酶的分離技術(shù)

三、酶的分離技術(shù)酶活力，也就是酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。（可以根據(jù)需要定義）酶促反應(yīng)速度，單位是：濃度/單位時(shí)間酶促反應(yīng)速度曲線：酶溶液的制備材料預(yù)處理與細(xì)胞破碎胞外酶：鹽析或者單寧沉淀、有機(jī)溶劑沉淀，制成酶泥孢內(nèi)酶：收集菌體，破碎細(xì)胞再提取物理破碎法

通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法統(tǒng)稱為物理破碎法。該方法多用于微生物細(xì)胞的破碎。

機(jī)械破碎法高壓法爆破性減壓閥快速凍融法機(jī)械破碎法

通過機(jī)械運(yùn)動所產(chǎn)生的剪切力，使組織細(xì)胞破碎的方法稱為機(jī)械破碎法。機(jī)械搗碎法研磨法勻漿法組織搗碎機(jī)珠磨式組織研磨器勻漿法化學(xué)破碎法

應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破壞的方法。

1.有機(jī)溶劑處理：利用有機(jī)溶劑可使細(xì)胞膜的磷質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋放出胞外。2.表面活性劑處理：表面活性劑可以和細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的通透性。

3.溶菌酶處理：用溶菌酶專一性的分解菌體細(xì)胞壁的多糖分子，使細(xì)胞壁破壞，并在低滲透壓的溶液中使細(xì)胞破裂。4.自溶法：將細(xì)胞在一定的pH和適宜的溫度條件下保溫一段時(shí)間，通過細(xì)胞本身存在的酶系將細(xì)胞破壞，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來的方法。2、酶的抽提

在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑中的過程，也稱作酶的抽提。1.鹽溶液提取2.酸溶液提取3.堿溶液提取4.有機(jī)溶劑提取主要方法2.1酶提取過程中的注意事項(xiàng)

1.溫度：0-4℃最佳2.pH：4-6為最佳3.提取液的體積：1-5倍4.添加保護(hù)劑：維生素C，蛋白酶抑制劑等溫度和pH對酶的活性的影響2.2.1離心分離離心是指借助離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小和不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)

2.2酶的提取過程中常用的技術(shù)離心機(jī)的種類及用途1.常速離心機(jī)：<8000r/min,<1x104g2.高速離心機(jī)：1x104~2.5x104r/min,1x104~1x105g3.超速離心機(jī)：2.5x104~8x104r/min,5x105g超速離心是通過改變某些條件，使溶液中某種溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀出來，達(dá)到與其他溶質(zhì)分離的目的。

2.2.2沉淀分離等電點(diǎn)沉淀（等電點(diǎn)時(shí)靜電荷為零，相鄰蛋白質(zhì)分子間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀）鹽析與鹽溶（中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，稱為鹽溶；鹽析作用主要是大量中性鹽爭奪蛋白質(zhì)疏水表面水分子）有機(jī)溶劑分級分離（有機(jī)溶劑降低蛋白質(zhì)表面可解離基團(tuán)的離子化程度，促進(jìn)蛋白質(zhì)的聚集和沉淀）利用溶解度差別的純化分級沉淀（鹽或有機(jī)溶劑）蛋白質(zhì)在高濃度中性鹽溶液中會沉淀析出，稱為鹽析鹽析原理：高濃度鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水膜，同時(shí)鹽離子也會影響蛋白質(zhì)分子所帶電荷，從而引起蛋白質(zhì)沉淀，但通常不會引起蛋白質(zhì)的變性。2.2.3層析分離

什么是層析-chromatography利用混合物中個組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子特性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)等）的不同，使各組分在兩相中的分布程度不同而達(dá)到分離的目的。March21,1903,MeetingoftheWarsawSocietyofNaturalScientists,MikhailSemenovichTswettpresentedalectureentitled"OnaNewCategoryofAdsorptionPhenomenaanditsApplicationinBiochemicalAnalysis".

