細(xì)胞生物學(xué)基本實驗技術(shù)

細(xì)胞生物學(xué)基本實驗技術(shù)

細(xì)胞水平亞細(xì)胞水平

分子水平

顯微技術(shù)細(xì)胞分離技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞組分的分級分離細(xì)胞內(nèi)分子示蹤細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)一、顯微鏡技術(shù)microscopy

μm

微米

=10-6m

nm

納米

=10-9m

?

埃

=10-10m

(一)光學(xué)顯微鏡技術(shù)

利用光線照明,將微小物體形成放大影像的儀器

1.顯微鏡的分辨率顯微鏡或人眼在25cm的明視距離處,能分辨被檢物體微細(xì)結(jié)構(gòu)最小間隔的能力。

d=

光學(xué)顯微鏡的分辨極限0.2μm0.61λ

nsinθ

100μm0.2μm2.光鏡標(biāo)本切片的制備

(1)

固定

定義：將組織浸入化學(xué)試劑中，通過在細(xì)胞中大分子間形成交聯(lián)，保持細(xì)胞中原有結(jié)構(gòu)的形態(tài)和位置的過程。

固定的目的：

A防止組織自溶或腐敗

B保持細(xì)胞原有的形態(tài)

C保持細(xì)胞各種成分的原有位置

常用固定劑：乙醇、甲醛、戊二醛

(2)脫水

定義：借助某些化學(xué)溶劑置換組織內(nèi)水分的過程。

常用的脫水劑：酒精

(3)包埋

定義：將組織塊包入包埋劑使組織硬化的過程。

常用的包埋劑：液體石蠟、樹脂

(4)切片

1-10μm

（5）染色采用某些化學(xué)物質(zhì)特異性或選擇性地與細(xì)胞內(nèi)的某些成分相互作用，從而原位顯示細(xì)胞某種成分或結(jié)構(gòu)的方法

A選擇性染色

考馬斯亮藍(lán)染色細(xì)胞中蛋白質(zhì)Brachet反應(yīng)染色RNA,DNA

蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色病理組織切片最常用的方法蘇木素：堿性染料結(jié)合DNA

細(xì)胞核染成藍(lán)色伊紅：與細(xì)胞漿中成分不同程度結(jié)合

將其染成不同程度紅色B特異性染色

酶+底物

抗原+抗體+substrateantigenantibody************酶標(biāo)記：免疫組織化學(xué)技術(shù)熒光標(biāo)記：免疫熒光技術(shù)3.熒光顯微鏡技術(shù)

(1)原理熒光分子在受到光照射后，可吸收特定波長的短波光線，并發(fā)射出比原來吸收波長更長的光

可見光紫外光紅外光shortlongλ

（2）熒光顯微鏡的基本構(gòu)造

A紫外光光源

B二向色鏡：反射短波光線，透過長波光線

C濾光片

（3）常用的熒光染料

A有機(jī)染料熒光素羅丹明

FITCB量子點quantumdotⅡ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族元素構(gòu)成的半導(dǎo)體納米結(jié)晶良好的光學(xué)穩(wěn)定性抗光漂白性（4）應(yīng)用

A免疫熒光顯微技術(shù)（Immunofluorescencemicroscopy）采用熒光素標(biāo)記的已知抗體作為探針，檢測待測組織、細(xì)胞中靶抗原，以達(dá)到對抗原物質(zhì)進(jìn)行定位、定性和定量的目的。

B綠色熒光蛋白（greenfluorescenceprotein,GFP)發(fā)現(xiàn)于水母中,在藍(lán)色波長范圍內(nèi)的光線激發(fā)下，能夠產(chǎn)生綠色熒光，其基因常被用作報告基因。

4.相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）

(1)原理

波長顏色振幅

亮度速度

相位

相差顯微鏡將光線通過標(biāo)本產(chǎn)生的相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹钊搜劭筛兄?2)應(yīng)用

活體細(xì)胞觀察5.激光掃描共焦顯微鏡（Laser

Scanning

ConfocalMicroscope）

(1)原理

在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源，掃描裝置，共軛聚焦裝置和檢測系統(tǒng)而形成的顯微鏡。單色激光光源光源后－照明針孔－點光源檢測器前－探測針孔分層掃描三維重建照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共扼的

（2）應(yīng)用

細(xì)胞的形態(tài)定位

細(xì)胞的三維重建

細(xì)胞定量熒光檢測

DNARNA蛋白質(zhì)含量

活細(xì)胞內(nèi)Ca2+pH動態(tài)檢測果蠅胚胎原腸胚（二）電子顯微鏡技術(shù)

