第3章-細(xì)胞生物學(xué)研究方法(翟中和第四版)

第3章細(xì)胞生物學(xué)研究方法本章主要內(nèi)容細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞及其組分的分析方法細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程細(xì)胞及其生物大分子的動態(tài)變化模式生物與功能基因組的研究第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法病毒20-200nm支原體0.1-0.3μm細(xì)菌0.5-5.0μm動植物細(xì)胞20-30μm活細(xì)胞多是無色透明的直徑顯微鏡觀察范圍肉眼觀察范圍肉眼0.2mm光學(xué)顯微鏡0.2μm電子顯微鏡0.2nm掃描隧道顯微鏡樣品制備技術(shù)分辨率一、光學(xué)顯微鏡(lightmicroscope)從細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)、細(xì)胞學(xué)說的建立，直至今天光學(xué)顯微鏡仍然是細(xì)胞生物學(xué)研究的重要工具1.目鏡2.準(zhǔn)焦螺旋3.物鏡4.載物臺5.反光鏡（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡——組成由3部分組成：光學(xué)放大系統(tǒng)（目鏡與物鏡）

照明系統(tǒng)（光源和聚光鏡）鏡架及調(diào)節(jié)系統(tǒng)（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡——成像放大的倒立虛像經(jīng)物鏡形成倒立實(shí)像經(jīng)目鏡進(jìn)一步放大成虛像（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡——分辨率分辨率：顯微鏡最重要的性能參數(shù)分辨率是指能區(qū)分開兩個質(zhì)點(diǎn)間的最小距離普通光學(xué)顯微鏡最大分辨率0.2μmλ:光源波長N:介質(zhì)折射率,空氣為1,油為1.4α:物鏡鏡口角(最大140o,Sinα/2最大0.94)鏡口角是指被觀察點(diǎn)射入物鏡前透鏡的邊緣光線之間的夾角。（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡——樣品制備Figure9-10,11aMolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)石蠟切片H.E染色（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡利用光線干涉的原理，將相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，實(shí)現(xiàn)對非染色活細(xì)胞的觀察A.當(dāng)兩束光的相位相同時，相互干涉的結(jié)果使光波的振幅增加B.當(dāng)兩束光的相位相反時，則導(dǎo)致光波的振幅降低（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡相差顯微鏡是在普通光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上，添加“環(huán)狀光闌”和“相差板”，將光程差或相位差，轉(zhuǎn)換成振幅差體外培養(yǎng)MDCK細(xì)胞在普通（明視場）光學(xué)顯微鏡（A）和相差顯微鏡（B）下拍攝圖像效果的比較（二）相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡以平面偏振光為光源，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別分辨率比普通光鏡提高了一個數(shù)量級錄像增差顯微鏡可以用來直接觀察顆粒物質(zhì)沿著微管運(yùn)輸?shù)膭討B(tài)過程Figure9-9MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)Fourtypesoflightmicroscopy

(A)Theimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy

(B)phase-contrastmicroscopy(C)Nomarskidifferential-interference-contrastmicroscopy(D)dark-fieldmicroscopyFigure9-8MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)正置顯微鏡與倒置顯微鏡比較組成一樣，倒置顯微鏡的物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。（三）熒光顯微鏡——基本原理熒光：分子吸收入射光能量后電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)而發(fā)出的可見光(波長比入射光長)（三）熒光顯微鏡——基本原理光源和光學(xué)系統(tǒng)與普通光學(xué)顯微鏡不同核心部件是濾光片系統(tǒng)及專用物鏡鏡頭濾光片系統(tǒng)由激發(fā)濾光片和阻斷濾光片組成1.照明方式通常為落射式2.光源為紫外光或其他短波長的光3.有兩個特殊的濾光片

