第八章微生物遺傳

第八章微生物遺傳第一節(jié)遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子第三節(jié)誘發(fā)突變——Ams實(shí)驗(yàn)第四節(jié)微生物育種一.DNA作為遺傳物質(zhì)1.Griffith的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（1928年）2.3.二.RNA作為遺傳物質(zhì)一.質(zhì)粒

一種獨(dú)立于染色體外，能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細(xì)胞中。質(zhì)粒分子的大小范圍從1kb左右到1000kb（細(xì)菌質(zhì)粒多在10kb以內(nèi)）。1.質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)通常以共價閉合環(huán)狀(covalentlyclosedcircle，簡稱CCC)的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒。2.質(zhì)粒的分離堿提取法：①菌體的培養(yǎng)和收集：一般采用豐富培養(yǎng)基對菌體進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長到指數(shù)期后期時，離心收集細(xì)胞。②溶菌：一般用溶菌酶去壁以形成原生質(zhì)體或原生質(zhì)球。③堿變性處理：在SDS等表面活性劑存在下加NaOH液使pH升至12.4，可使菌體蛋白質(zhì)、染色體DNA以及質(zhì)粒DNA變性。④質(zhì)粒復(fù)性：加入pH4.8的KAc-HAc緩沖液，將提取液調(diào)至中性，由于質(zhì)粒分子量小而容易復(fù)性，并穩(wěn)定存在于溶液中；染色體DNA分子量太大，在復(fù)性過程中形成DNA之間的交聯(lián)導(dǎo)致其形成更大分子的不溶性物質(zhì)。⑤離心分離：經(jīng)高速離心可以使細(xì)胞碎片和已變性的菌體蛋白及染色體DNA一起沉淀3.質(zhì)粒的特性（1）位于核基因組外，以cccDNA方式存在；（2）有的質(zhì)?？烧系胶巳旧w上；（3）可重組（質(zhì)粒與質(zhì)粒間，質(zhì)粒與染色體間）；（4）人為消除（高溫、丫叮類，UV，電離輻射，利福平等）；（5）有的質(zhì)?？稍诩?xì)胞間轉(zhuǎn)移（F因子，R因子）（6）質(zhì)粒具有不親和性質(zhì)粒的不親和性（plasmidincompatibility），