利用電子與固體樣品作用時所發(fā)出的信息,

對樣品進(jìn)行微區(qū)觀察和分析的技術(shù)亞顯微結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)

1.電子顯微鏡的特點

高分辨率

理論上

d=0.002nm

實際上

d=0.1nm

生物標(biāo)本

d=2nm

高放大倍率

1,000,000

陰極陽極聚光鏡（電磁透鏡）物鏡中間鏡投影鏡電鏡照片照相底片真空、上下顛倒

2.透射電子顯微鏡（Transmissionelectronmicroscope,TEM）

(1)基本構(gòu)造

透射電鏡鏡體照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)真空系統(tǒng)計算機(jī)電路系統(tǒng)(2)透射電鏡標(biāo)本的制備過程樣品需特殊制備

高分辨,高放大

保持結(jié)構(gòu)的原有細(xì)節(jié)—取材、固定

高真空，高電子轟擊

耐高真空、高溫—

包埋

電子散射能力弱

提高反差—

電子染色

電子穿透能力弱

制作超薄切片—

包埋、切片B固定雙固定戊二醛固定蛋白質(zhì)

鋨酸固定膜成分（C=C)A取材

要點：快、冷、小C脫水上升梯度

乙醇：30%50%70%80%90%95%100%

D包埋

使用環(huán)氧樹脂包埋劑（單體樹脂加溫聚合）E切片

500–700?

F

重金屬染色

U(醋酸雙氧鈾)Pb(檸檬酸鉛)

NADP酶反應(yīng)嗜鋨反應(yīng)TPP酶反應(yīng)2.掃描電子顯微鏡

（Scanningelectronmicroscopy,SEM）(1)原理

二次電子(2)分辨率

3-10nm(3)樣品的制備

A固定

B脫水

C干燥臨界點干燥

D染色AuPt透射電鏡利用穿透標(biāo)本的電子進(jìn)行成像(散射)觀察組織的二維切片掃描電鏡利用標(biāo)本表面發(fā)射的二次電子成像觀察組織的表面三維結(jié)構(gòu)（三）掃描探針顯微鏡

（Scanningprobemicroscope,SPM）1.掃描隧道顯微鏡

使用原子尺度的探針在標(biāo)本表面掃描，在探針針尖和樣品之間施加一定電壓，產(chǎn)生隨標(biāo)本表面形貌變化的隧道電流。

分辨率高

可在非真空狀態(tài)下工作

直接觀察大分子的三維結(jié)構(gòu)掃描隧道顯微鏡下的人紅細(xì)胞血影2.原子力顯微鏡

通過分析探針針尖與樣品之間的原子間作用力來獲取所觀察表面的微觀信息。

樣品無需具有導(dǎo)電性

可在三態(tài)下工作

活細(xì)胞表面及生物大分子空間伸展及其結(jié)晶體表面觀測原子力顯微鏡下的中國倉鼠卵巢細(xì)胞原子力顯微鏡觀察細(xì)胞微絲的動態(tài)變化二、細(xì)胞分離技術(shù)（cellseparation）從活體組織獲得相對單一類型的細(xì)胞群的方法

1.制備單一細(xì)胞懸液

組織

單一細(xì)胞消化EDTA

細(xì)胞間連接胰酶

細(xì)胞外基質(zhì)二、細(xì)胞分離技術(shù)（cellseparation）從活體組織獲得相對單一類型的細(xì)胞群的方法

1.制備單一細(xì)胞懸液

組織

單一細(xì)胞消化EDTA

細(xì)胞間連接胰酶

細(xì)胞外基質(zhì)2.分離不同類型細(xì)胞

(1)

離心（centrifugation）

大小密度形狀

小輕不規(guī)則

大重圓形(2)免疫磁珠法

利用帶有特定單抗的免疫磁珠與靶細(xì)胞的特異結(jié)合，快速地從多細(xì)胞懸液中將目的細(xì)胞分離出來。

Fe2O3或Fe3O4顆粒

+

單克隆抗體免疫磁珠(3)

流式細(xì)胞儀(flowcytometry)

能夠快速分選或檢測細(xì)胞及其組分的物理或化學(xué)特性的技術(shù)

A原理:

抗原+抗體*熒光標(biāo)記

B樣品制備

細(xì)胞懸液制備細(xì)胞固定細(xì)胞染色

B應(yīng)用*細(xì)胞分選

cellin10005000cells/sec*細(xì)胞大小測量*DNA含量測定*免疫表型分析*細(xì)胞功能分析*細(xì)胞凋亡研究細(xì)胞周期分析

藥物處理前后HT29細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果

G0/G160.86%S29.14%G210.00%G0/G137.68%S37.56%G224.76%AB流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡

ND-1-QD605標(biāo)記不同大腸癌細(xì)胞的流式細(xì)胞定量分析(4)激光捕獲顯微切割技術(shù)（Lasercapturemicrodissection，LCM）從組織切片中精確分離獲取單一細(xì)胞的方法

工作原理及過程:A制備組織切片B鏡下將組織切片覆以薄膜C激光束切割特定細(xì)胞或區(qū)域D收集管收集

三、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（Cellculture）

從活體組織中分離出特定的細(xì)胞，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之能夠繼續(xù)生存、生長以至增殖的方法

invitro用培養(yǎng)細(xì)胞做實驗

invivo用動物做實驗1.細(xì)胞培養(yǎng)的條件

(1)

固體表面：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿

(2)培養(yǎng)基常見培養(yǎng)基：1640DMEM

(3)無菌無菌操作：超凈工作臺、火焰消毒等培養(yǎng)液中加入抗菌素器械、溶液以不同方式進(jìn)行消毒

（烤箱、高壓滅菌、過濾）(4)其他溫度37℃

濕度100%CO2濃度5%倒置相差顯微鏡培養(yǎng)箱2.細(xì)胞培養(yǎng)的傳代

原代培養(yǎng):直接取材于有機(jī)體的細(xì)胞培養(yǎng)取材切割消化培養(yǎng)

傳代培養(yǎng):將原代培養(yǎng)存活的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，以1:2以上的比例擴(kuò)大培養(yǎng)

原代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)(保持分化特性)

傳代3.細(xì)胞系（Cellline）

在細(xì)胞培養(yǎng)中，偶然情況下產(chǎn)生的具有無限繁殖能力，能夠無限傳代的細(xì)胞群。

變異細(xì)胞

細(xì)胞系

HeLa人宮頸癌上皮細(xì)胞

3T3小鼠成纖維細(xì)胞無限繁殖相差顯微鏡觀察培養(yǎng)中的HeLa細(xì)胞四、細(xì)胞組分的分級分離通過逐級分離對細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和各種成分的化學(xué)性質(zhì)和功能進(jìn)行研究的方法。勻漿分級分離分析

勻漿液膜細(xì)胞器大分子

低滲超聲去污劑強(qiáng)制過濾研磨

細(xì)胞破壞（一）離心法用于分離細(xì)胞器和大分子

配平低溫

1.差速離心法

分離對象:不同大小和形狀的組分

（細(xì)胞核、細(xì)胞器）

具體方法:由低速到高速逐級沉降(repeat)2.速度沉降法

分離對象:不同大小、形狀的組分(沉降系數(shù)S)

比差速離心方法更精細(xì)

具體方法:

在離心管中予裝5%-20%蔗糖梯度的離心介質(zhì)

3.平衡沉降法

分離對象:密度不同的組分（與大小、形狀無關(guān)）

具體方法：在離心管中予裝一定密度梯度的離心介質(zhì)（20%-70%蔗糖、CsCl）通常采用超速離心

（二）層析法（柱層析）主要用于分離、純化蛋白質(zhì)

填充柱填料（固定相）流動相

1.離子交換層析

層析介質(zhì):陰離子或陽離子樹脂

分離原理:電荷

2.凝膠過濾層析層析介質(zhì):凝膠分離原理:分子大小

3.親和層析

層析介質(zhì):

基質(zhì)+抗體底物

分離原理:

親和性4.高壓液相層析HPLC

基質(zhì)粒度?。?-10μm）、分辨率高、分離速度快

(三)電泳法

主要用于分離蛋白質(zhì)、核酸

1.瓊脂糖凝膠電泳

分離對象:核酸

支持介質(zhì):瓊脂糖

凝固點40-45℃

不同濃度凝膠具有不同孔徑

電泳緩沖液:TAE\TBE

染料:溴化乙錠EB(三)電泳法

主要用于分離蛋白質(zhì)、核酸

1.瓊脂糖凝膠電泳

分離對象:核酸

支持介質(zhì):瓊脂糖

凝固點40-45℃

不同濃度凝膠具有不同孔徑

電泳緩沖液:TAE\TBE

染料:溴化乙錠EB2.SDS

分離對象:蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)分子量、亞單位組成)

樣品處理:SDS陰離子表面活性劑

β-巰基乙醇還原劑

大小

電荷

形狀

支持介質(zhì):

丙稀酰胺甲叉雙丙稀酰胺

染色:

考馬斯亮藍(lán)銀染

特異性蛋白

(westernblotting)SDS3.雙向電泳

根據(jù)蛋白質(zhì)分子量、等電點分離

等電聚焦:等電點

SDS:分子量4.Western印跡技術(shù)