(發(fā)射濾片和阻斷濾片)熒光顯微鏡光路系統(tǒng)（三）熒光顯微鏡——樣品制備免疫熒光技術(shù)熒光素直接標(biāo)記技術(shù)綠色熒光蛋白(GFP)的基因與編碼某種蛋白質(zhì)的基因相融合表達(dá)兩種以上熒光素標(biāo)記同一樣品，可同時顯示不同成分在細(xì)胞中的定位（三）熒光顯微鏡——應(yīng)用在光鏡水平上，對細(xì)胞內(nèi)特異的蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂質(zhì)以及某些離子等組分進(jìn)行定性定位研究的有力工具熒光顯微鏡顯示出在有絲分裂中期細(xì)胞中，紡錘體微管（綠色）、中期染色體（藍(lán)色）和原纖維狀蛋白（fibrillarin）（紅色）等結(jié)構(gòu)成分（四）激光掃描共焦顯微鏡以激光為光源聚光鏡和物鏡同時聚焦到同一點(diǎn)上，排除焦平面以外的成像利用激光掃描裝置和計(jì)算機(jī)高速采集與處理匯聚每一個點(diǎn)上的信息，形成清晰的二維圖像分辨率比普通熒光顯微鏡1.4～1.7倍（四）激光掃描共焦顯微鏡可通過“光學(xué)切片”疊加后重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)Figure9-20MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)(二向的)3DImageReconstructionzxyzxyzyy熒光顯微鏡（a）和激光掃描共焦顯微鏡（b）二、電子顯微鏡透射電鏡

transmissionelectronmicroscope,TEM掃描電鏡

scanningelectronmicroscope,SEM（一）透射電子顯微鏡電子束作為光源電磁透鏡聚焦鏡筒高度真空圖像通過熒光屏或感光膠片記錄1．電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別Figure9-42(part1of2)MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)

光鏡電鏡光源可見光（300-700nm）電子束紫外光（200nm）分辨率200nm0.2nm透鏡玻璃透鏡磁透鏡真空無要求1.33*10-3—10-5Pa電子束的波長與加速電壓有關(guān)。當(dāng)加速電壓為50～100千伏時，電子束波長約為0.0053～0.0037納米2．電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)電子顯微鏡分辨率可達(dá)0.2nm電鏡的分辨本領(lǐng)是指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率3．電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子束照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)真空系統(tǒng)記錄系統(tǒng)（二）透射電鏡制樣技術(shù)——超薄切片技術(shù)戊二醛和四氧化鋨環(huán)氧樹脂厚度40-50nm重金屬鹽超薄切片黑白圖像超薄切片技術(shù)顯示的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)應(yīng)用超薄切片技術(shù)，幾乎可以觀察細(xì)胞的各種超微結(jié)構(gòu)Figure9-45MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)（二）透射電鏡制樣技術(shù)——負(fù)染色技術(shù)觀察線粒體基粒、核糖體、蛋白顆粒及細(xì)胞骨架纖維甚至病毒等重金屬鹽沉積在銅網(wǎng)上，而樣品未被染色（故名負(fù)染）分辨率可達(dá)1.5nm左右（二）透射電鏡制樣技術(shù)——冷凍蝕刻技術(shù)包括冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型兩步觀察膜斷裂面上的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面形貌特征，圖像有立體感樣品不需固定包埋

冰凍蝕刻電鏡照片透射電鏡照片與冰凍斷裂和冰凍蝕刻電鏡照片比較電鏡三維重構(gòu)與低溫電鏡技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)低溫電鏡技術(shù)電子掃描斷層成像技術(shù)核孔復(fù)合物（三）掃描電鏡技術(shù)利用電子“探針”在樣品表面進(jìn)行“掃描”激發(fā)樣品表面放出的二次電子成像，可以得到樣品表面的立體形貌（三）掃描電鏡技術(shù)樣品利用CO2