1.吸附層析

2.凝膠層析

3.離子交換層析

4.親和層析

常用的層析方式1.凝膠層析又稱分子篩層析，凝膠過濾或分子排阻層析，是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中個組分的相對分子質(zhì)量不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。2.親和層析是利用生物分子對之間所具有的專一性而又可逆的親和力使生物分子分離純化的技術(shù)。載體配基：底物、競爭性抑制劑、輔酶酶3.離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對各種離子的親和力不同，而使不同物質(zhì)分離的方法。離子交換層析原理離子交換劑的選擇陰離子交換劑陽離子交換劑離子交換劑的處理離子交換劑的操作過程裝柱上柱洗脫收集再生層析系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室用層析柱工業(yè)用層析柱0.5-5cm5-100cm2.2.4萃取分離混合液中各組分在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。1.有機(jī)溶劑萃取

2.雙水相萃取

3.超臨界萃取

4.反膠束萃取有機(jī)溶劑萃取利用溶質(zhì)在水和有機(jī)溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離萃取的目的水相有機(jī)相

雙水相萃取利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離萃取的目的水相水相1.1%右旋糖酐溶液

0.36%甲基纖維素溶液0.39%右旋糖酐溶液

0.65%甲基纖維素溶液

超臨界萃取

超臨界流萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)

知識鏈接——超臨界流體（SupercriticalFluid，SF）是處于臨界溫度（Tc）和臨界壓力（Pc）以上，介于氣體和液體之間的流體。超臨界流體具有氣體和液體的雙重特性。

SF的密度和液體相近，粘度與氣體相近，但擴(kuò)散系數(shù)約比液體大100倍。由于溶解過程包含分子間的相互作用和擴(kuò)散作用，因而SF對許多物質(zhì)有很強(qiáng)的溶解能力。這些特性使得超臨界流體成為一種好的萃取劑。

帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。

2.2.5電泳分離

蛋白質(zhì)常用電泳技術(shù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing-IEF）雙向電泳（TwoDimensionalElectrophoresis

）PAGE聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,簡稱Bis)在加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethylethylenediamine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O3，簡稱AP)或核黃素(ribofavin即vitaminB2,C17H2O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。三種物理效應(yīng)

樣品濃縮效應(yīng)分子篩效應(yīng)電荷效應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）管狀電泳圖譜平板PAGE圖譜PAGE

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳山梨糖脫氫酶的PAGE活性染色導(dǎo)致：1、由于SDS是陰離子，使多肽表面覆蓋的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了原來的電荷差異。2、改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都相同，長軸長度隨其分子量的大小成正比變化SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳法測定未知蛋白的分子量SDS

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分為還原型和非還原型，區(qū)別在于是否含有還原劑。

SDS分析scFv-507的表達(dá)形式

M：低分子量標(biāo)準(zhǔn)1：誘導(dǎo)前的全菌體；2：誘導(dǎo)后的全菌體；

3：菌體超聲破碎后上清；4：菌體超聲破碎后沉淀。

等電聚焦電泳（Isoelectricfocusing—IEF）等電聚焦電泳蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負(fù)電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。在電場存在下的一定pH溶液中，帶正電的蛋白分子將向負(fù)極移動而帶負(fù)電的蛋白分子將向正極移動，在某一pH時(shí)，蛋白分子在電場中不再移動，此時(shí)的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。等電聚焦(IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負(fù)極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運(yùn)動，最后各自停留在其等電點(diǎn)的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點(diǎn)。等電聚焦電泳蛋白質(zhì)在具有pH梯度的介質(zhì)中電泳等電聚焦電泳雙向電泳第一向在高壓電場下對蛋白質(zhì)進(jìn)行等電聚焦(IEF)在第一向垂直方向上進(jìn)行第二向第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)。