有時也稱為不相容性，是指在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一個寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。在細(xì)胞的增殖過程中，其中必有一種會被逐漸地排斥（稀釋）掉。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒。4.質(zhì)粒的主要類型根據(jù)質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)分類:致育因子（Fertilityfactor，F(xiàn)因子）抗性質(zhì)粒（Resistancefactor，R因子）產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性質(zhì)粒（virulenceplasmid）代謝質(zhì)粒（Metabolicplasmid）隱秘質(zhì)粒（crypticplasmid）(1)致育因子(Fertilityfactor，F(xiàn)因子)又稱F質(zhì)粒，其大小約100kb，這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象（接合作用）有關(guān)的質(zhì)粒。攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株（相當(dāng)于雄性），無F質(zhì)粒的菌株稱為F-菌株（相當(dāng)于雌性）。F因子能以游離狀態(tài)(F+)和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細(xì)胞中，所以又稱之為附加體(episome)。在志賀氏菌屬（Shigella）、沙門氏菌屬（Salmonella）和鏈球菌屬（Streptococcus）等其他細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了與大腸桿菌類似的致育因子。在放線菌中，天藍(lán)色鏈霉菌含有SCP1和SCP2兩種致育質(zhì)粒，這兩種質(zhì)粒在天藍(lán)色鏈霉菌的接合過程中起重要作用，帶動染色體從供體細(xì)胞向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移。(2)抗性因子（Resistancefactor，R因子）包括抗藥性和抗重金屬二大類，簡稱R質(zhì)粒。R100質(zhì)粒(89kb)可使宿主對下列藥物及重金屬具有抗性：汞（mercuricion，mer）四環(huán)素（tetracycline，tet）鏈霉素(Streptomycin,str)、磺胺(Sulfonamide,sul)、氯霉素(Chlorampenicol,cml)夫西地酸（fusidicacid，fus）負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質(zhì)粒上?？剐再|(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。有的質(zhì)?？蓴y帶多達(dá)10種抗生素的基因?？剐再|(zhì)粒可以在關(guān)系相近或關(guān)系疏遠(yuǎn)的菌種間轉(zhuǎn)移。(3)Col質(zhì)粒：產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒（Bacteriocinproductionplasmid）細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因、涉及細(xì)菌素運(yùn)輸及發(fā)揮作用（processing）的蛋白質(zhì)的基因、賦予宿主對該細(xì)菌素具有“免疫力”的相關(guān)產(chǎn)物的基因一般都位于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上，因此，細(xì)菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株。細(xì)菌素：許多細(xì)菌都能產(chǎn)生某些代謝產(chǎn)物，抑制或殺死其他近緣細(xì)菌或同種不同菌株，因?yàn)檫@些代謝產(chǎn)物是由質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)，不象抗生素那樣具有很廣的殺菌譜，所以稱為細(xì)菌素（bacteriiocin）細(xì)菌素種類很多,一般根據(jù)產(chǎn)生菌的種類進(jìn)行命名：大腸桿菌（E.coli）產(chǎn)生的細(xì)菌素為colicins（大腸桿菌素），而質(zhì)粒被稱為Col質(zhì)粒。此外還有枯草桿菌素、乳酸菌素、根瘤菌素等。由G+細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素或與細(xì)菌素類似的因子與colicins有所不同，但通常也是由質(zhì)?；蚓幋a，有些甚至有商業(yè)價值，例如一種乳酸細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌素NisinA能強(qiáng)烈抑制某些G+細(xì)菌的生長，而被用于食品工業(yè)的保藏。大腸桿菌素產(chǎn)自大腸桿菌的一種蛋白質(zhì)，具有專一性地殺死其親緣關(guān)系很近的、不具Col質(zhì)粒的其它腸道細(xì)菌的功能。(4)毒性質(zhì)粒（virulenceplasmid）許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的，這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因，其產(chǎn)物對宿主（動物、植物）造成傷害。產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動物腹瀉的主要病原菌之一，其中許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質(zhì)粒。蘇云金桿菌含有編碼δ內(nèi)毒素(伴孢晶體中)的質(zhì)粒根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子(5)

代謝質(zhì)粒（Metabolicplasmid）

質(zhì)粒上攜帶有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基質(zhì)的酶，進(jìn)行共生固氮，或產(chǎn)生抗生素（某些放線菌）等。降解質(zhì)粒：能將復(fù)雜的有機(jī)化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單形式，環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。如TOL質(zhì)粒：含分解甲苯的基因；CAM-OCT質(zhì)粒：含分解樟腦辛烷的基因假單胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、農(nóng)藥(二氯苯氧基乙酸)、辛烷和樟腦等的能力。根據(jù)拷貝數(shù)或復(fù)制特點(diǎn)，質(zhì)粒可分為：高拷貝數(shù)(highcopynumber)質(zhì)粒（每個細(xì)胞中可以有10~100個拷貝,其復(fù)制和染色體的復(fù)制不同步）如ColE1、ColE2等

———————松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid)低拷貝數(shù)(lowcopynumber)質(zhì)粒（每個細(xì)胞中只有1~2個拷貝,其復(fù)制行為與染色體的復(fù)制同步）如F因子，R100

———————嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒(stringentplasmid)窄宿主范圍質(zhì)粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一種特定的宿主細(xì)胞中復(fù)制）廣宿主范圍質(zhì)粒(broadhostrangeplasmid)（可以在許多種細(xì)菌中復(fù)制）二.轉(zhuǎn)座因子細(xì)胞中能改變自身位置的一段DNA稱為轉(zhuǎn)座因子。原核生物的轉(zhuǎn)座因子包括插入序列、轉(zhuǎn)座子和某些特殊病毒。（一）轉(zhuǎn)座因子的種類

1.插入序列（insertionsequence）IRTransposaseGeneIR①二個分離的反向末端重復(fù)序列

(invertedterminalrepeats,ITR)②一個轉(zhuǎn)座酶（transposase)編碼基因2.轉(zhuǎn)座子①復(fù)合轉(zhuǎn)座子——Ⅰ類轉(zhuǎn)座子由IS類轉(zhuǎn)座組件構(gòu)成的復(fù)合體。組成：兩端為IS，中間編碼抗生素物質(zhì)②復(fù)雜轉(zhuǎn)座子——Ⅱ類轉(zhuǎn)座子（TnA家族）