臨界點(diǎn)干燥法處理樣品觀察前噴鍍一層金膜一般掃描電鏡的分辨本領(lǐng)僅為3nmFigure9-49(part1of2)MolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)小結(jié)：光鏡、透射電鏡與掃描電鏡原理比較注意樣品制備技術(shù)的差異！三、掃描隧道顯微鏡探測微觀世界物質(zhì)表面形貌利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)具有原子尺度的高分辨本領(lǐng)可以在真空、大氣、液體等多種條件下工作非破壞性測量/wiki/File:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png第二節(jié)細(xì)胞及其組分的分析方法一、用超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分差速離心：利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同離心力，將各種質(zhì)量和密度不同的亞細(xì)胞組分和各種顆粒分開差速離心一、用超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分密度梯度離心：通過離心力的作用使樣品中不同組分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降帶二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法顯色劑與細(xì)胞組分中特殊基團(tuán)的結(jié)合通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂質(zhì)在細(xì)胞中的分布和相對含量福爾根反應(yīng)Feulgenstain特異顯示細(xì)胞內(nèi)呈紫紅色的DNA的分布原理：酸水解可以去除RNA，僅保留DNA，并除去DNA上嘌呤脫氧核糖核苷鍵的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露。所暴露的自由醛基與希夫試劑（Schiff’sreagent）反應(yīng)呈紫紅色三、特異蛋白抗原的定位與定性細(xì)胞內(nèi)特異蛋白的顯示可通過抗原－抗體特異結(jié)合的方法得以實(shí)現(xiàn)若抗體偶聯(lián)熒光染料，則可以通過熒光顯微鏡、激光共焦顯微鏡觀察為了觀察特異蛋白在細(xì)胞內(nèi)的精細(xì)定位，抗體需偶聯(lián)電子致密物(膠體金)，用電鏡觀察（一）免疫熒光技術(shù)直接間接免疫熒光技術(shù)（A）間接免疫熒光技術(shù)（B）（二）免疫電鏡技術(shù)在超微結(jié)構(gòu)水平上研究特異蛋白抗原的定位免疫膠體金技術(shù)受到越來越多的青睞四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性原位雜交：用標(biāo)記的核酸探針通過分子雜交確定特異核苷酸序列在染色體上或在細(xì)胞中的位置原位雜交技術(shù)光鏡水平同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針電鏡水平生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連膠體金標(biāo)記結(jié)合FISH(FluorescentInSituHybridization)五、定量細(xì)胞化學(xué)分析與細(xì)胞分選技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)是對細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。（flowcytometer）。/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player.html應(yīng)用1.分析細(xì)胞中DNA,RNA含量和細(xì)胞表面分子含量2.細(xì)胞、細(xì)胞組分的分選第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程/The_Origin_of_Hela_Cells一、細(xì)胞培養(yǎng)——動物細(xì)胞培養(yǎng)分為原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞細(xì)胞系：有限細(xì)胞系和連續(xù)細(xì)胞系細(xì)胞株：基本形態(tài)：成纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原代細(xì)胞1—10代以內(nèi)的細(xì)胞傳代細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞接觸抑制貼壁生長細(xì)胞分裂生長到表面接觸時停止分裂生長的現(xiàn)象細(xì)胞系

（Cellline)極少數(shù)細(xì)胞在傳10代后可渡過危機(jī)而傳下去40-50代次并仍保持原來的染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制行為有限細(xì)胞系永生細(xì)胞系：細(xì)胞發(fā)生了遺傳改變(染色體明顯改變)，有癌變特點(diǎn)細(xì)胞株（Cellstrain)