特點(diǎn)：可分離10～100kD分子量的蛋白質(zhì)高靈敏度和高分辨率便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理與質(zhì)譜分析匹配等電聚焦(IEF)SDS雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白質(zhì)多肽鏈分離純化和鑒定的主要實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。TwoDimensionalElectrophoresisofE.coliProteins

-morethan2,000proteinswerevisualized2.2.5酶的結(jié)晶

酶以晶體的形式從溶液中析出。

1.一定的純度

2.一定的濃度

3.溫度

4.pH

5.離子強(qiáng)度條件：1.鹽析結(jié)晶法

2.有機(jī)溶劑結(jié)晶法

3.滲透平衡結(jié)晶法

4.等電點(diǎn)結(jié)晶法方法：2.2.6酶的濃縮與干燥

酶的濃縮：從低濃度酶液中除去部分的水或其他溶劑而成為高濃度溶液的過程。

1.離心

2.過濾

3.膜分離

4.沉淀

5.層析

6.蒸發(fā)

7.吸水劑及干燥劑的應(yīng)用2.2.7酶的濃縮與干燥

酶的干燥：將固體、半固體或濃縮液中的水分（或其他溶劑）除去一部分，以獲得含水分較少的固體的過程。

1.真空干燥

2.冷凍干燥

3.噴霧干燥

4.氣流干燥

5.吸附干燥GuidelinesforProteinPurification減少每步操作時(shí)間toavoidlengthyprocedureswhichrisklosingactivity/reducingrecovery減少添加物additivesmayneedtoberemovedinanextrapurificationstepormayinterferewithactivityassays早期除去降解物forexample,proteases每步使用不同的純化方法totakeadvantageofsamplecharacteristicswhichcanbeusedforseparation(size,charge,hydrophobicity,ligandspecificity)KEEPITSIMPLE!三、酶與細(xì)胞固定化主要內(nèi)容為什么要固定化什么叫做固定化如何固定固定化的酶活力測量固定化酶的特征固定化酶的應(yīng)用1、穩(wěn)定性差2、回收困難，一次使用3、產(chǎn)物的分離純化困難(一)為什么要對酶進(jìn)行固定化？(二)什么是固定化酶固定化酶（Immobilizedenzyme）：固定在一定載體上，在一定空間范圍內(nèi)起催化作用的酶。水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)必須注意維持酶的催化活性及專一性固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動化、連續(xù)化固定化酶應(yīng)該有最小的空間位阻酶與載體必須結(jié)合牢固固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性固定化酶成本要低(三)固定化酶的制備原則優(yōu)點(diǎn)固定化酶可以重復(fù)，使用效率高，成本低極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；在大多數(shù)情況下，能提高酶的穩(wěn)定性；具有一定的機(jī)械強(qiáng)度可以在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；酶反應(yīng)過程能夠加以控制；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，簡化了提純工藝；較游離酶更適合多酶反應(yīng)；可以增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；酶的使用效率提高，成本降低。(四)固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)缺點(diǎn)固定化時(shí)，酶活力有損失；工廠初始投資大；只能用于可溶性底物；胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離。吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法、熱處理法(五)如何進(jìn)行酶固定化固定化酶的模式圖定義；利用各種固體吸附劑將酶或含酶細(xì)胞吸附在其表面上而使酶固定的方法稱為物理吸附法，簡稱吸附法。常用的吸附劑：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、條件溫和、不易變性失活、載體廉價(jià)、可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：酶與載體結(jié)合不牢固，易脫落；最適吸附酶量無規(guī)律可循。1、吸附法定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。根據(jù)包埋的材料和包埋方法的不同，可分為：凝膠包埋法和半透膜包埋法兩類。2、包埋法將酶分子包埋在凝膠格子里。凝膠包埋法用得最多、最有效，但不適用于底物或產(chǎn)物分子很大的酶類的固定化。2.1凝膠包埋法條件溫和，操作簡便，對酶活影響小，但強(qiáng)度差。天然凝膠：合成凝膠：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等；聚丙烯酰胺凝膠、光敏交聯(lián)樹脂等強(qiáng)度高，對溫度、pH值變化耐受性強(qiáng)，需要特定的聚合條件，酶易變性。包埋材料將酶包埋在有各種高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。半透膜：聚酰胺膜、火棉膠膜等。適用于底物和產(chǎn)物都是小分子的酶的固定化。2.2半透膜包埋法（微囊化法）3.1離子鍵結(jié)合法通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體：DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素。