攜帶轉(zhuǎn)座和耐藥等基因的獨(dú)立體家族。組成：兩端為ITR，而不是IS，中間編碼區(qū)含轉(zhuǎn)座酶編碼基因，及抗生素抗性和解離酶等編碼基因。IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉(zhuǎn)座因子的遺傳學(xué)效應(yīng)1.插入突變插到某一基因中，導(dǎo)致該基因突變插到操縱子前半段，引起極性突變插入抗性基因引起抗性突變2.染色體畸變3.基因的移動和重排一.誘發(fā)突變

自發(fā)突變的頻率是很低的，一般為10－6-10-10。許多化學(xué)、物理和生物因子能夠提高其突變頻率，將這些能使突變頻率提高到自發(fā)突變水平以上的物理、化學(xué)和生物因子稱為誘變劑。

已知的化學(xué)致變劑和物理致變劑

物理致變劑

致變劑

電離輻射、紫外輻射等

化學(xué)致變劑脫氨劑、烷化劑、

大型加合物供體、堿基類似物、 插入劑、交聯(lián)劑。誘變劑導(dǎo)致表型改變——營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)誘變處理后，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基上生長，這類突變菌株就是營養(yǎng)缺陷型。基本培養(yǎng)基：僅能滿足野生型菌株生長需要的最低成分組合的培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基：可滿足營養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的培養(yǎng)基。二.誘變劑與致癌物——Ames試驗(yàn)埃姆斯實(shí)驗(yàn)1.鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型2.基本培養(yǎng)基3.鼠肝勻漿4.可疑“三致”樣品實(shí)驗(yàn)步驟1.用基本培養(yǎng)基到平板2.將鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型培養(yǎng)液涂在平板上3.將“三致”樣品和鼠肝勻漿混合吸附在濾紙片上，放在平板中央。4.培養(yǎng)2天后看結(jié)果。陽性結(jié)果陰性結(jié)果誘變育種：是用物理或化學(xué)的誘變劑使誘變對象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

誘變育種的實(shí)踐意義：當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。

1.選擇選擇合適的出發(fā)菌株2.制備待處理的菌懸液3.誘變處理4.篩選5.保藏和擴(kuò)大試驗(yàn)誘變育種的基本過程出發(fā)菌株———用來育種處理的起始菌株

出發(fā)菌株應(yīng)具備：

①對誘變劑的敏感性高；

②具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力；

出發(fā)菌株的來源；

①自然界直接分離到的野生型菌株：

②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌株：

③已經(jīng)歷多次育種處理的菌株。1.出發(fā)菌株的選擇要求：

①菌體處于對數(shù)生長期

②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞

方法：

①玻璃珠打散10-15min;

②加０.3%吐溫80（表面活性劑）

③用無菌脫脂棉過濾。

制備：

物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學(xué)誘變劑——緩沖液

濃度：

細(xì)菌、放線菌108個/ml，霉菌、酵母菌106個/ml2.制備細(xì)胞懸液選擇合適的誘變劑量：

不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。—致死率是最好的誘變劑相對劑量的表示方法。最適劑量的選擇：

產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在70～80%）。3.誘變處理選擇誘變劑的種類：在同樣效果下，應(yīng)選用最方便的因素；在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇最高效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG。。一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞，然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經(jīng)培養(yǎng)后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，分別制成懸浮液，然后將其涂在一般平板表面使長出許多單菌落，最后可用影印培養(yǎng)法或逐個檢出法選出突變種。（1）篩選方案：初篩：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)；——因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡單。復(fù)篩：確認(rèn)符合要求的菌株；——復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟.4.菌種篩選①溫度敏感突變株篩選方法：影印法用途：常用于提高代謝物產(chǎn)量原因：是由于某一酶蛋白結(jié)構(gòu)改變后，在高溫下活力喪失（2）突變株篩選舉例由谷氨酸產(chǎn)生菌乳糖發(fā)酵短桿菌