(jié)晶紫2min細水沖洗甩去積水（2）媒染盧戈碘液1min細水沖洗甩去積水（3）脫色95%乙醇20-30s細水沖洗甩去積水（4）復(fù)染番紅3min細水沖洗甩去積水（四）實驗步驟——革蘭氏染色第十五頁，共二十五頁，2022年，8月28日3.觀察實驗結(jié)果待標(biāo)本自干或用吸水紙吸干后，置顯微鏡下檢查。革蘭陽性菌（G+），被染成藍紫色。革蘭陰性菌（G-），被染成紅色。（四）實驗步驟——革蘭氏染色第十六頁，共二十五頁，2022年，8月28日實驗程序Ⅰ（革蘭氏染色的方法和步驟）涂片蒸餾水涂片結(jié)晶紫

碘液95%乙醇自然干燥媒染1min脫色20~30s初染1min、后水洗固定

番紅復(fù)染2min干燥

鏡檢水洗時不要直接沖菌膜水洗水洗水洗每人取大腸桿菌和枯草桿菌，做一塊混合涂片，進行革蘭氏染色。2分鐘1分鐘3分鐘干燥固定第十七頁，共二十五頁，2022年，8月28日

取一干凈載玻片→→在兩端各加一滴生理鹽水→→無菌操作取菌種→→涂于生理鹽水中（成菌膜）→→自然干燥→→火焰固定→→初染（結(jié)晶紫，2min）

→→水洗→→媒染（碘液，1min）

→→水洗→→脫色（乙醇，20-30s）

→→水洗→→復(fù)染（蕃紅，3min）

→→水洗→→自然干燥→→觀察。（四）實驗步驟——革蘭氏染色第十八頁，共二十五頁，2022年，8月28日涂片時，滴生理鹽水不要過多，挑菌量宜少，涂片要均勻，菌膜宜??；酒精脫色：是革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵，要求脫至流出的乙醇不帶顏色為止，立即水洗。若脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染為陰性菌。染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后（沖反面），應(yīng)吸去玻片上的殘水，以免染色液被稀釋而影響染色效果。革蘭氏染色注意事項第十九頁，共二十五頁，2022年，8月28日制備菌懸液染色涂片固定脫色復(fù)染鏡檢改良的Schaeffer-Fulton氏染色法（四）實驗步驟——芽孢染色第二十頁，共二十五頁，2022年，8月28日芽孢染色---制備菌懸液生理鹽水

1、滴生理鹽水

挑取2-3環(huán)菌苔與生理鹽水混勻2、制備菌懸液在EP管中滴2滴生理鹽水第二十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日芽孢染色---染色5%孔雀綠染液1、滴加孔雀綠染液沸水浴加熱15-20min2、加熱染色在離心管中滴2-3滴孔雀綠染液第二十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日芽孢染色---涂片固定經(jīng)孔雀綠染色細菌懸液1、滴菌懸液用接種環(huán)均勻涂布2、涂片接種環(huán)取菌懸液在載玻片中央

3、干燥室溫自然晾干4、固定通過酒精燈火焰3次固定第二十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日芽孢染色---復(fù)染0.5%番紅水溶液1、滴番紅水溶液滴加數(shù)滴番紅染液在菌膜上，染色2min2、水洗不要直接沖菌膜第二十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日蠟狀芽孢桿菌（B.cer）1、制備菌液：加2滴蒸餾水于1.5ml離心管中，用接種環(huán)從斜面挑取菌體2-3環(huán)于離心管中充分混勻。（2人一組）2、染色：加孔雀綠2-3滴于小試管中。3、加熱：沸水浴，15-20分鐘。4、