優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)酶與載體結(jié)合不牢固，使用時(shí)需嚴(yán)格控制好pH值、離子強(qiáng)度、溫度等操作條件。3、結(jié)合法條件溫和、操作簡便、活力損失少?！锿ㄟ^共價(jià)鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等?！d體→活化→活化載體基團(tuán)＋酶分子基團(tuán)

3.2共價(jià)鍵結(jié)合法適用于含有苯氨基的不溶性載體載體先在稀HCl和亞硝酸鈉中進(jìn)行重氮反應(yīng)，然后再在溫和條件下和酶分子上相應(yīng)的基團(tuán)如酚羥基或咪唑基進(jìn)行偶聯(lián)。（1）重氮法Tyr含量高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶、β-葡萄糖苷酶可與多種重氮化載體連接。（2）疊氮法

含有酰肼基團(tuán)的載體可用亞硝酸活化，生成疊氮化合物?；顫姷寞B氮基團(tuán)可與酶分子中的-NH2形成肽鍵，此外疊氮基團(tuán)還可與酶分子中的-OH、-SH等反應(yīng)。使酶固定化。如：對于帶-OH的載體如葡萄糖、纖維素、瓊脂糖來說是最常用的反應(yīng)。在堿性條件下載體-OH和BrCN反應(yīng)生成極活潑的亞氨基碳酸酯衍生物，它們在堿性條件下可與酶的氨基進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)。（3）溴化氰法堿性氨基甲酸衍生物亞氨碳酸酯衍生物+ENZ異脲型亞氨碳酸酯型氨基甲酸酯型（4）烷基化法含羥基的載體可用三氯-均三嗪、溴乙酸溴等多鹵代物活化?；罨d體上的鹵素基團(tuán)可與酶分子上的氨基、巰基、羥基等發(fā)生烷基化反應(yīng)，制備固定化酶。R-OH+NNNClClCle.g.R-ONNNClClR-ONNNNH-EClE-NH2利用雙功能試劑，在酶分子間或酶與載體間，或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以制備固定化酶的方法。交聯(lián)試劑：戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。4、交聯(lián)法酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶交聯(lián)反應(yīng)條件激烈，酶的多個基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶的活力損失大。制備的固定化酶顆粒較小，不便于使用。優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)結(jié)合牢固，酶不會脫落，可長時(shí)間使用。雙重固定化5、熱處理法如：將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌在60~65℃溫度下處理15min，可以使葡萄糖異構(gòu)酶固定在菌體內(nèi)。將含酶細(xì)胞在一定溫度下熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體內(nèi)。只適用于熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化。方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)吸附法制作條件溫和、簡便、成本低、載體再生、可反復(fù)使用結(jié)合力弱，對pH、離子強(qiáng)度、溫度等因素敏感，酶易脫落，酶的裝載容量較小共價(jià)法載體與偶聯(lián)方法可選擇性大；酶的結(jié)合力強(qiáng)，非常穩(wěn)定偶聯(lián)條件激烈，易引起酶失活；成本高，某些偶聯(lián)試劑有一定毒性交聯(lián)法可用的交聯(lián)試劑多，技術(shù)簡易，酶的結(jié)合力強(qiáng)，穩(wěn)定性高交聯(lián)條件激烈，機(jī)械性能差包埋法包埋材料、包埋方法可選余地大，固定化酶的使用面廣，包埋條件溫和僅可用于低分子量的底物，不適用于柱系統(tǒng)，常有擴(kuò)散限制問題各種酶固定化方法的比較影響固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的因素

酶經(jīng)過固定化后引起的性質(zhì)改變，不外乎兩種原因：一是酶本身的變化，二是受固定化載體的物理或化學(xué)性質(zhì)的影響。就載體物化性質(zhì)和固定化過程影響而言，主要存在以下三種影響效應(yīng)：.