將經(jīng)聚丙稀酰胺凝膠分離的蛋白帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,然后將膜與特異性抗體作用,膜上特定蛋白條帶將與抗體結(jié)合,并進(jìn)一步與酶標(biāo)記二抗或生物素標(biāo)記二抗反應(yīng),最終以發(fā)色底物顯色而被檢測.基本步驟:(1)SDS(2)轉(zhuǎn)膜

(3)抗體反應(yīng)一抗孵育標(biāo)記二抗孵育

(4)顯色westernblotting五、細(xì)胞化學(xué)和細(xì)胞內(nèi)分子示蹤技術(shù)

目前普遍應(yīng)用的細(xì)胞內(nèi)分子示蹤技術(shù)是基于光鏡

和電鏡的細(xì)胞化學(xué)技術(shù)細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

是一類將細(xì)胞形態(tài)觀察和組分分析相結(jié)合的分析方法，是在保持組織原有結(jié)構(gòu)情況下，利用生物大分子、小分子、無機(jī)離子的物理、化學(xué)特性來研究其在細(xì)胞內(nèi)的分布、數(shù)量及動態(tài)變化。包括酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

放射自顯影技術(shù)等（一）免疫組織化學(xué)技術(shù)（免疫細(xì)胞化學(xué)）immunohistochemistry,IHC用標(biāo)記的特異性抗原或抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)的抗原或抗體進(jìn)行定性、定位、定量的技術(shù)1.脫蠟、水化

二甲苯脫蠟梯度酒精水化2.抗原修復(fù)使封閉的抗原暴露

熱修復(fù)法：微波熱修復(fù)、煮沸熱修復(fù)、

高溫高壓熱修復(fù)（高壓鍋）

酶消化法：胰蛋白酶3.滅活內(nèi)源性過氧化物酶

過氧化物酶阻斷劑H2O24.封閉避免非特異性結(jié)合

內(nèi)含BSA的封閉液5.免疫反應(yīng)

一抗生物素標(biāo)記二抗6.顯色（SP法）

鏈霉親和素-過氧化物酶+DAB7.蘇木素核復(fù)染(二)抗體示蹤技術(shù)1.抗體+熒光染料

光學(xué)顯微鏡GFP

GFP融合剪切體蛋白2.

抗體+高電子致密物

電子顯微鏡

膠體金抗體標(biāo)記胰島素

(三）放射自顯影技術(shù)autoradiography

1.原理使用同位素標(biāo)記

同位素:

核外電子數(shù)相同

化學(xué)性質(zhì)相同

原子核重量不同

放射性同位素:衰變

2.應(yīng)用

條件：同位素可被儀器檢測

可被細(xì)胞攝入

摻入方法：標(biāo)記氨基酸示蹤蛋白質(zhì)

標(biāo)記T示蹤DNA

標(biāo)記U示蹤RNA

脈沖標(biāo)記A放射性物質(zhì)脈沖摻入活細(xì)胞B不同時間取樣切片C暗處曝光D顯影、定影胰島素合成分泌過程六、細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）特異性體外DNA擴(kuò)增技術(shù)

利用針對目的基因所設(shè)計的一對特異寡核苷酸引物，以目的基因為模板，以dNTP為原料，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行的DNA體外合成技術(shù)。

（1）反應(yīng)體系：模板鏈

DNA聚合酶

dNTP

引物

（primer）（與模板相應(yīng)序列互補(bǔ)）

（2）反應(yīng)步驟：

變性94℃

退火55℃

延伸72℃

2.RealtimePCR

實時定量PCR(熒光定量PCR)通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。

熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量呈線性關(guān)系熒光背景信號階段平臺期以反應(yīng)管中熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值時所需的PCR反應(yīng)循環(huán)個數(shù)（Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。3.核酸分子雜交

(1)Southernblotting–DNA

將凝膠分離的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持膜上,然后與存在于液相中的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交,以檢測特定DNA序列的技術(shù).

(2)Northernblotting

–

RNADNA

DNA

RNADNA

RNA

RNA特異性探針A基因組DNA的消化B瓊脂糖凝膠電泳分離C轉(zhuǎn)膜D雜交E放射自顯影(3)原位雜交技術(shù)（insituhybridization）

用核酸探針與細(xì)菌、細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，以檢測特定核酸分子在細(xì)胞內(nèi)原有位置的方法。FISH4.基因轉(zhuǎn)移技術(shù)應(yīng)用物理、化學(xué)或生物學(xué)等技術(shù)和方法將外源基因轉(zhuǎn)移到受體菌或細(xì)胞內(nèi)，并使其在細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)入基因的擴(kuò)增或表達(dá)。

外源基因細(xì)菌轉(zhuǎn)化

真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染基因