單個細(xì)胞增殖而來，所有細(xì)胞具有相同的遺傳性狀.目前實(shí)驗(yàn)室中常用的幾種細(xì)胞系細(xì)胞系名稱細(xì)胞類型來源3T3成纖維細(xì)胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細(xì)胞人BHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PC12嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP2／0骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國地鼠一、細(xì)胞培養(yǎng)——植物細(xì)胞培養(yǎng)單倍體細(xì)胞培養(yǎng)：用花藥或花粉在人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，通過發(fā)育成胚狀體，然后長成單倍體植株；或者通過愈傷組織誘導(dǎo)分化出芽和根，最終長成植株一、細(xì)胞培養(yǎng)——植物細(xì)胞培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)：體細(xì)胞經(jīng)纖維素酶處理去掉細(xì)胞壁的原生質(zhì)體經(jīng)誘導(dǎo)分化長成植株二、細(xì)胞工程（一）細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)細(xì)胞融合滅活的病毒化學(xué)物質(zhì)（如PEG）電融合同核體（homokaryon）異核體（heterokaryon）合核體（synkaryon）單克隆抗體與多克隆抗體單克隆抗體的制備（二）顯微操作技術(shù)與動物的克隆細(xì)胞拆合：胞質(zhì)體，核體物理法：機(jī)械法或短波光化學(xué)法：細(xì)胞松弛素顯微鏡下用顯微操作裝置對細(xì)胞進(jìn)行拆合或微量注射，如核移植、顯微注射基因等克隆羊多莉的培育第四節(jié)細(xì)胞及生物大分子的動態(tài)變化MartinDN,BaehreckeEHDevelopment2004;131:275-284一、熒光漂白恢復(fù)技術(shù)親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等與蛋白或脂質(zhì)耦聯(lián)高能激光束的照射使某一區(qū)域熒光不可逆淬滅由于生物膜的流動性，淬滅區(qū)熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)測定脂質(zhì)或蛋白質(zhì)在細(xì)胞中運(yùn)動速率fluorescencephotobleachingrecovery，F(xiàn)PRFigure10-36aMolecularBiologyoftheCell(?GarlandScience2008)二、單分子技術(shù)與細(xì)胞生命活動的研究指在單分子水平上對生物分子的行為(構(gòu)象變化、相互作用、相互識別等）的實(shí)時﹑動態(tài)檢測以及在此基礎(chǔ)上的操縱﹑調(diào)控等useopticaltrapstoprobethesteppingofsinglemoleculesofkinesinFluorescentimageofsinglemotorproteins(left):Motionoftwodiffusingkinesinmolecules(green)onamicrotubule(red)shownasatimeserieskymograph.Schematic(right):Bydraggingdiffusingkinesinmoleculeswithlasertweezersoveramicrotubule,thefrictionforcebetweenthemotoranditsmicrotubuletrackcanbemeasuredveryprecisely三、酵母雙雜交技術(shù)在體內(nèi)分析蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用利用轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合域(DB)和轉(zhuǎn)錄激活域(AD)結(jié)合在一起才具有完整轉(zhuǎn)錄激活功能的原理四、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)分子具有不同能級：分子中的外層電子，一般處于電子的基態(tài)S0(electronicgroundstate)的最低振動能級吸收光能以后，它可以被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)S1的任意振動能級。這－過程發(fā)生在10-15s時間內(nèi)被激發(fā)的分子，首先釋放能量回到S1的最低振動能級，此過程發(fā)生在10-12s內(nèi)；然后從S1的最低振動能級回到S0的各振動能級，并以光子的形式釋放能量，即發(fā)射熒光FRET產(chǎn)生的條件D、A都能發(fā)熒光D的發(fā)射光譜和A的激發(fā)（或吸收）光譜必須有部分重疊D和A之間的距離必須小于10nm。FRET

的基本原理檢測活細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子是否直接相互作用如果兩個蛋白相互作用，其中一個蛋白激發(fā)后發(fā)出的熒光可激發(fā)另一蛋白產(chǎn)生熒光兩個蛋白未相互作用相互作用五、放射自顯影技術(shù)利用放射性同位素的電離射線對乳膠(含AgBr或AgCl)的感光作用，對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究兩個主要步驟：即同位素標(biāo)記的生物大分子前體的摻入和細(xì)胞內(nèi)同位素的顯示根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的同位素研究DNA合成時通常用氚（3H）標(biāo)記的3H-TdR研究RNA合成用3H-U在研究含硫蛋白分子代謝時，用35S標(biāo)記的蛋氨酸和半胱氨酸對細(xì)胞或生物體內(nèi)生物大分子動態(tài)研究和追蹤：持續(xù)標(biāo)記、脈沖標(biāo)記顯微放射自顯影電鏡放射自顯影胰島B細(xì)胞電鏡放射自顯影結(jié)果3H-亮氨酸脈沖標(biāo)記完成10分鐘后，被標(biāo)記的胰島素蛋白（黑色銀顆粒）從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入高爾基復(fù)合體中3H-亮氨酸脈沖標(biāo)記完成45分鐘后，被標(biāo)記的胰島素蛋白進(jìn)入分泌顆粒內(nèi)第五節(jié)模式生物與功能基因組的研究Figure1-44MolecularBiologyoftheCell,FifthEdition(?GarlandScience2008)一、細(xì)胞生物學(xué)研究常用的模式生物模式生物通常個體較小，容易培養(yǎng)，操作簡單，生長繁殖快由于基因在進(jìn)化上的保守性以及遺傳密碼的通用性，從一種實(shí)驗(yàn)生物得到的有關(guān)基因性質(zhì)或功能方面的信息往往也適用于其他生物Whydoweneedmodelsystems?AllcellsaredescendedfromacommonancestorSimplesystemstostudyabiologicalquestionExtrapolate（外推）resultstohigherorganismsAdvantageouscharacteristicsfoundinmodelor