分配效應(yīng)

空間障礙效應(yīng)擴(kuò)散限制效應(yīng)固定化后的特征Chapter5ModificationofEnzymeMolecule第五章酶的分子修飾Contentsofchapter5酶分子修飾種類為什么要進(jìn)行酶分子修飾酶分子修飾部位及專一性分類酶修飾后的性質(zhì)變化GoGoGoGo酶的定向進(jìn)化Go什么是酶分子修飾？通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。第一節(jié)為什么要進(jìn)行酶修飾限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因：1)細(xì)胞外穩(wěn)定性差；2)酶活性不夠高；3)具有抗原性。酶化學(xué)修飾的意義(1).研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（50年代末）(2).人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。3）消除抗原性（針對特異性反應(yīng)降低生物識別能力）。4）產(chǎn)生新的催化能力。1）提高酶的生物活性（酶活力）

蛋白一級結(jié)構(gòu)通過內(nèi)部氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用,按熱力學(xué)最穩(wěn)定方式形成了特有的高級結(jié)構(gòu).(即一級結(jié)構(gòu)的氨基酸順序決定了高級結(jié)構(gòu)),而高級結(jié)構(gòu)決定了功能.一級結(jié)構(gòu)修飾后發(fā)生改變很多情況下會引起高級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而改變蛋白功能(包括酶活力)熱穩(wěn)定性修飾劑分子存在多個反應(yīng)基團(tuán)，可與酶內(nèi)部基團(tuán)形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。對抑制劑穩(wěn)定性大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。對水解酶的穩(wěn)定性A大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。B酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性

酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除

“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結(jié)合3)消除抗原性4)其它大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對穩(wěn)定酶蛋白化學(xué)修飾的局限性1.某種修飾劑對某一氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)修飾專一性是相對的，很少有對某一氨基酸側(cè)鏈絕對專一的化學(xué)修飾劑。2.酶的化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行，目前還不能用化學(xué)修飾的方法研究非極性氨基酸殘基在酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系中的作用。3.酶化學(xué)修飾的結(jié)果對于研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系能提供一些信息，如某一氨基酸殘基被修飾后，酶活力完全喪失，說明該殘基是酶活性所“必需”的，為什么是必需的，還得用X射線和其他方法來確定。因此化學(xué)修飾法研究酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系尚缺乏準(zhǔn)確性和系統(tǒng)性。第二節(jié)酶分子修飾部位及專一性分類酶蛋白結(jié)構(gòu)部位分類修飾專一性分類酶分子非必需基團(tuán)必需基團(tuán)活性中心必需基團(tuán)活性中心外必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán)非活性中心活性中心一酶蛋白結(jié)構(gòu)部位分類活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一個三維實(shí)體。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。(4)活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。(5)酶與底物通過鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級鍵結(jié)合?；钚灾行牡闹匾瘜W(xué)基團(tuán)

7種氨基酸出現(xiàn)的頻率最高

LysAspGluCysHisTyrSer

（蘭天果拌豬肉絲）某些功能基團(tuán),如（氨基、羧基、巰基、羥基和咪唑基）是酶的必需基團(tuán)。賴氨酸的氨基天冬氨酸和谷氨酸的羧基半胱氨酸的巰基組氨酸的咪唑基酪氨酸和絲氨酸的羥基1)非專一性化學(xué)修飾用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)作用。若某基團(tuán)被修飾后：酶活性不變——該基團(tuán)可能不是酶的必需基團(tuán)酶活性降低或喪失——該基團(tuán)可能是酶的必需基團(tuán)二修飾專一性分類2)專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾）用專一性化學(xué)修飾劑修飾酶活性中心的某一氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)。3)親和標(biāo)記（位點(diǎn)專一性修飾）采用的修飾試劑是根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成的含有活潑反應(yīng)基團(tuán)的底物類似物。利用酶對底物的特殊親和力將酶加以修飾標(biāo)記。化學(xué)修飾的專一性第三節(jié)酶分子的修飾方法金屬離子置換修飾大分子結(jié)合修飾(共價(jià)/非共價(jià);多結(jié)合水不溶分子)側(cè)鏈基團(tuán)修飾(多結(jié)合水溶解性小分子)肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾酶分子的物理修飾

(1)酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。金屬離子置換修飾的過程

a.酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。

b.除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無活性狀態(tài)。

c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。

(2)酶的大分子修飾使用一些能與酶非共價(jià)地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護(hù)酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時(shí)，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。非共價(jià)修飾用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍共價(jià)修飾大分子修飾(共價(jià))的過程修飾劑的選擇：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。(均相反應(yīng),無毒害)修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。修飾：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對酶分子進(jìn)行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶半衰期相對穩(wěn)定性天然SOD

6min

1右旋糖酐-SOD

7h

70

Ficoll(低分子量)–SOD

14h

140

Ficoll(高分子量)–SOD

24h

240

聚乙二醇-SOD

35h

350(3)酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法?？梢杂糜谘芯扛鞣N基團(tuán)在酶分子中的作用及其對酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團(tuán)時(shí)經(jīng)常采用。酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。(一級結(jié)構(gòu)是基礎(chǔ))催化活性/非催化活性基團(tuán)的修飾對非催化基團(tuán)修飾可改變酶的動力學(xué)性質(zhì)，改變酶對特殊底物的束縛能力。

(改變對底物親和能力)對催化活性基團(tuán)可以通過選擇性修飾側(cè)鏈成分來實(shí)現(xiàn)氨基酸的取代。(改變催化性質(zhì))經(jīng)常被修飾的殘基是： 親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 親電的Tyr、Trp氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：羧基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：氨基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：巰基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：咪唑基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：酚羥基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：胍基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：色氨酸吲哚基(4)酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活

有限水解意味著水解酶量和時(shí)間相對少同時(shí)由于水解部位氨基酸”埋”在蛋白位置差異,氨基酸周圍肽段引起的氨基酸pK值和電性變化,使同樣氨基酸部位水解程度也可能不同酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。

氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。(保護(hù)位點(diǎn)多,可修飾位點(diǎn)多;蛋白容易失去活力)

現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點(diǎn)突變技術(shù)。定點(diǎn)突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。(5)氨基酸置換修飾酶分子的定點(diǎn)突變1、基因序列分析2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析3、酶活性中心分析4、引物設(shè)計(jì)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變5、酶基因克隆表達(dá)6、變異特性分析(6)酶分子的物理修飾通過物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，(與前五種方法區(qū)別)酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。第四節(jié)酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期?？乖裕罕容^公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。第五節(jié)酶的定向進(jìn)化酶分子的合理設(shè)計(jì)(rationaldesign)

定點(diǎn)突變技術(shù)屬于合理設(shè)計(jì),這個技術(shù)需要對酶蛋白結(jié)構(gòu)和功能間對應(yīng)關(guān)系要有了解.通過設(shè)計(jì)酶結(jié)構(gòu)而得到一些功能.酶分子的定向進(jìn)化(directedevolution)

包括易錯PCR技術(shù),無須對蛋白結(jié)構(gòu)和功能間對應(yīng)關(guān)系有了解,先突變大量酶,再根據(jù)具體功能需要選擇合適的酶,再了解酶結(jié)構(gòu).兩種方法在酶結(jié)構(gòu)和關(guān)系間建立聯(lián)系,不段推動對酶蛋白結(jié)構(gòu)和功能了解.兩者聯(lián)合設(shè)計(jì)新酶可取得不錯效果酶的合理設(shè)計(jì)定向進(jìn)化的原理定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當(dāng)于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進(jìn)化而排除其他方向突變的作用，整個進(jìn)化過程完全是在人為控制下進(jìn)行的定向進(jìn)化產(chǎn)生突變庫手段-易錯PCR在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校對功能的性質(zhì)，(或則不含鎂離子含錳離子的聚合酶)配合適當(dāng)條件，向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。相對于自然條件下聚合酶十萬分之一到百萬分之一的復(fù)制出錯幾率,可以大量產(chǎn)生突變體。DNA改組（DNAshuffling）又稱有性PCR(sexualPCR)，原理。該策略的目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機(jī)會，導(dǎo)致更大的變異，最終獲取最佳突變組合的酶。通過DNA改組,不僅可加速積累有益突變，而且可使酶的2個或更多的已優(yōu)化性質(zhì)合為一體。外顯子改組（exonshuffling）類似于DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段間進(jìn)行交換，前者尤其適用于真核生物。在自然界中，不同分子的內(nèi)含子間發(fā)生同源重組，導(dǎo)致不同外顯子的結(jié)合，是產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的有效途徑之一。與DNA改組不同，外顯子改組是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動，而DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個基因片段上。定向進(jìn)化產(chǎn)生突變庫手段-DNA改組和外顯子改組DNA改組原理定向進(jìn)化的選擇策略1)、定向進(jìn)化中，突變具有隨機(jī)性，但通過選擇特定方向的突變限定了進(jìn)化趨勢，加之控制實(shí)驗(yàn)條件，限定突變種類，降低突變率，縮小突變庫的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進(jìn)化速度。2)、通常,篩選方法必須靈敏,至少與目的性質(zhì)相關(guān)。另有一些其他的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見光信號的底物或利用綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)等。

高通量的篩選體系(檢測量低,并行化,自動化)-96孔板體外定向進(jìn)化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進(jìn)化的基本先決條件。所謂酶的體外定向進(jìn)化，又稱實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)，它不需事先了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制(隨機(jī)突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計(jì)所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命力。酶性質(zhì)突變方法枯草桿菌蛋白酶E有機(jī)相活性/穩(wěn)定性易錯PCRβ-內(nèi)酰胺酶總活力/底物專一性DNA改組枯草桿菌蛋白酶BPN′穩(wěn)定性盒式誘變對硝基苯酯酶底物專一性/有機(jī)相活性易錯PCR/DNA改組胸腺嘧啶核苷激酶底物專一性盒式誘變β-半乳糖苷酶底物專一性DNA改組綠色熒光蛋白熒光DNA改組核酶底物專一性易錯PCR/DNA改組天冬氨酸酶活性與穩(wěn)定性隨機(jī)/定位誘變藥物和疫苗活性/專一性/最佳表達(dá)DNA改組酶的體外定向進(jìn)化應(yīng)用實(shí)例第一節(jié)酶在輕工、食品方面的應(yīng)用一、酶在食品方面的應(yīng)用1.酶法生產(chǎn)葡萄糖30-40%淀粉漿糊精α-淀粉酶pH6.0~6.585~90℃CaCl2,NaCl葡萄糖糖化酶pH4.5~5.055~60℃45min48hpH至2.0~2.5,室溫,除去葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶DE=15~202.酶法生產(chǎn)果葡糖漿40～45%葡萄糖果葡糖漿葡萄糖異構(gòu)化酶pH6.5~7.0

60~70℃MgSO445min預(yù)先經(jīng)層析脫鈣處理